O processo inflamatório pode ser iniciado pela presença de patógenos (PAMPs) ou de moléculas associadas ao dano tecidual (DAMPs), estes sinais são reconhecidos por células do sistema imune via receptores de reconhecimento de padrão localizados na membrana ou no citoplasma destas células. A ativação da família de receptores intracitoplasmáticos do tipo NOD (NLR) pode levar à formação de complexos proteicos denominados inflamassomas, entre eles, o inflamassoma NLRP3, formado por três estruturas básicas: receptores do tipo NOD, proteína adaptadora (ASC) e pró-caspase 1. Essas caspases ativas são capazes de induzir a maturação proteolítica de interleucina-1 beta (IL-1b) e IL-18, que então são liberadas para o meio extracelular. É sabido que a hipertensão é uma doença inflamatória associada à presença de DAMPs em regiões de controle da pressão arterial, como o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) bem como, que o treinamento aeróbio é uma conduta eficaz em reverter muitos dos efeitos deletérios da hipertensão. Desta forma, é nossa hipótese de trabalho que inflamassomas NLRP3 possam estar ativados na hipertensão e que o treinamento aeróbio corrija muitos déficits do controle cardiovascular por modular a resposta imune inata. Em ratos machos adultos Wistar Kyoto e ratos espontaneamente hipertensos (SHR), foram feitas análises de parâmetros cardiovasculares, além da expressão gênica dos constituintes do inflamassoma e citocinas, e proteica de citocinas no PVN de animais sedentários ou treinados por quatro semanas de ambas as linhagens. Nossos resultados mostram que animais hipertensos se caracterizam por valores aumentados de pressão arterial e frequência cardíaca de repouso, associados à disfunção autonômica ao coração e vasos. SHR apresentam inflamação no PVN, o que foi evidenciado pelo elevado perfil de expressão dos constituintes da via do inflamassoma NLRP3, TLR-4 e citocinas pró-inflamatórias. O treinamento aeróbio de baixa a moderada intensidade reduziu a expressão gênica desses parâmetros e proteica de citocinas pró-inflamatórias, bem como a disfunção autonômica, além de determinar a instalação da bradicardia de repouso. Nossos dados sugerem que a elevada expressão de citocinas pró-inflamatórias no PVN de SHR seja devido à ativação do inflamassoma NLRP3, numa via dependente de TLR-4. Nosso trabalho é o primeiro a investigar o papel de inflamassomas em regiões autonômicas em hipertensos, bem como o efeito do treinamento físico sobre este perfil inflamatório. / The inflammatory process can be triggered by the presence of pathogens (PAMPs) or damaged-associated molecules pattern (DAMPs), this danger signals are recognized by immune system via pattern recognition receptors (PRR) in membrane or in the cytoplasm cells. The activation of NOD like receptors in the cytoplasm can trigger the formation of protein complex called inflammasomes, such as the NLRP3 inflammasome, which is comprised of three basics structures: NOD like receptor, adaptor protein and pro-caspase-1. This complex can induce the proteolytic maturation of pro-inflammatory cytokines (PICs), like interleukin 1 beta (IL-1b) and IL18, which are then released into the extracellular medium. It is known that hypertension is an inflammatory disease associated with DAMPs in blood pressure controlling areas in hypothalamus, like paraventricular nucleus (PVN) and that aerobic training can reverse the deleterious effects of hypertension. So, is our hypothesis that NLRP3 inflammasomes can be active in hypertension and that the exercise training restored the cardiovascular deficits by modulate the innate response. In adult male rats Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats (SHR), cardiovascular parameters, gene expression of inflammasomes members or cytokines and cytokines protein contents were measured in the PVN of sedentary or four weeks trained groups from both lineages. Our results show that hypertensive animals are characterized by enhanced blood pressure and resting heart rate values, associated with autonomic dysfunction to heart e vessels. SHR had PVN inflammation, what is evidenced by the enhanced inflammasome NLRP3, TLR-4 and PICs expression in this area. The aerobic training with low or moderate intensity reduce the gene expression of these parameters and the protein expression of PICs, as well as, the autonomic dysfunction, in addition to determining the installation of resting bradycardia. Our data suggest that the elevated expression of PICs in SHR PVN is due to the activation of NLRP3 inflammasomes, in a TLR-4 dependent pathway. Our work is the first to investigate the role of inflammasomes in autonomic brain areas in hypertensive rats, as well as, the effect of exercise training on this inflammatory profile.

