Abstract Osteoclasts are multinuclear bone degrading cells differentiated from monocytes which can be isolated from bone marrow and peripheral blood. Complex signaling between osteoclast precursors and other bone cells, such as mesenchymal stromal cells (MSC) occurs during the differentiation. Gap junctional communication (GJC) is one of the mechanisms in the cell fusion. GJC can be modulated with several substances such as the specific GJC stimulators, antiarrhythmic peptides (AAP). Due to their promising clinical value in the treatment of cardiac disorders, the effects of AAPs in cardiac tissue are studied extensively. This study was conducted in order to investigate the roles of GJC and AAPs in bone cell cultures. Further, the contribution of the MSCs on the effects of AAPs was studied along with comparison of two types of osteoclastogenesis cultures with differing quantities of MSCs. GJC in osteoclastogenesis was studied with both GJC inhibitors and stimulators in mouse monocyte line RAW 264.7 cells and primary cultures with bone marrow hematopoietic cells. The following studies were made with human monocytes from peripheral blood and bone marrow where the effects of AAP10 were investigated in normal and acidic environments. In addition, comparison of osteoclastogenesis from bone marrow and peripheral blood monocytes was carried out in in vitro cell cultures on bovine or human bone slices. The cells were analyzed with regard to multinuclearity, bone resorption and the expression of several osteoclast markers. The results show that GJC is utilized in osteoclastogenesis, but it is not indispensable. GJC in monocytes can be stimulated with the AAPs during osteoclastogenesis, but the effects depend on the culture conditions as well as on the presence of MSCs in the culture. The AAPs can also activate the MSCs leading to indirect regulation of osteoclastogenesis, as the MSCs produce several molecules affecting the differentiation. Further, monocytes from peripheral blood showed increased potential for osteoclastogenic differentiation compared to bone marrow derived monocytes. This can be explained by the presence of the osteoclastogenesis-controlling MSCs in the bone marrow culture, while the peripheral blood cultures contain only few of these cells and thus lack their regulatory effects. / Tiivistelmä Osteoklastit ovat monitumaisia luuta hajottavia soluja, jotka ovat erilaistuneet monosyyteistä. Monosyyttejä voidaan eristää luuytimestä tai perifeerisestä verestä. Erilaistumisen aikana osteoklastien esiastesolujen sekä muiden luusolujen, kuten mesenkymaalisten stroomasolujen (MSC) välillä tapahtuu monimutkaista signalointia. Aukkoliitoskommunikointi (GJC) on eräs solufuusiossa tapahtuvista mekanismeista. GJC:tä voidaan muunnella useilla aineilla, esimerkiksi spesifisillä stimulaattoreilla, antiarytmisillä peptideillä (AAP). AAP-yhdisteiden vaikutuksia on tutkittu laajalti sydänkudoksessa johtuen niiden lupaavista kliinisistä ominaisuuksista sydänperäisten oireiden hoidossa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää GJC:n ja AAP-yhdisteiden roolia luusoluviljelmissä. Lisäksi tutkittiin MSC-solujen osallistumista AAP-yhdisteiden vaikutuksiin sekä vertailtiin kahta erilaista osteoklastogeneesiviljelmää, joissa oli eri määrä MSC-soluja. GJC:tä osteoklastogeneesissä tutkittiin sekä sitä estävillä että stimuloivilla yhdisteillä hiiren monosyyttilinjan RAW 264.7 -soluissa sekä luuytimen hematopoieettisten solujen primääriviljelmissä. Seuraavat tutkimukset tehtiin ihmisen luuytimen ja perifeerisen veren monosyyteillä, ja niissä selvitettiin AAP10-yhdisteen vaikutuksia fysiologisissa sekä happamissa olosuhteissa. Lisäksi vertailtiin luuytimen ja perifeerisen veren monosyyttien osteoklastogeneesiä. In vitro -soluviljelmät tehtiin naudan tai ihmisen luulastujen päällä, ja soluista analysoitiin monitumaisuus, luun resorptio sekä useiden osteoklastimarkkereiden ilmentyminen. Tulokset osoittavat, että GJC:tä hyödynnetään osteoklastogeneesissä, mutta se ei ole korvaamaton mekanismi. GJC:tä voidaan stimuloida AAP-yhdisteillä osteoklastogeneesin aikana, mutta vaikutukset riippuvat viljelyolosuhteista sekä MSC-solujen läsnäolosta. AAP-yhdisteet voivat aktivoida myös MSC-soluja johtaen osteoklastogeneesin epäsuoraan säätelyyn, kun MSC-solut tuottavat useita erilaistumiseen vaikuttavia molekyylejä. Lisäksi perifeerisen veren monosyyteillä havaittiin korkeampi osteoklastogeeninen erilaistumispotentiaali verrattuna luuytimen monosyytteihin. Tulokset voidaan selittää osteoklastogeneesiä säätelevien MSC-solujen läsnäololla luuydinviljelmissä, kun taas perifeerisen veren monosyyttiviljelmissä näitä soluja on vain vähän, jolloin myös niiden säätelyominaisuudet puuttuvat.

