Thesis (doctoral)--Groningen, 1981.

La pneumopathie d'hypersensibilité (PHS) est une maladie pulmonaire interstitielle caractérisée par des poussées d'inflammation neutrophilique. Les lymphocytes T auxiliaires(CD4) sont suffisants pour le développement de la PHS et, de ce fait, une majorité des études sur la maladie porte sur ce type cellulaire. Malgré tout, les connaissances dans la PHS n'ont pas permis le développement de thérapies efficaces dans les stades chroniques de la maladie et un manque dans les connaissances est présent quant aux autres cellules immunes impliquées dans la PHS comme les lymphocytes B. Ce mémoire visait donc à approfondir les contributions respectives des lymphocytes B et leur collaboration avec les lymphocytes T dans le développement et l'exacerbation de la PHS expérimentale. En utilisant des modèles de transferts de lymphocytes fonctionnels à des souris sans lymphocytes matures, de déplétion partielle des lymphocytes B aux poumons et d'injections d'anticorps déplétants ou bloquants en phase d'exacerbation, ce mémoire met en évidence que les lymphocytes B sont nécessaires à l'induction et à l'exacerbation maximale de la PHS. De plus, il fait ressortir que la réduction partielle des lymphocytes B ne permet pas d'interférer avec le développement de la PHS ni de réduire l'inflammation lors des exacerbations. Cependant, quand la PHS est déjà établie, la co-modulation des lymphocytes T et B permet de mieux inhiber son exacerbation, comparativement à la modulation des lymphocytes T seule. / Hypersensitivity pneumonitis (HP) is an interstitial lung disease characterized by flare-ups of neutrophilic inflammation. T-helper cells (CD4) are sufficient for HP development and therefore, a majority of studies of the disease focus on this cell type. However, the knowledge in HP has not allowed the development of effective therapies in the chronic stages of the disease and a gap in the comprehension of other immune cells involved in HP such as B cells is present. This master's thesis, therefore, aimed to further investigate the respective contributions of B cells and their collaboration with T cells in the development and exacerbation phases of experimental HP. Here, using models of functional lymphocyte transfers to mice without mature lymphocytes, of partial B-cell depletion in the lungs, and of depleting or blocking antibody injections in the exacerbation phase, we demonstrate that although B-cells are required for the induction and maximal exacerbation of HP, partial B-cell depletion does not reduce the HP-associated inflammation. However, co-modulation of T and B cells better inhibits its exacerbation.

Les populations CD19+CD27+ et CD19+CD27+ de lymphocytes B cultivées dans le système CD40-CD154 évoluent différemment selon l'intensité de cette interaction. Les cellules CD27+ prolifèrent bien en présence d'une forte interaction CD40-CD154 lorsqu'elles sont cultivées seules, mais disparaissent lorsque les cellules CD27" sont présentes. Des facteurs solubles ou des interactions membranaires pourraient être la cause de l'évolution différente des populations. L'étude des facteurs solubles a démontré qu'ils n'étaient pas la cause du changement d'équilibre des populations. Ils avaient une certaine influence, mais ne pouvaient pas à eux seuls changer cette évolution. Ce qui suggérait que les interactions membranaires entre les cellules étaient impliquées. En effet, certains marqueurs de surface, comme CD54, CD38 et CD70, étaient différemment exprimés au sein des populations CD27" et CD27+ . Par conséquent, CD70, le ligand de CD27, devenait un acteur intéressant. Effectivement, lorsque l'interaction CD70-CD27 était bloquée, la prolifération était ralentie et les cellules CD27+ étaient maintenues en plus grande proportion. L'interaction CD27- CD70 pourrait donc avoir un rôle dans l'évolution des populations de lymphocytes B suite à leur activation via CD40.