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gravidez, associada com inflamação sistêmica exacerbada, o que poderia ser dependente da deficiência de fatores reguladores, como a silibinina (SB), progesterona (PG) e vitamina D (VD), que são capazes de modular essa resposta inflamatória. O objetivo do trabalho foi avaliar, in vitro, o efeito modulador da SB, PG e VD sobre os inflamassomas NLRP1 e NLRP3 e sobre a via de sinalização dependente de TLR4-MyD88 em monócitos de gestantes portadoras de PE e em linhagem celular de monócitos humanos THP-1. Monócitos obtidos do sangue periférico de 20 gestantes com PE, 20 gestantes normotensas e células THP-1 foram cultivados na presença ou ausência de urato monossódico (MSU), hialurona (HA), SB, PG ou VD por diferentes períodos: a) por 30 min para determinação da fosforilação de NF-κB e para expressão dos fatores intra-citoplasmáticos NF-κB e IκBα por citometria de fluxo, b) por 4h para a expressão gênica de TLR4, MYD88, NFKB1, NLRP1, NLRP3, CASP1, IL1B, IL18, TNF e IL10 analisada por RT-qPCR e c) por 18h para a determinação da concentração das citocinas IL-1β, IL-18, TNF-α e IL-10 por ELISA e para expressão do receptor de superfície TLR4 por citometria de fluxo. Foram determinados os níveis plasmáticos de ácido úrico, PG e VD em gestantes pré-eclâmpticas e normotensas. Os resultados foram analisados por meio de testes paramétricos e não-paramétricos com nível de significância de 5%. Os níveis plasmáticos de PG e VD foram significati... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Preeclampsia (PE) is a specific pregnancy syndrome, associated with exacerbated systemic inflammation, which could be dependent on the deficiency of regulatory factors, such as silibinin (SB), progesterone (PG), and vitamin D (VD), which are able to modulate this inflammatory response. The aim of this study was to evaluate the modulating effect of SB, PG and VD on the NLRP1 and NLRP3 inflammasomes and on the TLR4-MyD88-dependent signaling pathway in monocytes from pregnant women with PE and human monocyte cell line THP-1. Monocytes obtained from the peripheral blood of 20 pregnant women with PE, 20 normotensive pregnant women and THP-1 cells were cultured in the presence or absence of monosodium urate (MSU), hyaluronan (HA), SB, PG or VD for different periods: a) for 30 min for the determination of NF-κB phosphorylation and for the expression of the intra-cytoplasmic factors NF-κB and IκBα by flow cytometry, b) for 4 h for the gene expression of TLR4, MYD88, NFKB1, NLRP1, NLRP3, CASP1, IL1B, IL18, TNF and IL10, analyzed by qPCR and c) for 18h for the determination of IL-1β, IL-18, TNF-α and IL-10 cytokines concentration by ELISA and for expression of the surface receptor TLR4 by flow cytometry. Plasma levels of uric acid, PG and VD in preeclamptic and normotensive pregnant women were determined. The results were analyzed using parametric and non-parametric tests with a significance level of 5%. Plasma levels of PG and VD were significantly lower, whereas those of uric acid we... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A flagelina é um agonista natural do sensor TLR5 e do inflamassoma NAIP/NLRC4 que é responsável pela secreção de IL-1β e IL-18 e pela indução de morte celular necrótica, via ativação da caspase-1. Entretanto, nós observamos que a inserção da flagelina de B. subtilis no citosol celular por meio de vesículas lipídicas, induz um processo atípico de morte nos macrófagos peritoneais (PMs) deficientes em NLRC4, ASC e caspase-1/11. A morte dos PMs manteve seu resultado antimicrobiano, sendo acompanhada da liberação de IL-1α. A morte celular e a secreção das citocinas IL-1α e IL-1β, foi mediada por catepsinas lisossomais, sugerindo uma cooperação entre a via lisossomal e os inflamassomas nas respostas induzidas pela flagelina. Além disso, a flagelina de S. typhimurium foi capaz de induzir dano lisossomal e secreção de IL-1α e IL-1β mediada pelo eixo caspase-catepsinas, na ausência de carreadores, e estas citocinas tiveram um impacto na imunidade adaptativa induzida pela flagelina, no modelo de ativação de linfócitos T específicos por células dendríticas, in vitro. / Flagellin is a natural agonist of TLR5 and NAIP/NLRC4 inflammasome that is responsible for IL-1β and IL-18 secretion and for the induction of a necrotic cell death, both mediated by caspase-1. However, we observed that flagellin from B. subtilis inserted into lipid vesicles, induced an atypical cell death in peritoneal macrophages (PMs) in the absence of NLRC4, ASC and caspase-1/11. This inflammasome-independent cell death retained its antimicrobial outcome, being accompanied with IL-1α secretion. Importantly, cell death and caspase-1-dependent IL-1α and IL-1β secretion were regulated by lysosomal cathepsins, suggesting a cooperation between the inflammasome and lysosomal pathway in response to flagellin. We also observed that flagellin from S. typhimurium is able to induce lysosomal damage and IL-1α and IL-1β secretion by PMs in the absence of a carrier, through a caspase-catepsins-dependent manner, and that cytokines were important to the ability of flagellin in to induce adaptive immune response by antigen-specific T cells.

