Des lésions de l’ADN sont impliquées dans les mécanismes de l’oncogenèse. De plus, la prolifération incontrôlée des cellules tumorales induit l’accumulation d’aberrations géniques. En réponse à ce stress génotoxique, les cellules en transformation expriment les ligands NKG2D MICA et MICB, molécules du CMH de classe I non conventionnelles qui activent une réponse cytotoxique T et NK contre cette transformation. Dans les syndromes lymphoprolifératifs chroniques, les mécanismes de la leucémogenèse reposent essentiellement sur une stimulation antigénique ou une activation des voies du récepteur à l’antigène (BCR) qui induit la prolifération cellulaire. De plus, les ligands MICA/B ne sont pas retrouvés à la surface de ces cellules. Les objectifs de cette thèse sont (i) rechercher si l’activation de la prolifération lymphocytaire peut induire l’expression de MICA/B et (ii) étudier les mécanismes induisant cette expression et leurs liens avec les voies de lésions/réparations de l’ADN. Pour cela, nous avons mis en place des conditions d’activation du récepteur à l’antigène permettant d’obtenir une prolifération (objectivée après marquage par CFSE) de lymphocytes B sains et de lymphocytes issus de patients porteurs de leucémie lymphoïde chronique (LLC), la plus fréquente des leucémie de l’adulte. L’expression des ligands MICA et MICB a ensuite été évaluée par qPCR, cytométrie en flux, western blots et ELISA. L’implication des différentes voies de signalisation en aval du récepteur à l’antigène a été analysée, ainsi que la cinétique d’apparition des lésions de l’ADN durant ce processus. Mes résultats montrent que MICA/B ne sont pas exprimés à la surface des lymphocytes B issus de donneurs sains ou de patients porteurs de LLC. Cependant, l’activation de la prolifération lymphocytaire induit une activation transcriptionnnelle de MICA ainsi que son expression à la surface de ces cellules. Cette expression est induite par différentes voies du récepteur à l’antigène ainsi que par la voie JAK/STAT et est indépendante des lésions de l’ADN qui surviennent plus tardivement dans la cellule. Au total, l’activation du récepteur à l’antigène qui induit la prolifération lymphocytaire induit également l’expression du ligand MICA (et non MICB) à la surface des lymphocytes sains et cette capacité d’expression est conservée dans les cellules de LLC qui ne l’expriment pas. Ces résultats suggèrent que MICA pourrait jouer un rôle crucial aux stades précoces de l’immunité anti-proliférative, ce qui ouvre la voie à de potentielles applications thérapeutiques. / Tumor cell’s uncontrolled proliferation induces an accumulation of genetic aberrations. In response to this genotoxic stress, most cells in transformation express NKG2D ligands (not expressed on resting cells), including MICA and MICB, which are non-conventional MHC class I molecules that could induce a cytotoxic T and NK response against the transformed cell. In chronic lymphoproliferative conditions, leukemogenic mechanisms rely in part on antigenic stimulations and/or activation of the B cell antigen receptor (BCR) pathways that induce cell proliferation. My thesis aims at studying : (i) the induction of MICA/B expression during lymphocyte proliferation and (ii) the mechanisms inducing this expression and their relationship with the DNA damage/repair pathways.I did generate BCR activation conditions to obtain B cells proliferation from healthy control individuals and from patients suffreing from chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common leukemia in adults. MICA and MICB expression was assessed by quantitative PCR, flow cytometry, Western blotting and ELISA after activation of B-cell proliferation. The different signaling pathways downstream BCR were analyzed, as were the kinetics of the DNA damage during this process. The results show that MICA/B aren’t expressed on cell surface of B cells from healthy control individuals or CLL patients before activation. Lymphoproliferative stimulation however up-regulates both MICA mRNA and surface protein in these same cells. This expression was induced by several BCR and by JAK/STAT pathways and seems to be indpendant of DNA damage. In conclusion, antigen receptor activation that induces lymphocyte proliferation also induces MICA expression (but not MICB) on B cells surface from healthy control individuals and this expression capacity is conserved in B cells from patients suffering from CLL. These results suggest that MICA may play a crucial role in the early stages of anti-proliferative immunity, which opens the avenue for therapeutic interventions.