La pneumopathie d'hypersensibilité (PHS) est une maladie pulmonaire interstitielle caractérisée par des poussées d'inflammation neutrophilique. Les lymphocytes T auxiliaires(CD4) sont suffisants pour le développement de la PHS et, de ce fait, une majorité des études sur la maladie porte sur ce type cellulaire. Malgré tout, les connaissances dans la PHS n'ont pas permis le développement de thérapies efficaces dans les stades chroniques de la maladie et un manque dans les connaissances est présent quant aux autres cellules immunes impliquées dans la PHS comme les lymphocytes B. Ce mémoire visait donc à approfondir les contributions respectives des lymphocytes B et leur collaboration avec les lymphocytes T dans le développement et l'exacerbation de la PHS expérimentale. En utilisant des modèles de transferts de lymphocytes fonctionnels à des souris sans lymphocytes matures, de déplétion partielle des lymphocytes B aux poumons et d'injections d'anticorps déplétants ou bloquants en phase d'exacerbation, ce mémoire met en évidence que les lymphocytes B sont nécessaires à l'induction et à l'exacerbation maximale de la PHS. De plus, il fait ressortir que la réduction partielle des lymphocytes B ne permet pas d'interférer avec le développement de la PHS ni de réduire l'inflammation lors des exacerbations. Cependant, quand la PHS est déjà établie, la co-modulation des lymphocytes T et B permet de mieux inhiber son exacerbation, comparativement à la modulation des lymphocytes T seule. / Hypersensitivity pneumonitis (HP) is an interstitial lung disease characterized by flare-ups of neutrophilic inflammation. T-helper cells (CD4) are sufficient for HP development and therefore, a majority of studies of the disease focus on this cell type. However, the knowledge in HP has not allowed the development of effective therapies in the chronic stages of the disease and a gap in the comprehension of other immune cells involved in HP such as B cells is present. This master's thesis, therefore, aimed to further investigate the respective contributions of B cells and their collaboration with T cells in the development and exacerbation phases of experimental HP. Here, using models of functional lymphocyte transfers to mice without mature lymphocytes, of partial B-cell depletion in the lungs, and of depleting or blocking antibody injections in the exacerbation phase, we demonstrate that although B-cells are required for the induction and maximal exacerbation of HP, partial B-cell depletion does not reduce the HP-associated inflammation. However, co-modulation of T and B cells better inhibits its exacerbation.

L'une des missions d'Héma-Québec est de produire en laboratoire des substituts sanguins tels les immunoglobulines (Igs). Puisque les Igs sont produites par les lymphocytes B qui ont atteint le stade de cellules productrices d'anticorps (Ac), il demeure très intéressant d'étudier l'implication de certains gènes lors de ce processus. Des travaux de recherche réalisés chez la souris et différentes lignées cellulaires humaines ont permis d'identifier une forme distincte de la protéine XBP-1 (p54XBP-l), produite à partir de son ARN messager épissé, comme étant un facteur de transcription essentiel à la différenciation du lymphocyte B (1). Le présent projet visait donc à étudier l'expression de XBP-1 (la protéine et le gène) épissé chez les lymphocytes B humains en utilisant un système de culture in vitro et différentes techniques de biologie cellulaire et moléculaire. Les résultats obtenus ont démontré un lien étroit entre l'expression de la forme épissée de XBP-1 et la différenciation des lymphocytes B humains en cellules sécrétrices d'Ac, les plasmocytes. Ces résultats appuient ce qui avait été observé chez la souris et suggèrent une avenue intéressante pour la production d'Igs in vitro.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le type de leucémie le plus répandu chez les adultes des pays occidentaux. Elle provient notamment de la prolifération accrue des cellules B malignes matures qui s'accumulent progressivement dans les ganglions lymphatiques, la moelle osseuse, la rate et la circulation sanguine. L'évolution clinique de la LLC est très variable. Il a été montré, par notre groupe et répliqué par d'autres, qu'une expression tumorale élevée de la glycosyltransférase UGT2B17 identifie un sous-groupe de patients LLC avec une survie sans traitement et une survie globale réduites. L'expression élevée d'UGT2B17 favorise la prolifération des cellules B leucémiques, suggérant un rôle de cette enzyme dans ce processus, médié entre autres par son activité en inactivant des molécules comme la molécule anti-apoptotique prostaglandine E₂. De plus, l'expression élevée d'UGT2B17 est associée à une réponse réduite aux traitements de chimiothérapie à base de fludarabine et est associée à la résistance aux thérapies ciblées telle que l'ibrutinib. L'ibrutinib cible la tyrosine kinase de Bruton (BTK) de la voie de pro-survie du récepteur à l'antigène des cellules B (BCR). La voie du BCR est reconnue comme étant une voie de pro-survie contribuant largement