O reconhecimento da flagelina é compartilhado pelo receptor transmembrânico TLR5 e citosólico NAIP5/NLRC4. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos efetores individuais induzidos a partir do reconhecimento extra e intracelular da flagelina. Aqui, nós demonstramos que macrófagos estimulados com a flagelina citosólica (FLA-BSDot) induziu a expressão de iNOS, enzima responsável pela produção do óxido nítrico (NO). A expressão de iNOS foi dependente do eixo NAIP5/NLRC4/caspase-1 e independente de IL-1β, IL-18 e MyD88, descartando a via de ativação dos TLRs. Ainda, esta via não requer a ativação do fator de transcrição IRF-1, mas envolve a ativação do NF-kB, assim como a clivagem da enzima PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Por fim, avaliamos a relevância biológica desta via no controle das infecções por L. pneumophila e S. Typhimurium, dados que definem um mecanismo efetor adicional no controle de patógenos. / Recognition of flagellin is shared by transmembranic TLR5 and cytosolic NAIP5/NLRC4. However, little is known about the individual effector mechanisms induced by extra and intracellular flagellin. Here, we have demonstrated that cytosolic flagellin-stimulated macrophages (FLA-BSDot) induced iNOS expression, an enzyme responsible for the production of nitric oxide (NO). iNOS expression was dependent of the NAIP5/NLRC4/caspase-1 axis and independent of IL-1β, IL-18 and MyD88, discarding TLRs signaling pathway. Still, this pathway do not require the activation of IRF-1 transcriptional factor, but involves NF-kB activation as well as the cleavage of the enzyme, PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Finally, we have evaluated the biological relevance of this pathway in the control of the infections by L. pneumophila e S. Typhimurium, which define an additional effector mechanism to the control of pathogens.

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

Orientador: Alexandrina Sartori / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por Leishmania donovani na Índia e África ou Leishmania infantum na Europa e América Latina. O desenvolvimento de resposta imune eficaz e subsequente eliminação destes patógenos, requer o reconhecimento inicial da Leishmania, o qual é intermediado por receptores de reconhecimento padrão expressos por células da imunidade inata, entre eles os receptores de ligação a nucleotídeo (NLRs). Alguns NLRs ativam uma plataforma de proteínas, os inflamassomas, responsáveis pela ativação da caspase-1 e maturação de IL-1β e IL-18 e outra classe de NLRs, chamada NODs, ativam vias que culminam na ativação de NF-κB e produção de mediadores inflamatórios. O envolvimento desses receptores na LV ainda é pouco elucidado. Mesmo diante dos mecanismos de defesa do hospedeiro, esses parasitas conseguem sobreviver dentro dos macrófagos utilizando várias estratégias para escapar da resposta imune. Para um melhor entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na LV, caracterizamos o perfil transcricional e a formação de inflamassomas e NODsomas de células THP-1 infectadas com L. infantum. Os resultados mostram que a L. infantum não induziu produção de TNF-α, IL-6 e IL-1β e nem ativação de caspase-1 após 8, 24 e 48 horas de infecção. Além disso, a infecção resultou em padrão de expressão gênica similar às células sem estímulo e distinto de células estimuladas com LPS, indicando que os parasitas entram nas células de forma mais silenciosa. Ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected infectious disease caused by Leishmania donovani in India and Africa or Leishmania infantum in Europe and Latin America. The development of an effective immune response and subsequent elimination of these pathogens requires the initial recognition of the Leishmania that is mediated by pattern recognition receptors expressed in innate immunity cells, such as nucleotide-binding receptors (NLRs). Some NLRs activate a multiprotein platform named inflammasomes, responsible for the activation of caspase-1 and consequent maturation of IL-1β and IL-18; and another class of NLRs, the NODs, activate pathways that trigger NF-κB activation and production of inflammatory mediators. The involvement of NLRs in LV is poorly elucidated. Even in the presence of host defense mechanisms, these parasites can survive within the macrophages by employing successful strategies to escape from immune response. For a better understanding of the immune mechanisms involved in LV, we characterized the transcriptomic profiling and assembly of inflammasomes and NODsomas during infection with L. infantum in THP-1 cells. The results show that L. infantum did not induce the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β nor activation of caspase-1 after 8, 24 and 48 hours of infection. In addition, the infection resulted in a pattern of gene expression similar to the non-stimulated cells and distinct from LPS-stimulated cells, indicating that the parasites enter inside cells in a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Mariana Gatto (marianagatto11@hotmail.com) on 2018-05-21T17:47:50Z No. of bitstreams: 1 Tese Mariana Gatto.