O presente trabalho investigou se a exposição em períodos precoces da vida à ração com alto teor de gordura animal altera o risco de câncer de mama na vida adulta em ratas. Ratas mães foram expostas à ração com alto teor de gordura (ATG) à base de banha de porco (60 % de energia proveniente de gordura) ou uma dieta controle AIN93G (16 % de energia proveniente de gordura) durante a gestação ou gestação e lactação. A prole feminina com 7 semanas de idade foi induzida a carcinogênese mamária com o carcinógeno 7,12-dimeti-benz[a]antraceno. Comparado à prole do grupo controle, observou-se menor suscetibilidade à carcinogênese mamária na prole do grupo de ratas prenhas submetidas à ração ATG durante a gestação (menor incidência de neoplasias, multiplicidade e peso das neoplasias) ou gestação e lactação (menor multiplicidade). Prole feminina de ratas exposta à ração ATG durante a gestação apresentou menor crescimento da árvore epitelial mamária, proliferação celular (Ki67) e expressão de NFkB p65 e maior expressão de p21 e níveis globais de H3K9me3 na glândula mamária. Além disso, esta apresentou uma tendência na redução da razão Rank/Rankl (p=0,09) e níveis de progesterona sérica (p=0,07). Glândula mamária da prole feminina do grupo exposto à ração ATG durante a gestação e lactação apresentou menor número de TEBs, crescimento da árvore epitelial e razão BCL-2/BAX e maiores níveis de leptina em comparação à prole do grupo controle. Análise de lipidômica das glândulas mamárias revelou que exposição à ração ATG especificamente durante a gestação apresentou pequenos efeitos no perfil de ácidos graxos na prole feminina, enquanto que a exposição à essa ração durante a gestação e lactação promoveu menor concentração de ácidos graxos saturados (exceto ácido esteárico) e maior concentração de ácidos graxos polinsaturados da série n-6, monoinsaturados e ácido linoleico conjugado (CLA). De acordo com análise de dependência de redes diferencial (DDN) dos genes diferentemente expressos pela análise de \"microarray\" exposição à ração ATG em períodos precoces da vida altera a rede transcricional da glândula mamária na vida adulta. Especificamente, ratas expostas à ração ATG somente durante o período fetal apresentou aumento da expressão de Hrh1 e Repin1 em comparação ao controle. A prole exposta à ração durante o período fetal e lactacional apresentou maior e menor expressão de Stra6 e Tlr1 em comparação ao contole, respectivamente e menor expressão de Crkrs em comparação à prole exposta à ração somente durante o período fetal. Nossos dados confirmam que o risco de câncer de mama da prole pode ser programado pela alimentação materna. No entanto, ao contrário do que se esperava, exposição a altos níveis de gordura animal no início da vida diminuiu a suscetibilidade ao câncer de mama na vida adulta. Dentre os possíveis mecanismos envolvidos nessa proteção encontram-se a modulação da morfologia e perfil lipídico da glândula mamária, redução da proliferação celular e aumento dos níveis proteicos de reguladores do ciclo celular, modulação de marcas epigenéticas como H3K9me3, modulação da expressão gênica global com alteração de redes de sinalização, bem como regulação de vias de sinalização específicas como RANK/RANKL/NFκB. Porém esses mecanismos são dependentes do tempo e período de exposição. / The present study investigated whether early life exposure to high levels of animal fat changes breast cancer risk in adulthood in rats. Dams consumed a lard-based high-fat (HF) diet (60% fat-derived energy) or an AIN93G control diet (16% fat-derived energy) during gestation or gestation and lactation. Their 7-week-old female offspring were exposed to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene to induce mammary tumors. Compared to the control offspring, significantly lower susceptibility to mammary cancer development was observed in the offspring of dams fed on HF diet during gestation (lower tumor incidence, multiplicity and weight), or gestation and lactation (lower tumor multiplicity only). Mammary epithelial elongation, cell proliferation (Ki67), and expression of NFkB p65 were significantly lower, and p21 expression and