à la progression de la maladie et elle constitue une cible thérapeutique en LLC. Au cours de mon programme de maîtrise, nous avons testé l'hypothèse que l'UGT2B17 influence le signalosome du BCR. Notre étude de l'expression génique des cellules B leucémiques révèle un enrichissement des effecteurs de la voie du BCR associé à l'expression élevée d'UGT2B17, dont BTK et d'autres effecteurs proximaux de cette voie, suggérant un lien entre UGT2B17 et cette voie de signalisation. L'une de ces protéines, ZAP70, constitue un marqueur de mauvais pronostic connu pour amplifier la signalisation du BCR. L'expression de *ZAP70* est associée à celle d'*UGT2B17* dans plusieurs cohortes de patients LLC. La co-expression élevée de ces deux gènes permet d'identifier un sous-groupe de patients avec le risque le plus élevé de survie globale réduite en comparaison avec l'expression de chacun d'entre eux, suggérant un effet additif. Dans les modèles cellulaires de LLC, la manipulation génétique de l'expression de ces deux gènes démontre une influence sur la prolifération cellulaire. De plus, l'inhibition de *ZAP70* compromet la prolifération des cellules B induite par l'UGT2B17, suggérant que l'effet de UGT2B17 pourrait être médié, du moins en partie, par ZAP70. Les travaux montrent également pour la première fois que la protéine UGT2B17 forme un complexe protéique avec plusieurs kinases du signalosome BCR, incluant BTK, SYK, BTK, ZAP70, LYN et LCK . Ces données suggèrent qu'UGT2B17 pourrait influencer la prolifération des cellules leucémiques par un mécanisme impliquant des interactions protéine-protéine (IPP). Enfin, nos travaux montrent que la double inhibition de SYK et JAK1/3 par le cerdulatinib, s'est avérée plus efficace pour contrer l'effet pro-prolifératif d'UGT2B17 comparativement à l'inhibition de BTK avec l'ibrutinib. Ces observations suggèrent une vulnérabilité thérapeutique chez les patients LLC à haut risque surexprimant UGT2B17. Nos découvertes supportent un rôle pro-oncogénique pour l'UGT2B17 en LLC en tant que nouveau constituant du signalosome BCR. / RChronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common type of leukemia among adults in Western countries. It comes in particular from the increased proliferation of mature malignant B cells which gradually accumulate in the lymph nodes, bone marrow, spleen and blood circulation. The clinical course of CLL is very variable. It has been shown, by our group and replicated by others, that high tumor expression of the glycosyltransferase UGT2B17 identifies a subgroup of CLL patients with reduced treatment-free survival and overall survival. The high expression of UGT2B17 promotes the proliferation of leukemic B cells, suggesting a role for this enzyme in the disease, mediated among other things by its activity in inactivating molecules such as the anti-apoptotic molecule prostaglandin E2. Furthermore, high expression of UGT2B17 is associated with reduced response to fludarabine-based chemotherapy treatments and is associated with resistance to targeted therapies such as ibrutinib. Ibrutinib targets Bruton's tyrosine kinase (BTK) of the B-cell antigen receptor (BCR) pro-survival pathway. The BCR pathway is recognized as a pro-survival pathway contributing largely to disease progression and constitutes a therapeutic target in CLL. During my master program, we tested the hypothesis that UGT2B17 influences the BCR signalosome. Our study of gene expression in leukemic B cells reveals an enrichment of BCR pathway effectors associated with elevated UGT2B17 expression, including BTK and other proximal effectors of this pathway, suggesting a link between UGT2B17 and this signaling pathway. One of these proteins, ZAP70, is a poor prognosis marker known to amplify BCR signaling. ZAP70 expression is associated with that of UGT2B17 in several cohorts of CLL patients. The high co-expression of these two genes allows the identification of a subgroup of patients with the highest risk of reduced overall survival compared to the expression of each of them, suggesting an additive effect. In cellular models of CLL, genetic manipulation of the expression of these two genes demonstrates an influence on B cell proliferation. Furthermore, inhibition of ZAP70 impairs UGT2B17-induced B cell proliferation, suggesting that the effect of UGT2B17 may be mediated, at least in part, by ZAP70. The work also shows for the first time that the UGT2B17 protein forms a protein complex with several BCR signalosome kinases, including BTK, SYK, BTK, ZAP70, LYN and LCK. These datasuggest that UGT2B17 may influence leukemia cell proliferation through a mechanisminvolving protein-protein interactions (PPIs). Finally, our work shows that the dual inhibition of SYK and JAK1/3 by cerdulatinib provedto be more effective in countering the pro-proliferative effect of UGT2B17 compared to theinhibition of BTK with ibrutinib. These observations suggest therapeutic vulnerability inhigh-risk CLL patients overexpressing UGT2B17. Our findings support a pro-oncogenic rolefor UGT2B17 in CLL as a novel constituent of the BCR signalosome.