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por Leishmania donovani na Índia e África ou Leishmania infantum na Europa e América Latina. O desenvolvimento de resposta imune eficaz e subsequente eliminação destes patógenos, requer o reconhecimento inicial da Leishmania, o qual é intermediado por receptores de reconhecimento padrão expressos por células da imunidade inata, entre eles os receptores de ligação a nucleotídeo (NLRs). Alguns NLRs ativam uma plataforma de proteínas, os inflamassomas, responsáveis pela ativação da caspase-1 e maturação de IL-1β e IL-18 e outra classe de NLRs, chamada NODs, ativam vias que culminam na ativação de NF-κB e produção de mediadores inflamatórios. O envolvimento desses receptores na LV ainda é pouco elucidado. Mesmo diante dos mecanismos de defesa do hospedeiro, esses parasitas conseguem sobreviver dentro dos macrófagos utilizando várias estratégias para escapar da resposta imune. Para um melhor entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na LV, caracterizamos o perfil transcricional e a formação de inflamassomas e NODsomas de células THP-1 infectadas com L. infantum. Os resultados mostram que a L. infantum não induziu produção de TNF-α, IL-6 e IL-1β e nem ativação de caspase-1 após 8, 24 e 48 horas de infecção. Além disso, a infecção resultou em padrão de expressão gênica similar às células sem estímulo e distinto de células estimuladas com LPS, indicando que os parasitas entram nas células de forma mais silenciosa. Após a infecção houve aumento da expressão de alguns genes como ACTG1, ACTB, CD36 e DUSPs relacionados com vias de motilidade celular e regulação de MAPKs. Os genes CSF1 e CDC20 foram dois dos 30 mais expressos após infecção e estão relacionados com ciclo celular e diferenciação de macrófagos para um perfil anti-inflamatório. O gene GBP1, associado com ativação de inflamassomas, foi sub expresso após a infecção. Além disso, infecção com L. infantum resultou na expressão de poucos genes relacionados com a via dos NLRs, destacando-se entre esses o TNFAIP3 e IL1RN, referentes à modulação negativa dessa via. Os resultados obtidos indicam que a L. infantum entra nas células THP-1 de forma mais silenciosa, desativa vias inflamatórias, entre essas a via de receptores NLRs e evita a montagem de uma resposta imunológica efetora. Provavelmente o parasita usa esses recursos como mecanismos adicionais de escape para garantir sua sobrevivência dentro das células. / Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected infectious disease caused by Leishmania donovani in India and Africa or Leishmania infantum in Europe and Latin America. The development of an effective immune response and subsequent elimination of these pathogens requires the initial recognition of the Leishmania that is mediated by pattern recognition receptors expressed in innate immunity cells, such as nucleotide-binding receptors (NLRs). Some NLRs activate a multiprotein platform named inflammasomes, responsible for the activation of caspase-1 and consequent maturation of IL-1β and IL-18; and another class of NLRs, the NODs, activate pathways that trigger NF-κB activation and production of inflammatory mediators. The involvement of NLRs in LV is poorly elucidated. Even in the presence of host defense mechanisms, these parasites can survive within the macrophages by employing successful strategies to escape from immune response. For a better understanding of the immune mechanisms involved in LV, we characterized the transcriptomic profiling and assembly of inflammasomes and NODsomas during infection with L. infantum in THP-1 cells. The results show that L. infantum did not induce the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β nor activation of caspase-1 after 8, 24 and 48 hours of infection. In addition, the infection resulted in a pattern of gene expression similar to the non-stimulated cells and distinct from LPS-stimulated cells, indicating that the parasites enter inside cells in a more silent way. After infection, there was increased expression of some genes, such as ACTG1, ACTB, CD36 and DUSPs related to cellular motility and regulation of MAPKs pathways. The CSF1 and CDC20 genes were two of the 30 most expressed after infection and were related to cell cycle pathway and macrophage differentiation to an anti-inflammatory profile. The GBP1 gene, associated with inflammasome activation, was downregulated after infection. In addition, infection with L. infantum resulted in the expression of few genes related to the NLRs pathway, such as TNFAIP3 and IL1RN that are related to down modulation of this pathway. The results indicate that L. infantum enters inside the THP-1 cells more quietly, deactivates inflammatory pathways, including the NLR receptor pathway, and avoids the assembly of an effector immune response. Probably the parasite uses these strategies as additional escape mechanism to ensure its survival within host cells.