global H3K9me3 levels were higher in the mammary glands of rats exposed to HF lard diet in utero. They also tended to have lower Rank/Rankl ratios (p=0.09) and serum progesterone levels (p=0.07) than control offspring. In the mammary glands of offspring of dams consuming the HF diet during both gestation and lactation, the number of terminal end buds, epithelial elongation and the BCL-2/BAX ratio were significantly lower, and serum leptin levels were higher than in the controls. Lipidomic analysis on mammary glands showed that exposure to a lard-based HF diet only during gestation had little effects on fatty acids profile on offspring, whereas this exposure during gestation and lactation promoted significant changes on the offspring\'s mammary glands. In general, it decreased SFA (except for stearic acid) and increased n-6 PUFA, MUFA and CLA concentrations in mammary gland. According to Differential dependency network (DDN), analysis of genes differently expressed by microarray, exposure to HF diet during early life changes the transcriptional network of the mammary gland in adulthood. Specifically, rats exposed to HF diet only during the fetal period showed increased expression of Hrh1 e Repin1 compared to the control. The offspring exposed to the HF diet in utero and nursing had higher and lower expression of Stra6 and Tlr1, respectively, compared to the control and lower expression of Crkrs compared to the offspring exposed only in utero. Our data confirm that the breast cancer risk of offspring can be programmed by maternal dietary intake. However, contrary to our expectation, exposure to high levels of lard during early life decreased later susceptibility to breast cancer. The mechanisms involve modulation of mammary gland\'s morphology and lipid profile, decrease of cell proliferation and increase of cell cycle regulators, modulation of epigenetics marks as H3K9me3, modulation of global gene expression with alteration of transcriptional network and RANK/RANKL/NFκB pathway. However, these mechanisms are dependent on the duration and period of exposure.

O presente trabalho investigou se a exposição em períodos precoces da vida à ração com alto teor de gordura animal altera o risco de câncer de mama na vida adulta em ratas. Ratas mães foram expostas à ração com alto teor de gordura (ATG) à base de banha de porco (60 % de energia proveniente de gordura) ou uma dieta controle AIN93G (16 % de energia proveniente de gordura) durante a gestação ou gestação e lactação. A prole feminina com 7 semanas de idade foi induzida a carcinogênese mamária com o carcinógeno 7,12-dimeti-benz[a]antraceno. Comparado à prole do grupo controle, observou-se menor suscetibilidade à carcinogênese mamária na prole do grupo de ratas prenhas submetidas à ração ATG durante a gestação (menor incidência de neoplasias, multiplicidade e peso das neoplasias) ou gestação e lactação (menor multiplicidade). Prole feminina de ratas exposta à ração ATG durante a gestação apresentou menor crescimento da árvore epitelial mamária, proliferação celular (Ki67) e expressão de NFkB p65 e maior expressão de p21 e níveis globais de H3K9me3 na glândula mamária. Além disso, esta apresentou uma tendência na redução da razão Rank/Rankl (p=0,09) e níveis de progesterona sérica (p=0,07). Glândula mamária da prole feminina do grupo exposto à ração ATG durante a gestação e lactação apresentou menor número de TEBs, crescimento da árvore epitelial e razão BCL-2/BAX e maiores níveis de leptina em comparação à prole do grupo controle. Análise de lipidômica das glândulas mamárias revelou que exposição à ração ATG especificamente durante a gestação apresentou pequenos efeitos no perfil de ácidos graxos na prole feminina, enquanto que a exposição à essa ração durante a gestação e lactação promoveu menor concentração de ácidos graxos saturados (exceto ácido esteárico) e maior concentração de ácidos graxos polinsaturados da série n-6, monoinsaturados e ácido linoleico conjugado (CLA). De acordo com análise de dependência de redes diferencial (DDN) dos genes diferentemente expressos pela análise de \"microarray\" exposição à ração ATG em períodos precoces da vida altera