Optimiser le diagnostic paraclinique prédictif et non invasif du déficit en cellules souches limbiques (DCSL) : in vitro après empreinte cytologique (EC) par la recherche immunohistochimique (IH) de marqueurs pertinents et par reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), technique de haute sensibilité ; in vivo par microscopie confocale (MCIV). Matériel et Méthodes: La preuve diagnostique de DCSL est la présence de cellules conjonctivales au sein de la cornée, la persistance de cellules cornéennes signant un DCSL partiel. L'EC a été standardisée. La spécificité de chacun des marqueurs cornéens ou conjonctivaux sélectionnés a été recherchée sur des tissus normaux avant d'aborder une étude prospective monocentrique, sur 22 yeux de 18 patients cliniquement suspects de DCSL. Les cellules épithéliales de la cornée centrale étaient recueillies par EC puis transférées sur lame. L'expression des marqueurs de différentiation conjonctivale (K7, K13, K19, MUC5AC) et cornéenne (K12) a été recherchée par IH sur les 22 EC et celle de la MUC5AC par RT-PCR sur 4 d'entre elles. Enfin, la cornée et le limbe de 7 patients ont étés analysés par MCIV. La concordance entre les techniques est évaluée. Conclusion: Ces techniques complémentaires dépendent de l'équipement du service et de l'accessibilité à un laboratoire compétent. Un organigramme décisionnel a été établi pour permettre de faire un diagnostic fiable de DCSL, les examens paracliniques étant inutiles dans certains cas. La recherche IH de kératines conjonctivales K7/K13 et/ou la détection de MUC5AC par RT-PCR sur cellules cornéennes recueillies par EC sont des techniques diagnostiques de haute valeur scientifique, tandis que l'IH K12/MUC5AC doit être abandonnée pour manque de sensibilité et celle de K3/K19 pour manque de spécificité. La MCIV, quand elle est réalisable, est une technique hautement sensible qui permet une quantification du degré de sévérité de la maladie avec une forte concordance avec les autres examens / Purpose: to optimize minimally invasive techniques for diagnosing limbal stem cell deficiency: in vitro after impression cytology (IC) by means of immunocytochemical detection of relevant markers and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT PCR), an highly sensitive method; in vivo by confocal microscopy (IVCM). Material and Methods: Presence of conjunctival cells in central cornea was diagnosis proof of LSCD, whereas corneal epithelial cells’ remaining traduces partial LSCD. IC was labeled. Corneal or conjunctival specificity of each marker was previously assessed on healthy tissues. In a prospective case control observational study, 22 eyes of 18 patients clinically suspected of LSCD were enrolled. Epithelial cells from central cornea were collected by IC. Conjunctival (K7, K13, K19, MUC5AC) and corneal (K12) differentiation markers were assessed by immunocytochemistry on each of 22 eyes and MUC5AC RT-PCR was assessed for 4 of them. Cornea and limbus of 7 eyes were assessed by IVCM. The inter-examination agreement was determined. Conclusion: These techniques require skilled technicians and laboratory facilities. We propose a decision tree model to provide unfailing LSCD diagnosis, complementary examinations being sometimes useless. Clinical examination can lead to LSCD misdiagnosis. Immunostaining of conjunctival keratins K7 and K13 as well as MUC5AC detection by RT-PCR are highly effective methods whereas MUC5AC/K12 immuno staining are not sensible and both K3 and K19 are not specific. IVCM of great sensitivity if realizable allows quantification of LSCD severity. Combining both methods provides in every case unfailing diagnosis of LSCD and evaluation of the extent of the disease with high agreement

Stem cell-based therapy represents a perspective approach for the treatment of many so far incurable diseases. Mesenchymal stem cells (MSC) are currently the most studied stem cells. They are able to differentiate into different cell types, to produce growth and trophic factors and can suppress the functions of cells of the immune system. During the study of the immunomodulatory properties of MSC, we focused on their effect on B cells. The mechanism of impact of interferon-γ (IFN-γ) on MSC and their effect on the production of interleukin 10 (IL-10) by B cells was analysed. We have demonstrated that MSC-treated with IFN-γ inhibit production of IL-10 by activated B cells via the cyclooxygenase-2 involving pathway. Due to their regenerative and immunomodulatory properties, MSC can be for treatment of many diseases. In this study we focused on the disease and damage of the eye. The limbal stem cells (LSC) are used for the treatment of damaged ocular surface, however their isolation is difficult and they can not be used in all cases of damage. Appropriate candidates in these cases are MSC. Therefore we have decided to compare the therapeutic potential of LSC and MSC isolated from bone marrow or adipose tissue. The study have shown that MSC isolated from bone marrow have a similar regenerative effect on...

