Determination of quantitative expression levels of alternatively spliced isoforms provides an important approach to the understanding of the functional significance of each isoform. Real-time PCR using exon junction overlapping primers has been shown to allow specific detection of each isoform. However, this design often suffers from severe cross amplification of sequences with high homology at the exon junctions. We used human GFRα2b as a model to evaluate the specificity of primers substituted with locked nucleic acids (LNAs). We demonstrate here that single LNA substitutions at different positions of 3’ terminus could improve the discrimination of the primers against GFRα2a template, a highly homologous isoform. While LNA substitutions of GFRα2b primer at the residues possessing different sequences as GFRα2a has limited improvement in specificity, two consecutive LNA substitutions preceding the different sequences has dramatically improved the discrimination by greater than 100,000-fold compared to the non-substituted primer. Thus, LNA when substituted at certain residues can allow the discrimination of highly homologous sequences. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

In this study we use AFM-based nanolithography technique to produce nanofeatures of the single strand DNA and LNA probe molecules which are prepared via thiolated nucleic acid self-assembled monolayers (SAMs) on gold substrates. The goal is to observe the topographic changes of the DNA film structures resulting from the formation of rigid double strand DNA when the target and probe DNAs bind together. The so-called hybridization depends strongly on the probe density on the substrate surface. To find the proper probe density for hybridization, we vary the concentration of the probe DNA and search for the optimal conditions for measuring the height changes of the nanofeatures. We also monitor the topographic changes of the DNA nanofeatures in the different target DNA concentrations as a function of time, and the binding isotherms are fitted with the Langmuir adsorption model to derive the equilibrium dissociation constant and maximum hybridization efficiency. In addition, we extend the nanoscale hybridization reaction detection to mismatched DNA:DNA and LNA:DNA hybridization, and observe that topographic change of mismatched hybridization is inconspicuous and rapidly reach equilibrium. The results reveal the apparent difference between the perfect match and mismatch conditions, and validate that this approach can be applied to differentiate the situations for both perfect match and mismatch cases, demonstrating its potentials in the gene chip technology.

Improving the identification ability of surfaced-immobilized nucleic acid probes for small size DNA or RNA targets, utilizing optical or electrochemical methods, has been the goal for the gene chip technology. This study focuses on new probe design for introducing hairpin structural features and locked nucleic acid modification. We use three kinds of probes (DNA-LN, DNA-HP and LNA-HP) to prepare recognition layers via self-assembly processes on a gold substrate, and utilize AFM-based nanolithography technique to produce nanofeatures to observe the stiffness changes of oligonucleotide chains resulting from the formation of rigid double stranded duplexes when target sequence hybridizes to the probe. We also monitor the topographic changes upon exposure to the single mismatched and non-complementary targets as a function of time. The results reveal LNA-HP probes exhibit the highest response to discriminating single-point mutation in the base sequence. In addition, we study the effects of salt concentration, reaction temperature and the small size on the hybridization efficiency.

The study for surfaced-immobilized nucleic acid probes in nanometer region in response to hybridization and to discrimination ofdifferent target nuclei acids. The hairpin locked nucleic acid (LNA-HP) isselected to be the probe molecule, and target molecules include perfect complementary (PC) and single mismatch (1MM). The self-assembledLNA-HP molecular nanospot is successfully prepared by liquid phaseAFM (Atomic Force Microscope)-based nanolithography technique, then in situ hybridization is carried out by using different targets (PC/1MM).To obtain the information of structure change, we use AFM to analyze therelative heights in the process of hybridization. The experimental results point out that (1) the structure changes of surface probe molecules maycorrelate with the AFM signal when target sequence hybridizes to the probe, (2) miniaturization of the size of the nucleic acid probe may promote hybridization efficiency and enhance the discrimination between PC and 1MM. Studies on whether the different chemical impetus in solution can affect conformation of the human telomeric DNA of sequence is conducted. A human talomeric DNA composed of ( 5¡¦-TTAGGG-3¡¦:5¡¦-CCCTAA-3¡¦ ) repeats, with a 100-200 nt ( T2AG3 ) repetitive unit overhang at 3¡¦ ends is chosen. This extended single-stranded sequence is called G-rich DNA, which forms the special G-quadruplex structure in solution containing sodium ions or potassium ions. The single-stranded sequence composed of ( C3TA2 ) repetitive units called C-rich DNA displays the i-motif folded structure in the low pH environment. These biomimetic DNA¡¦s are thiol-modified to self-assemble on gold surfaces. Separate measurements with AFM (the molecular thickness and rootmean- square roughness of the self-assembly monolayer of DNA ) and CD( circular dichroism ) ( structure characterization ) confirm the conformational changes of G-rich and C-rich DNA¡¦s on gold surface are indeed dependent of the presence of cations and protons.