Lorsque le lymphocyte B entre en contact avec son antigène, plusieurs interactions sont essentielles. Parmi celles-ci, l'engagement de son récepteur CD40 avec le ligand CD154 d'un lymphocyte T activé est primordial. Des études réalisées in vitro ont démontré que l'intensité et la durée de l'interaction CD40-CD154 entraînent différentiellement l'évolution des lymphocytes B matures naïfs et à mémoire. En conséquence, une source de CD 154 soluble pour stimuler les lymphocytes B a été utilisée dans le but de vérifier comment la modulation de l'interaction modifiait les caractéristiques des populations de lymphocytes B par la transmission intracellulaire du signal, de CD40 au noyau. Les résultats obtenus lors de cette étude suggèrent que certaines voies de signalisation, principalement de la famille des MAPK soit, ERK.1/2 et p38, pourraient être empruntées différemment lors de la liaison de CD40 avec CD154. L'activation modulée des voies de signalisation pourrait participer à la régulation de la réponse immunitaire.

Le modèle de culture in vitro de l'équipe du Dr. Néron permet l'expansion à long terme des lymphocytes B à mémoire en présence d'une forte interaction entre CD40 et CD154 et d'un mélange d'IL-2, d'IL-4 et d'IL-10. Cette première phase dite d'expansion est suivie d'une phase de différenciation. Ce projet visait l'amélioration des conditions de différenciation, basée sur une faible interaction entre CD40 et CD154 et consistait en l'essai d'une vingtaine de combinaisons de facteurs solubles. Deux mélanges de cytokines soit, IL-6 et IL-10 ainsi que IL-2, IL-4 et IL-10 ont été identifiés et permettaient de diminuer la prolifération, d'augmenter la sécrétion d'IgG et de maintenir la viabilité. Le rendement de ces deux mélanges a été confirmé lors d'essais de transition progressive entre les deux phases. Nos travaux indiquent qu'il est possible d'induire la différenciation des lymphocytes B à mémoire suite à une longue période d'expansion dans le système CD40-CD154.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) se caractérise par une hétérogénéité d’évolution avec des formes indolente et progressive. Cette dernière reste incurable avec les options thérapeutiques classiques. Mon objectif de thèse a consisté à définir phénotypiquement et fonctionnellement le potentiel régulateur des lymphocytes B de LLC induisant un contexte favorable à leur survie. Après purification des cellules B leucémiques de 30 patients LLC, nos résultats montrent que les sous-populations B sécrètent des cytokines immuno-régulatrices dont l’IL-10 et le TGFβ1. De façon intéressante, ces sous-populations lymphocytaires expriment également le facteur de transcription FOXP3, caractéristique des cellules T régulatrices. La signature phénotypique de ces sous-populations est spécifique au néoplasme avec des marqueurs de lymphocytes B mémoires activés. Nos approches fonctionnelles in vitro démontrent que ces sous-populations B modulent la prolifération et orientent la différenciation et les sécrétions des cellules T, contribuant à l’absence d’immuno-surveillance chez les patients. Enfin, une analyse statistique combinant les expressions de l’IL-10, du TGFβ1 et de FOXP3 dans ces sous-populations B permet de définir un indice polyfonctionnel qui corrèle avec deux facteurs clés du risque de progression de la LLC. L’ensemble de mes travaux de thèse a permis de caractériser de nouvelles sous-populations B impliquées dans la progression de la maladie et donne un rationnel à la survie des cellules leucémiques dans l’environnement ganglionnaire. / Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a clonal B cell malignancy of the elderly. This neoplasm is characterized by a heterogeneous clinical course from indolent chronic disease to progressive lymphadenopathy that remains incurable. The aim of my PhD was to undertake a comprehensive phenotypic and functional analysis of the B cell subpopulations responsible for their survival advantage. CLL B cell purification from 30 patients indicate the presence in various extents of leukemic B cell subpopulations producing immune-regulatory cytokines, notably IL-10 and TGFβ1. Remarkably, these CLL subpopulations express the FOXP3 transcription factor, a marker of regulatory T cells. These subpopulations present a phenotypic signature, distinguishable from regulatory B cells populations, with specific markers of activated memory B cells. Functional studies prove their regulatory capacities on T cell differentiation, proliferation and secretion, contributing to the T cell dysfunction observed in CLL. Finally, statistical analysis combining IL-10, TGFβ1 and FOXP3 expressions for these subpopulations allows generating a poly-functional index correlated with two major risk factors of CLL progression. Our data characterize novel CLL B cell subpopulations that are involved in disease progression and give a rational to CLL B cell survival in secondary lymphoid organs.