P.Trošan Ph.D. Thesis Abstract Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a disease characterized by the deficiency of stem cells in the limbus, which are responsible for the homeostasis and renewal of the corneal epithelium. This disorder results in corneal neovascularization, chronical inflammation and opacification, which may lead to loss of vision. The most successful treatment is the transplantation of limbal tissue or cultured limbal epithelial cells (LECs) onto the damaged ocular surface. The human amniotic membrane (HAM) is used as the feeder of the LECs culture, as well as for the LSCD treatment. HAM is also widely used in clinical practice, particularly for the treatment of chronic wounds. This dissertation is particularly concerned on cell therapy for LSCD, on preparation of cells suitable for grafting onto the ocular surface, on the improvement of the LECs culture conditions, and on the preparation of appropriate carrier for the transfer of cells onto the damaged cornea. During my work I have used a wide spectrum of methods, e.g. cell cultures (LECs, mesenchymal stem, amniotic epithelial, conjunctival epithelial, goblet and 3T3 cells), immunohisto- and immunocytochemistry, microscopy, proliferation and colony forming assays, reverse transcription and quantitative real-time PCRs and statistical...

Certaines brûlures oculaires graves ou d'autres pathologies oculaires rares peuvent être associées à une perte totale de cellules souches épithéliales de la cornée (DCSL), ce qui conduit à une opacification de la cornée par invasion de la conjonctive. Lorsque la DCSL est totale et bilatérale, le limbe controlatéral n'est pas disponible pour la greffe de limbe autologue ou la culture de cellules souches autologues limbiques et la transplantation allogénique de la cornée est impossible car toujours rejetée en raison de la néovascularisation. Une thérapie innovante testée avec succès au sein de notre laboratoire, en collaboration avec le service d'ophtalmologie des HCL, consiste en une greffe autologue de Feuillet Epithélial (FE) dérivé de Muqueuse Orale (MO). Cette approche permet de restaurer la transparence et autorise, si nécessaire, une greffe cornéenne complémentaire. Cette technique a montré son efficacité lors d'un essai clinique conduit dans notre hôpital mais le dispositif breveté permettant le détachement non enzymatique des feuillets cultivés n'est plus disponible en Europe. Nous avons donc mis au point un nouveau procédé de production de FE dérivant de la MO dont la preuve de concept a été obtenue à partir d'études in-vitro et ex-vivo. En effet, un détachement avec 0,5 mg / mL de collagénase n'endommage pas le FE de MO et les protéines de la membrane basale, et, dans un modèle de stroma porcin exvivo, ces feuillets adhérents au stroma, continuent à se renouveler sous la forme d'épithélium différencié. De plus, dans le cas d'une opacité stromale associée à une DCSL, une greffe secondaire de cornée est nécessaire pour améliorer l'Acuité Visuelle (AV), c'est pourquoi nous avons cherché à développer pour ces patients à haut risque de rejet, un stroma décellularisé. Ce stroma pourrait également répondre à la pénurie de cornées dans les pays en voie de développement grâce à sa conservation longue et facile. La lyophilisation a été combinée à la décellularisation des cornées au SDS à 0,1 %, validée sur les cornées humaines sur le maintien de leur transparence et de l'ultrastructure du stroma associé à l'absence des antigènes HLA-ABC et HLA-DR. Enfin, dans un modèle de Kératoplastie Lamellaire Antérieure Profonde (KLAP) ex-vivo, nous avons montré que les cellules épithéliales et stromales de la cornée humaine receveuse colonise le stroma décellularisé. Ainsi, nos travaux permettent de proposer un traitement des DSCL totales et bilatérales associées ou non à une atteinte du stroma / Some severe ocular burns or other rare ocular pathologies may be associated with a complete loss of corneal epithelial stem cells (LSCD), leading to an opacification of the cornea by invasion of the conjunctiva. When DCSL is total and bilateral, contralateral limbus is not available for autologous limb transplant or limbal autologous stem cell culture, and allogeneic transplantation of the cornea is not an option since neovascularization is constantly responsible for graft rejection. An innovative therapy tested with success in our laboratory, in collaboration with the ophthalmology department of the HCL, consists in an autologous Epithelial Cell Sheet (ECS) graft derived from Oral Mucosa (MO). This approach restores transparency and allows in a second step a complementary corneal graft when necessary. This technique has been shown to be effective in a clinical trial conducted in our hospital, but the patented device for the non-enzymatic detachment of cultivated ECS is no longer available in Europe. We have therefore developed a new method for the production of ECS from OM, the proof of concept of which has been obtained from in-vitro and ex-vivo studies. Indeed, detachment with 0.5 mg / mL of collagenase does not damage ECS from OM and basement membrane proteins, and in an ex-vivo porcine stroma model, these cell sheets adhered on corneal stroma, continued to self-renew and generated a differentiated epithelium. Since stromal opacity associated with DCSL requires a secondary corneal graft to improve Visual Acuity (VA), we also sought to develop for these patients with high rejection risk, a new approach for the generation of decellularized stroma. Such a procedure for the production of decellularized stroma was also aimed at allowing a money-saving and reliable long-term storage for stromal grafts and thus circumventing the shortage of corneas in developing countries. Our process, combining lyophilization with decellularization of the corneas at 0.1 % SDS, was validated on human corneas regarding the maintenance of stroma transparency, the stromal ultrastructure associated with the absence of HLA-ABC and HLA-DR antigens. Finally, in an ex-vivo model of Deep Anterior Lamellar Keratoplasty (DALK), we have shown that the epithelial and stromal cells of the recipient human cornea colonized efficiently the decellularised stroma. Overall, our work makes it possible to propose a treatment for total and bilateral LSCD associated or not with lesions of the stroma