Le glioblastome est la tumeur maligne primaire du cerveau la plus courante et la plus agressive chez l'homme. Son traitement conventionnel est palliatif et l'apparition de récidives est systématique. Dans le but de développer des thérapies innovantes basées sur le ciblage de nouvelles entités tumorales à l'aide de nanovecteur de médicaments, deux cibles ont été investiguées : le marqueur de radiorésistance AC133/1 et les onco-microARN. En utilisant des cellules de glioblastomes issues de patients, nous avons démontré que leur expansion in vitro à une pO2 non-physiologique (21%) altère leur agressivité tumorale in vivo et l'expression originelle d'AC133/1, au contraire d'une pO2 physiologique (3%) soulignant qu'AC133/1 est un marqueur précoce de non exposition à des pO2 élevées. Nous identifions par ailleurs un rôle pour AC133/1 dans l'endocytose du récepteur de la transferrine et son partenariat avec le métabolisme du fer. Enfin nous avons développé et caractérisé des immunonanoparticules capables de véhiculer des chimiothérapies ou des radiopharmaceutiques vers cet épitope fonctionnel. Dans un second axe de recherche, en parallèle d'établir le miRnome humain en réponse à l'action d'une radiothérapie, des nanocapsules lipidiques biomimétiques présentant à leur surface des peptides de papillomavirus et capables de se complexer avec des acides nucléiques antagonistes de microARN ont été développées et évaluées, démontrant leur intérêt en synergie d'une radiothérapie. Collectivement et en amont d'expérimentations in vivo en cours, ces résultats soulignent la pertinence d'appliquer de nouvelles nanomédecines ciblées pour le contournement de la radiorésistance dans le glioblastome.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs. / QPCR is currently the gold standard for DNA quantification of DNA. It can be defined as an exponential, cyclic and targeted amplification of a known DNA sequence. The exponential character of qPCR is both the cause of the sensitivity of the method but also a potential variability between samples. This variability is offset by the cyclical nature of the method that causes a synchronization of the reaction for all samples in each cycle. The targeted amplification of the selected sequence translates the specificity of the method. Nevertheless, this last property of PCR remains the least tested. The specificity of qPCR is unquestionable when the target to detect is sufficient (> 100 copies). However, for smaller quantities or in the presence of inhibitors, the specificity decreases or disappears (limits of detection and quantification). This loss of specificity will have a significant effect upon the accuracy and reproducibility of the assay to be performed. However, if non-specific hybridizations are unavoidable in these conditions, consecutive nonspecific amplification may be limited or eliminated using more specific PCR primers or less likely to produce inter-sample differences. RT-qPCR allows RNA quantification because of an initial step of reverse transcription (conversion of an RNA into a complementary DNA). However, reverse transcription is less reproducible than PCR, generating harmful inter-sample differences both in diagnosis and in the research field. In this work, I propose innovative methods improving significantly different steps of these techniques. First, I propose an improved standardization of the reverse transcription step that can significantly reduce the variability between samples; using a constant volume of RNA extract for each sample substantially improves mRNA quantification accuracy. Second, I propose a primers modification by incorporating Locked Nucleic Acid residues (LNA); this modification increases the specificity of the primers to the limits of detection. Finally, I propose a simple and economical method for direct measurement of the melting temperature (Tm) in real PCR conditions. This essential parameter in the achievement of qPCR assays is generally obtained by predictive methods with low accuracy. Furthermore, this method should determine the thermodynamic parameters of the oligonucleotide sequence (∆G, ∆H and ∆S), on the one hand allowing access to the actual percentage of annealed primers according to the temperature and on the other hand, to identify the primers susceptibility in the presence of inhibitors.