a rede transcricional da glândula mamária na vida adulta. Especificamente, ratas expostas à ração ATG somente durante o período fetal apresentou aumento da expressão de Hrh1 e Repin1 em comparação ao controle. A prole exposta à ração durante o período fetal e lactacional apresentou maior e menor expressão de Stra6 e Tlr1 em comparação ao contole, respectivamente e menor expressão de Crkrs em comparação à prole exposta à ração somente durante o período fetal. Nossos dados confirmam que o risco de câncer de mama da prole pode ser programado pela alimentação materna. No entanto, ao contrário do que se esperava, exposição a altos níveis de gordura animal no início da vida diminuiu a suscetibilidade ao câncer de mama na vida adulta. Dentre os possíveis mecanismos envolvidos nessa proteção encontram-se a modulação da morfologia e perfil lipídico da glândula mamária, redução da proliferação celular e aumento dos níveis proteicos de reguladores do ciclo celular, modulação de marcas epigenéticas como H3K9me3, modulação da expressão gênica global com alteração de redes de sinalização, bem como regulação de vias de sinalização específicas como RANK/RANKL/NFκB. Porém esses mecanismos são dependentes do tempo e período de exposição. / The present study investigated whether early life exposure to high levels of animal fat changes breast cancer risk in adulthood in rats. Dams consumed a lard-based high-fat (HF) diet (60% fat-derived energy) or an AIN93G control diet (16% fat-derived energy) during gestation or gestation and lactation. Their 7-week-old female offspring were exposed to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene to induce mammary tumors. Compared to the control offspring, significantly lower susceptibility to mammary cancer development was observed in the offspring of dams fed on HF diet during gestation (lower tumor incidence, multiplicity and weight), or gestation and lactation (lower tumor multiplicity only). Mammary epithelial elongation, cell proliferation (Ki67), and expression of NFkB p65 were significantly lower, and p21 expression and global H3K9me3 levels were higher in the mammary glands of rats exposed to HF lard diet in utero. They also tended to have lower Rank/Rankl ratios (p=0.09) and serum progesterone levels (p=0.07) than control offspring. In the mammary glands of offspring of dams consuming the HF diet during both gestation and lactation, the number of terminal end buds, epithelial elongation and the BCL-2/BAX ratio were significantly lower, and serum leptin levels were higher than in the controls. Lipidomic analysis on mammary glands showed that exposure to a lard-based HF diet only during gestation had little effects on fatty acids profile on offspring, whereas this exposure during gestation and lactation promoted significant changes on the offspring\'s mammary glands. In general, it decreased SFA (except for stearic acid) and increased n-6 PUFA, MUFA and CLA concentrations in mammary gland. According to Differential dependency network (DDN), analysis of genes differently expressed by microarray, exposure to HF diet during early life changes the transcriptional network of the mammary gland in adulthood. Specifically, rats exposed to HF diet only during the fetal period showed increased expression of Hrh1 e Repin1 compared to the control. The offspring exposed to the HF diet in utero and nursing had higher and lower expression of Stra6 and Tlr1, respectively, compared to the control and lower expression of Crkrs compared to the offspring exposed only in utero. Our data confirm that the breast cancer risk of offspring can be programmed by maternal dietary intake. However, contrary to our expectation, exposure to high levels of lard during early life decreased later susceptibility to breast cancer. The mechanisms involve modulation of mammary gland\'s morphology and lipid profile, decrease of cell proliferation and increase of cell cycle regulators, modulation of epigenetics marks as H3K9me3, modulation of global gene expression with alteration of transcriptional network and RANK/RANKL/NFκB pathway. However, these mechanisms are dependent on the duration and period of exposure.