In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt und verglichen, um aus Corneoskleralringen langzeitorgankonservierter Hornhäute und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen Limbusepithel-Amnion-Transplantate herzustellen. Als erfolgreichste Kultivierungsmethode stellte sich hierbei signifikant die Explantat-Technik mit nach unten gerichtetem Limbusepithel heraus. Hier konnte eine Auswachsrate von 42 % erzielt werden. Es wurde weiterhin gezeigt, dass das ausgewachsene, mehrschichtige Limbusepithel proliferationsfähige TACs (Transient Amplifying Cells) enthält. Weiterhin konnten mittels Regressionsanalyse signifikante Zusammenhänge zwischen Spenderalter, Post-mortem-Zeit, Organkultur-Dauer und der Auswachsrate beschrieben werden. Kurzgefasst wurde die Vermutung bestätigt, dass jede Verlängerung der unterschiedlichen Zeiten eine Verringerung der Auswachsrate zur Folge hat. Die hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate könnten für Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz unterschiedlicher Genese verwendet werden.

In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt und verglichen, um aus Corneoskleralringen langzeitorgankonservierter Hornhäute und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen Limbusepithel-Amnion-Transplantate herzustellen. Als erfolgreichste Kultivierungsmethode stellte sich hierbei signifikant die Explantat-Technik mit nach unten gerichtetem Limbusepithel heraus. Hier konnte eine Auswachsrate von 42 % erzielt werden. Es wurde weiterhin gezeigt, dass das ausgewachsene, mehrschichtige Limbusepithel proliferationsfähige TACs (Transient Amplifying Cells) enthält. Weiterhin konnten mittels Regressionsanalyse signifikante Zusammenhänge zwischen Spenderalter, Post-mortem-Zeit, Organkultur-Dauer und der Auswachsrate beschrieben werden. Kurzgefasst wurde die Vermutung bestätigt, dass jede Verlängerung der unterschiedlichen Zeiten eine Verringerung der Auswachsrate zur Folge hat. Die hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate könnten für Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz unterschiedlicher Genese verwendet werden.