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Le récepteur CD36 : implication dans le développement de l'athérosclérose et dans le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoiresHarb, Diala 01 1900 (has links)
Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës. / CD36 is a class B scavenger receptor expressed by multiple cell types such as macrophages and microvascular endothelial cells. CD36 shows a high affinity binding towards lipid-based ligands such as oxidized low-density lipoproteins (oxLDL). Macrophage CD36 has been shown to play a critical role in the development of atherosclerotic lesions by its ability to internalize oxLDL and to lead to foam cell formation. We tested the hypothesis that EP 80317, a selective CD36 ligand, exerts anti-atherosclerotic effects in apolipoprotein E-deficient (apoE–/–) mice fed on atherogenic diet. Long term treatment (12 weeks) with EP 80317 results in a striking reduction (51%) of lesion areas in EP 80317-treated apoE–/– mice. This effect was associated with a decrease in plasma cholesterol, a reduced oxLDL internalization within macrophages and an up-regulation of proteins involved in cholesterol efflux. Additionally, treatment with EP 80317 was associated with a reduced expression of vascular and plasma pro-inflammatory proteins. Our studies also showed a role of CD36 in modulating the recruitment of mononuclear phagocytes to the arterial wall, as shown by a reduced migration of radiolabeled CD36-/- macrophages into atherosclerotic lesions compared to CD36+/+ cells. At the molecular level, our studies showed that oxidized phospholipids induced the phosphorylation of the adhesion kinase Pyk2 in monocytes/macrophages, in a CD36- and Src-dependent manner. The Pyk2 phosphorylation is attenuated by treatment with EP80317. Our results strongly support the role of CD36 in atherosclerosis development and suggest that synthetic ligands featuring modulatory effect on CD36 function may represent a novel class of anti-atherosclerotic agents.
CD36 expressed by microvascular endothelial cells is a receptor for the heterodimer S100A8/A9. These proteins bind intracellular arachidonic acid (AA) within polymorphonuclear neutrophils (PMN) and the complex S100A8/A9-AA may be secreted at sites of inflammation where it exerts chemotactic activities. We aimed to delineate the role of microvascular CD36, as a receptor for the S100A8/A9, in the AA transcellular metabolism and the regulation of the associated PMN trafficking to inflammatory sites. In two mouse models of acute inflammation (hind limb ischemia/reperfusion and dorsal air pouch), CD36 regulated trafficking of PMN to inflammatory sites, as shown by a mean of 63% reduction of PMN accumulation in CD36-/- mice. Treatment with EP 80317 or with S100A8/A9 antibodies reduced, each by ~ 60%, the recruitment of PMN to inflammatory sites. The combined administration of anti-S100A8/A9 and EP 80317 did not exert any additional inhibitory effect and neither treatment featured a modulatory effect in CD36-/- mice. Our results strongly support a role for microvascular CD36 in regulating PMN trafficking to inflammatory sites. Targeting CD36 might represent a novel therapeutic avenue for the treatment of acute inflammatory responses.
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Étude du mécanisme de protection des spermatozoïdes de mammifères par le laitLusignan, Marie-France 06 1900 (has links)
Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur
des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande
grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le
mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend
difficile de lui trouver un substitut.
Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of
SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes
sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une
extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les
lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les
diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de
taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la
conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes
durant la conservation en séquestrant les protéines BSP.
Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction
entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en
trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les
protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont
une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une
affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction
entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1
bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5
× 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine.
L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum
principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces
résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les
protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les
protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons
démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées
dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du
lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait
être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre
BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur
de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences
entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf.
Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de
nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver
les spermatozoïdes des mammifères. / Skim milk is being used as a protective agent for mammalian semen conservation
over half a century. Recently, there has been increased interest in developing extenders
free of animal products. However, it is difficult to find suitable component in order to
replace milk as an extender, because the mechanisms by which milk protect sperm against
cooling and freezing damages during the storage is unknown.
The Binder of SPerm (BSP) proteins are the major proteins of bull seminal plasma
and they are harmful during sperm storage. In fact, sperm would be in contact with a large
quantity of BSP proteins that induce a continuous cholesterol and phospholipids efflux
from the sperm membrane during storage. When bull sperm is diluted with an extender
containing egg yolk, another compound frequently used in extender, the low-density
lipoproteins (LDL) present in the egg yolk prevent the binding of the BSP proteins to the
sperm membrane, thus, preventing the lipid efflux from the sperm membrane induced by
the BSP proteins. Our hypothesis was that milk proteins would protect sperm during
storage by binding BSP proteins.
First, we demonstrated by gel filtration that bovine BSP proteins could bind the
milk proteins. Skim milk was fractionated into three fractions: F1 (alpha-lactalbumin and beta-
lactoglobulin, the major whey proteins and kappa-casein), F2 (mainly caseins and all other
milk proteins in small amounts) and F3 (salts, sugars and small peptides). Bovine BSP1
and BSP5 have more affinity for F1 as compared to BSP3 and all the BSP proteins have
affinity for F2. We confirmed the interaction between bovine BSP proteins and milk
proteins by isothermal titration calorimetry. The binding of BSP1 to casein micelles is
characterized by an affinity constant (Ka) of 3.5 × 10^5 M-1 and of a stoichiometric
parameter for the association (n) of 4.5 BSP1 per casein. The association between BSP1
and alpha-lactalbumin (one of the major whey proteins) is characterized by a Ka of 2.4 × 10^5
M-1 and a “n” value of 0.8. These results support our contention that milk can protect
sperm by preventing the BSP proteins’ binding to the sperm membrane attributable to a
protein : protein interaction, while egg yolk sperm protection is attributable to a protein :
lipoprotein interaction. Second, our studies showed that the homologous BSP proteins
found in the boar, stallion and ram seminal plasma can bind the milk proteins. These
results indicate that the mechanism of sperm protection by milk in these species should be
similar to the one in bovine species. Third, we characterized the interaction between
bovine BSP1 protein and LDL from hen’s egg yolk. The binding was characterized by a
Ka of 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 and a « n » value of 104 BSP1 per LDL particle. Our results
indicated that there is difference between the mechanism of sperm protection by milk and
egg yolk.
We believe that the results presented in this thesis may help to create new
extenders free of animal product for mammal sperm preservation in liquid or frozen state.
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