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. / Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

A flagelina é um agonista natural do sensor TLR5 e do inflamassoma NAIP/NLRC4 que é responsável pela secreção de IL-1β e IL-18 e pela indução de morte celular necrótica, via ativação da caspase-1. Entretanto, nós observamos que a inserção da flagelina de B. subtilis no citosol celular por meio de vesículas lipídicas, induz um processo atípico de morte nos macrófagos peritoneais (PMs) deficientes em NLRC4, ASC e caspase-1/11. A morte dos PMs manteve seu resultado antimicrobiano, sendo acompanhada da liberação de IL-1α. A morte celular e a secreção das citocinas IL-1α e IL-1β, foi mediada por catepsinas lisossomais, sugerindo uma cooperação entre a via lisossomal e os inflamassomas nas respostas induzidas pela flagelina. Além disso, a flagelina de S. typhimurium foi capaz de induzir dano lisossomal e secreção de IL-1α e IL-1β mediada pelo eixo caspase-catepsinas, na ausência de carreadores, e estas citocinas tiveram um impacto na imunidade adaptativa induzida pela flagelina, no modelo de ativação de linfócitos T específicos por células dendríticas, in vitro. / Flagellin is a natural agonist of TLR5 and NAIP/NLRC4 inflammasome that is responsible for IL-1β and IL-18 secretion and for the induction of a necrotic cell death, both mediated by caspase-1. However, we observed that flagellin from B. subtilis inserted into lipid vesicles, induced an atypical cell death in peritoneal macrophages (PMs) in the absence of NLRC4, ASC and caspase-1/11. This inflammasome-independent cell death retained its antimicrobial outcome, being accompanied with IL-1α secretion. Importantly, cell death and caspase-1-dependent IL-1α and IL-1β secretion were regulated by lysosomal cathepsins, suggesting a cooperation between the inflammasome and lysosomal pathway in response to flagellin. We also observed that flagellin from S. typhimurium is able to induce lysosomal damage and IL-1α and IL-1β secretion by PMs in the absence of a carrier, through a caspase-catepsins-dependent manner, and that cytokines were important to the ability of flagellin in to induce adaptive immune response by antigen-specific T cells.

O reconhecimento da flagelina é compartilhado pelo receptor transmembrânico TLR5 e citosólico NAIP5/NLRC4. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos efetores individuais induzidos a partir do reconhecimento extra e intracelular da flagelina. Aqui, nós demonstramos que macrófagos estimulados com a flagelina citosólica (FLA-BSDot) induziu a expressão de iNOS, enzima responsável pela produção do óxido nítrico (NO). A expressão de iNOS foi dependente do eixo NAIP5/NLRC4/caspase-1 e independente de IL-1β, IL-18 e MyD88, descartando a via de ativação dos TLRs. Ainda, esta via não requer a ativação do fator de transcrição IRF-1, mas envolve a ativação do NF-kB, assim como a clivagem da enzima PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Por fim, avaliamos a relevância biológica desta via no controle das infecções por L. pneumophila e S. Typhimurium, dados que definem um mecanismo efetor adicional no controle de patógenos. / Recognition of flagellin is shared by transmembranic TLR5 and cytosolic NAIP5/NLRC4. However, little is known about the individual effector mechanisms induced by extra and intracellular flagellin. Here, we have demonstrated that cytosolic flagellin-stimulated macrophages (FLA-BSDot) induced iNOS expression, an enzyme responsible for the production of nitric oxide (NO). iNOS expression was dependent of the NAIP5/NLRC4/caspase-1 axis and independent of IL-1β, IL-18 and MyD88, discarding TLRs signaling pathway. Still, this pathway do not require the activation of IRF-1 transcriptional factor, but involves NF-kB activation as well as the cleavage of the enzyme, PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Finally, we have evaluated the biological relevance of this pathway in the control of the infections by L. pneumophila e S. Typhimurium, which define an additional effector mechanism to the control of pathogens.