Abstract Stem cell therapy has several mechanisms for repairing damaged myocardium and improving functional capacity of the left ventricle reduced by myocardial infarction. Despite the increase in scientific data, details of these mechanisms are still partly unexplained. The optimal number and type of stem cells as well as timing and route of transplantation are unclear. The purpose of this study was to clarify therapeutic potential of bone marrow-derived stem cells (BM-MNCs) using experimental porcine acute myocardial infarction model. Myocardial infarction was caused by occluding the circumflex coronary artery for 90 minutes. Immediately after reperfusion BM-MNCs were injected directly into the damaged myocardium or by angioplastic catheter into the infarct-related coronary artery. Left ventricular ejection fraction (LVEF) improved 3 weeks after infarction in animals that received BM-MNCs intramyocardially whereas in animals that received intracoronary transplantation or saline LVEF failed to recover. Radionuclide imaging and histological analysis showed intramyocardially transplanted cells remaining in the infarcted myocardium, whereas after intracoronary transplantation a major fraction of cells flushed into the lungs. In histological analysis minor fraction of BM-MNCs showed differentiation towards myocyte form and proliferation. Significantly lower collagen density and higher levels of smooth muscle actin and skeletal muscle actin were detected in the infarcted myocardium after intramyocardial or intracoronary BM-MNC transplantation compared with animals that received saline. Proteomic screening indicated that mitochondrial energy metabolism recovered after BM-MNC transplantation. Additionally, two proteins showed elevated levels after BM-MNC transplantation, which indicates that they are actively involved in the pathological mechanisms. BM-MNCs appear to enhance recovery of the infarcted myocardium by restoring the reduced LVEF after infarction. Intramyocardial stem cell therapy showed best results in recovery. Stem cell therapy moulds the infarct scar by reducing collagen density and by increasing components typical for muscle cells. The effects of stem cell therapy are mainly paracrine. / Tiivistelmä Kantasoluterapian on havaittu korjaavan infarktissa vaurioitunutta sydänlihasta toimintakykyisemmäksi usealla mekanismilla sekä parantavan sydänlihaksen pumppaustoimintaa. Huolimatta lisääntyneestä tutkimustiedosta näiden monimutkaisten mekanismien yksityiskohdat ovat edelleen paljolti selvittämättä. Samoin käytettävien kantasolujen tyypin, määrän, siirtotekniikan ja siirron ajoituksen optimointi on vielä epäselvää. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää kokeellista sian infarktimallia käyttäen luuytimen kantasolujen kykyä tehostaa vaurioituneen sydänlihaksen toipumista akuutin infarktin jälkeen. Mallissa aiheutettiin sydäninfarkti sulkemalla vasemman sepelvaltimon kiertävähaara 90 minuutiksi. Välittömästi verenkierron uudelleen avaamisen jälkeen luuytimen soluja ruiskutettiin infarktialueelle joko suoraan sydänlihakseen tai sepelvaltimoon. Kolmen viikon kuluttua infarktista kantasoluja suoraan sydänlihakseen saaneiden eläinten vasemman kammion ejektiofraktio (LVEF) parani tilastollisesti merkitsevästi verrattuna kantasoluja sepelvaltimoon saaneisiin eläimiin ja keittosuolaa saaneisiin eläimiin, joiden LVEF pysyi infarktin jälkeisellä alentuneella tasolla. Isotooppitutkimus ja histologinen analyysi osoittivat, että suoraan sydänlihakseen ruiskutetuista kantasoluista valtaosa säilyy infarktialueella kun taas sepelvaltimoon siirretyt solut pääasiassa ajautuvat keuhkoihin. Histologisessa analyysissa sydänlihakseen ruiskutettujen solujen todettiin vähäisessä määrin erilaistuvan lihassolujen suuntaan ja jakautuvan. Kantasoluja saaneiden eläinten ryhmissä todettiin infarktialueella merkitsevästi alhaisempi kollageenipitoisuus sekä enemmän sileälihassolujen aktiinia ja poikkijuovaisten lihassolujen aktiinia kuin keittosuolaa saaneilla eläimillä. Proteomiikka-analyysin tulokset viittaavat kantasoluterapian saaneilla eläimillä mitokondrioiden energiatalouden tehostumiseen. Lisäksi esille tuli kaksi kantasoluterapian jälkeen aktiivista proteiinia, joilla todennäköisesti on keskeinen tehtävä infarktin patogeneesissä. Tutkimuksen perusteella luuytimen kantasolut tehostavat sydänlihaksen toipumista infarktista palauttamalla sydämen alentunutta pumppaustehoa. Suoraan sydänlihakseen annettu kantasoluterapia vaikuttaa tehokkaimmalta menetelmältä. Kantasoluterapia muovaa infarktiarpea vähentämällä kollageenin ja lisäämällä lihassoluille tyypillisten komponenttien määrää. Kantasoluterapian vaikutukset ovat pääasiassa parakriinisiä.