Os eicosanoides, produtos do metabolismo do ácido araquidônico, apresentam papel importante na homeostasia e na patogênese de diversas doenças humanas. A biossíntese desses compostos pode ser estimulada por agentes farmacológicos como ionóforos e inibidores da Ca2+-ATPase, e também por agonistas naturais como o formil-metionil-leucil-fenialanina (fMLP). Considerando os interesses em avaliar e comparar o perfil de mediadores lipídicos, como os leucotrienos (LTs), as prostaglandinas (PGs), os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs), os ácidos dihidroxitetraenoicos (DiHETEs) e os ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs), na saúde e na doença, o objetivo deste trabalho foi padronizar um método analítico para determinar do perfil de eicosanoides em plasma humano após estimulação do sangue total, e assim observar diferenças entre indivíduos saudáveis e doentes. Dessa forma, um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS) foi validado para quantificação de 22 eicosanoides em plasma de indivíduos saudáveis. A análise por HPLCMS/ MS foi realizada em modo negativo pelo modo de varredura por monitoramento de reações múltiplas (MRM). A linearidade do método apresentou coeficiente de correlação (r) maior que 0,98 para todos os eicosanoides analisados. A precisão e exatidão intra e inter-ensaios tiveram desvio padrão e erro relativo menores que 15%, exceto para o limite inferior de quantificação cujos valores foram menores que 20%. Para estimulação das células do sangue total, quatro estímulos (fMLP, ionomicina, A23187 e tapsigargina) foram utilizados. A análise estatística mostrou que o A23187 e a tapsigargina foram os estímulos mais potentes na indução da produção de eicosanoides. Em seguida, comparamos o perfil de eicosanoides em amostras de plasma de indivíduos saudáveis com pacientes com anemia falciforme (AF), em tratamento com hidroxiureia (HU) ou transfusão sanguínea crônica. Os resultados demonstraram que o método é preciso para determinação de diferenças entre os pacientes e indivíduos saudáveis quanto à produção dos mediadores lipídicos 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2 e PGE2. Portanto, nosso método analítico é sensível, específico e reprodutível para identificar e quantificar diferenças no perfil de eicosanoides em amostras de sangue estimuladas in vitro, e poderá contribuir para o estabelecimento do perfil de mediadores lipídicos em diferentes doenças inflamatórias e infecciosas. / Eicosanoids, products from arachidonic acid metabolism, play an important role in the homeostasis and in the pathogenesis of various human diseases. Pharmacological agents such as Ca2+ ionophores and Ca2+-ATPase inhibitors, as well as natural agonists such as fMet-leu-Phe (fMLP) can stimulate eicosanoid biosynthesis. Considering the interests in evaluate and compare the profile of lipid mediators, as leukotriens (LTs), prostaglandins (PGs), epoxyeicosatrienoic acids (EETs), dihydroxytetraenoic acids (DiHETEs) and hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), in healthy and disease, the aim of this work was to standardize a method to determine the eicosanoid profile of human plasma samples after whole blood stimulation, and to assess differences between healthy and sick individuals. For this purpose, a liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was validated for the quantification of 22 eicosanoids using human plasma from healthy volunteers. In addition, we optimized a method for the stimulation of eicosanoids in human whole blood. LC-MS/MS analyses were performed by negative electrospray ionization and multiple reaction monitoring. An assumption of linearity resulted in a regression coefficient > 0.98 for all eicosanoids tested. The mean intra-assay and inter-assay accuracy and precision values had relative standard deviations and relative errors of < 15%, except for the lower limit of quantification, where these values were < 20%. For whole blood stimulation, four stimuli (fMLP, ionomycin, A23187, and thapsigargin) were used. Results of the statistical analysis showed that A23187 and thapsigargin were potent stimuli to induce the production of eicosanoids. We next compared the eicosanoid profiles of healthy volunteers to those of patients with sickle cell anemia (SCA) under treatment with hydroxyurea (HU) or after chronic red blood cell (RBC) transfusion. The results indicate that the method was sufficient to find a difference between lipid mediators released in whole blood of SCA patients compared to healthy subjects for 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2, and PGE2. In conclusion, our analytical method is sensitive, specific and reproducible for indentify and quantify changes in eicosanoid profiles in whole blood stimulated in vitro, which can contribute to establishing the eicosanoid profiles associated with different inflammatory and infectious diseases.