La reconnaissance d'antigènes par le TCR active des protéines tyrosine kinases qui phosphorylent d'autres substrats intracellulaires dont LAT. Ceci engendre l'activation de molécules telles que PKCθ et CARMA-1. La mutation LatY136F associe des TCR "estropiés" dans le développement de cellules T effectrices générant des désordres lymphoprolifératifs. Nous avons essayé de comprendre les gènes aggravant ou empêchant cette lymphoprolifération en utilisant la mutagénèse ENU. Nous avons identifié une mutation appelée Basilic empêchant le déroulement de la pathologie LatY136F. Basilic est une mutation du gène Rltpr qui constitue une phénocopie de Cd28-/- sur fond sauvage et sur fond LatY136F. Rltpr est un une nouvelle protéine ayant de multiples domaines, qui appartient à la famille CARMIL et qui est exprimée dans les cellules T et B. L'objectif de ce travail était d'élucider les mécanismes au cours desquels CD28 et Rltpr coopèrent avec le TCR pour différencier des cellules T naïves en cellules T effectrices. Ce travail visait aussi à caractériser Rltpr, dont la structure/fonction et l'interactome sont encore inconnus. En utilisant des techniques de microscopie confocale, nous avons montré que la localisation et le recrutement de Rltpr et de RltprBas à la synapse immunologique sont tous deux CD28-dépendants. Les deux molécules colocalisent avec CD28 tout au long du processus d'activation. En outre, Rltpr est essentiel pour la translocation à la synapse de PKCθ et CARMA-1, qui sont induits lors de la co-stimulation par CD28. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du fin réglage du système immunitaire adaptatif qui est mis en place lors de l'activation. / TCR recognition of antigens triggers the activation of protein tyrosine kinases that phosphorylate other intracellular substrates including LAT. LAT phosphorylation leads to the activation of PKCθ and CARMA-1. The point mutation LatY136F associates TCRs with crippled signaling abilities to the development of effector T cells generating lymphoproliferative disorders (LPDs). We tried to shed light on genes exacerbating or preventing the LatY136F LPD by using an ENU mutagenesis screening. We identified one point mutation called Basilic that prevents the unfolding of the LatY136F pathology. Basilic is a point mutation of the Rltpr gene and is a phenocopy of a Cd28-/- mutation both on a wild-type and on a LatY136F background. Rltpr is a newly-discovered, multidomain protein belonging to the CARMIL family that is expressed in T and B cells. The objective of the present work was to elucidate the mechanisms during which CD28 and Rltpr cooperate withthe TCR to differentiate naïve into effector T cells. I also aimed at characterizing the Rltpr molecule, whosestructure/function and interactome are still largely unknown. Using confocal microscopy in collaborationwith Takashi Saito's group and Christoph Wülfing we showed that the localization and the recruitment ofboth Rltpr and RltprBas at the immune synapse are CD28-dependent. The two molecules colocalize with CD28all along the activation process. Moreover, Rltpr is essential for the synapse translocation of PKCθ andCARMA-1, which are induced upon CD28 costimulation. Those results allow a better understanding of theadaptive immune system fine tuning upon activation.

L'apoptose lymphocytaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la réponse immunitaire et de la prolifération cellulaire. De nombreuses voies interviennent dans sa régulation, dont certaines dépendantes de l’oncogène RAS. Un défaut d'apoptose lymphocytaire induit l'apparition de maladies auto-immunes et lympho-prolifératives comme l'Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS). L'ALPS fait suite à des anomalies du principal récepteur membranaire de mort FAS, pivot de l'apoptose lymphocytaire. Le RAS-Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) est une entité décrite récemment, se rapprochant de l'ALPS par la symptomatologie et la physiopathologie sous-jacente. Cependant, dans le RALD, le défaut d'apoptose lymphocytaire n’est pas lié à des mutations de FAS mais à une hyperactivation de la voie RAS, mettant ainsi en lumière le rôle essentiel de cette voie dans la régulation du processus en question. Dans les Leucémies Myélo-Monocytaires Juvéniles Chroniques (JMML), les mêmes mutations que celles observées dans les RALD sont trouvées, sur les mêmes populations cellulaires. Il existe une hétérogénéité clinique et biologique au sein des JMML, certaines étant indolentes (LS-JMML) et d'autres sévères (S-JMML). A cette hétérogénéité au sein même des JMML s'ajoute celle observée entre JMML et RALD. L'objectif de ce travail a été de comprendre les tenants des différences phénotypiques observées, au travers du scope de l'apoptose des lymphocytes T activés, en comparant les trois entités résultant de mutations activatrices de RAS dans des cellules pluripotentes hématopoïétiques : RALD, LS-JMML et S-JMML. Nous rapportons des conséquences distinctes pour des mutations identiques ou équivalentes, avec différentes voies de l'apoptose touchées, différenciant les phénotypes induits. Ce travail a permis de démontrer que l’hyperactivation de la voie RAS seule n’entraîne pas nécessairement une dérégulation de la réponse immunitaire T. Des événements additionnels aux mutations présentes sont nécessaires au développement des symptômes. Ces événements ont bien des conséquences sur l'apoptose lymphocytaire, au niveau post-traductionnel, qu’ils concernent la voie RAS ou non. Les différences observées entre les trois phénotypes sur le plan expérimental pourraient être une aide au pronostic. De plus, ce travail ouvre la voie à l'identification en détails des facteurs additionnels et voies défaillantes et permettrait ainsi d'obtenir des thérapeutiques spécifiques actuellement inexistantes. / Lymphocytes apoptosis is essential in maintaining homeostasis and avoiding abnormal proliferation. When defective, autoimmune diseases as the Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS), due to mutations of the death receptor FAS, can occur. Several pathways are important actors influencing the apoptosis cascade, including the RAS proto-oncogene signaling. The RAS Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) is a newly described entity, similar to ALPS but with RAS mutations instead of FAS mutations, enlightening the primary role of RAS in apoptosis regulation. Interestingly, the same RAS mutations as observed in RALD are also the cause of a malignant proliferation, the Juvenile Myelo Monocytic Leukemia (JMML). In the case of JMML, RAS mutations can lead either to a mild (LS-JMML) or a severe (S-JMML) phenotype. Thus, three different phenotypes can be caused by the same oncogenic RAS mutations. In order to better understand and characterize the influence of oncogenic RAS mutations in lymphocytes’ apoptosis we studied it in patients presenting with RALD, LS-JMML and JMML. We showed that isolated RAS hyperactivity is not sufficient to induce an immune deregulation. Additional factors are required to do so. These factors influence both mitochondrial and extrinsic apoptosis pathways at a post-transcriptional level. They are due to probable genetic events, and their identification can lead to new therapeutic strategies. Furthermore, activated lymphocytes’ in vitro apoptosis assessment can help differentiating the three phenotypes and thus facilitate prognosis prediction.