Os eicosanoides, produtos do metabolismo do ácido araquidônico, apresentam papel importante na homeostasia e na patogênese de diversas doenças humanas. A biossíntese desses compostos pode ser estimulada por agentes farmacológicos como ionóforos e inibidores da Ca2+-ATPase, e também por agonistas naturais como o formil-metionil-leucil-fenialanina (fMLP). Considerando os interesses em avaliar e comparar o perfil de mediadores lipídicos, como os leucotrienos (LTs), as prostaglandinas (PGs), os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs), os ácidos dihidroxitetraenoicos (DiHETEs) e os ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs), na saúde e na doença, o objetivo deste trabalho foi padronizar um método analítico para determinar do perfil de eicosanoides em plasma humano após estimulação do sangue total, e assim observar diferenças entre indivíduos saudáveis e doentes. Dessa forma, um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS) foi validado para quantificação de 22 eicosanoides em plasma de indivíduos saudáveis. A análise por HPLCMS/ MS foi realizada em modo negativo pelo modo de varredura por monitoramento de reações múltiplas (MRM). A linearidade do método apresentou coeficiente de correlação (r) maior que 0,98 para todos os eicosanoides analisados. A precisão e exatidão intra e inter-ensaios tiveram desvio padrão e erro relativo menores que 15%, exceto para o limite inferior de quantificação cujos valores foram menores que 20%. Para estimulação das células do sangue total, quatro estímulos (fMLP, ionomicina, A23187 e tapsigargina) foram utilizados. A análise estatística mostrou que o A23187 e a tapsigargina foram os estímulos mais potentes na indução da produção de eicosanoides. Em seguida, comparamos o perfil de eicosanoides em amostras de plasma de indivíduos saudáveis com pacientes com anemia falciforme (AF), em tratamento com hidroxiureia (HU) ou transfusão sanguínea crônica. Os resultados demonstraram que o método é preciso para determinação de diferenças entre os pacientes e indivíduos saudáveis quanto à produção dos mediadores lipídicos 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2 e PGE2. Portanto, nosso método analítico é sensível, específico e reprodutível para identificar e quantificar diferenças no perfil de eicosanoides em amostras de sangue estimuladas in vitro, e poderá contribuir para o estabelecimento do perfil de mediadores lipídicos em diferentes doenças inflamatórias e infecciosas. / Eicosanoids, products from arachidonic acid metabolism, play an important role in the homeostasis and in the pathogenesis of various human diseases. Pharmacological agents such as Ca2+ ionophores and Ca2+-ATPase inhibitors, as well as natural agonists such as fMet-leu-Phe (fMLP) can stimulate eicosanoid biosynthesis. Considering the interests in evaluate and compare the profile of lipid mediators, as leukotriens (LTs), prostaglandins (PGs), epoxyeicosatrienoic acids (EETs), dihydroxytetraenoic acids (DiHETEs) and hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), in healthy and disease, the aim of this work was to standardize a method to determine the eicosanoid profile of human plasma samples after whole blood stimulation, and to assess differences between healthy and sick individuals. For this purpose, a liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was validated for the quantification of 22 eicosanoids using human plasma from healthy volunteers. In addition, we optimized a method for the stimulation of eicosanoids in human whole blood. LC-MS/MS analyses were performed by negative electrospray ionization and multiple reaction monitoring. An assumption of linearity resulted in a regression coefficient > 0.98 for all eicosanoids tested. The mean intra-assay and inter-assay accuracy and precision values had relative standard deviations and relative errors of < 15%, except for the lower limit of quantification, where these values were < 20%. For whole blood stimulation, four stimuli (fMLP, ionomycin, A23187, and thapsigargin) were used. Results of the statistical analysis showed that A23187 and thapsigargin were potent stimuli to induce the production of eicosanoids. We next compared the eicosanoid profiles of healthy volunteers to those of patients with sickle cell anemia (SCA) under treatment with hydroxyurea (HU) or after chronic red blood cell (RBC) transfusion. The results indicate that the method was sufficient to find a difference between lipid mediators released in whole blood of SCA patients compared to healthy subjects for 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2, and PGE2. In conclusion, our analytical method is sensitive, specific and reproducible for indentify and quantify changes in eicosanoid profiles in whole blood stimulated in vitro, which can contribute to establishing the eicosanoid profiles associated with different inflammatory and infectious diseases.