6. ZUSAMMENFASSUNG Charakterisierung b-adrenerger Rezeptoren auf Pferdelymphozyten und deren Regulation unter dem Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason Getu Abraham Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, Deutschland Juni, 2001 86 S., 205 Lit., 7 Tab., 23 Abb. Über Vorkommen und Eigenschaften von b-Adrenozeptoren auf Pferdelymphozyten und ihre pharmakologische Regulation liegen bisher keine Untersuchungen vor. Mit der vorliegenden Arbeit sollten b-adrenerge Rezeptoren an intakten Pferdelymphozyten in Bindungsstudien mit dem Radioliganden (-)-(125I)-Iodocyanopindolol (ICYP), einem potenten b2-selektiven Adrenozeptorenantagonisten, charakterisiert und deren funktionelle Ansprechbarkeit durch Messung des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes mittels Radioimmunoassay bestimmt werden. Die Bindung von ICYP an intakten Pferdelymphozyten war schnell, sättigbar (maximale Anzahl der Bindungsstellen 320 ± 20 ICYP Bindungsstellen/Zelle, Mittelwert±SEM, n = 12) ) und hochaffin (KD-Wert für ICYP 14,37 ± 1,66 pmol/l, Mittelwert±SEM, n = 12). Verdrängungsexperimente mit Agonisten und Antagonisten zeigten eine Affinität und Stereoselektivität, wie sie bei b-Adrenozeptoren zu erwarten waren. Der nicht radioaktiv markierte b2-selektive Adrenozeptorantagonist ICI 118,551 verdrängte den Radioliganden ICYP aus seiner Bindung mit mehr als 1500fach höherer Affinität als der nicht radioaktiv markierte b1-selektive Adrenozeptorantagonist CGP 20712A. In Pferdelymphozyten können somit mehr als 90 % der b-Adrenozeptoren dem b2-Subtyp zugeordnet werden. Ein Anteil von weniger als 10 % an b1-Adrenozeptoren kann allerdings nicht ausgeschlossen werden. Die Bindungsstellen waren stereospezifisch, da das biologisch aktive (-)-Propranolol die Bindung von ICYP mit 40fach höherer Affinität verdrängte als (+)-Propranolol. b-adrenerge Agonisten verdrängten ICYP aus seiner spezifischen Bindung in der Rangfolge ihrer pharmakologischen Wirkungstärke, die typisch für den b2-Subtyp des Adrenozeptors ist: (-)-Isoprenalin > (-)-Adrenalin > (-)-Noradrenalin. Eine ähnliche Rangfolge wurde auch für die Agonist-induzierte cAMP-Bildung in Lymphozyten festgestellt. Aufgrund der dargestellten Befunde kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß ICYP ein geeigneter Radioligand ist, um b-adrenerge Rezeptoren an Pferdelymphozyten zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Bindung von ICYP an intakte Lymphozyten stellt somit ein geeignetes Modell dar, um wichtige Informationen über die Funktion und Regulation des b-adrenergen Systems beim Pferd sowohl unter physiologischen (pathophysiologischen) Bedingungen als auch über Arzneimittel-induzierte Veränderungen in vivo zu gewinnen. Ausgehend von den beschriebenen Grundlagenuntersuchungen wurden in einer weiteren Versuchsreihe bei zwölf klinisch gesunden Pferden der Einfluß von Clenbuterol und Dexamethason lymphozytäre b2-Adrenozeptoren, hinsichtlich ihrer Dichte, ihrer Affinität zum Radioliganden und ihrer cAMP-Bildung (als Maß für die funktionelle Ansprechbarkeit der b2-Adrenozeptoren bestimmt über Stimulation durch 10 µmol/l Isoprenalin) untersucht. Während der 12tägigen Clenbuterolbehandlung (2 Ž 0,8 µg/kg/Tag, i. v.) fielen die Anzahl der b2-Adrenozeptoren an Lymphozyten und der durch (-)-Isoprenalin-induzierte Anstieg des intrazellulären cAMP-Gehaltes signifikant (p < 0,05, n = 8) unter die Ausgangswerte unbehandelter Tiere ab. Clenbuterol bewirkte in der therapeutischen Dosis bereits 48 Stunden nach der Behandlung einen Abfall der Anzahl der b2-Adrenozeptoren bzw. der cAMP-Bildung um etwa 30 - 40 %. Während der restlichen Behandlungsdauer unter Clenbuterol blieb die Rezeptorendichte auf diesem niedrigen Niveau. Bei einer weiteren Versuchsgruppe wurde der Effekt des Glukokortikoids Dexamethason auf die Clenbuterol-induzierte Desensibilisierung von b2-Adrenozeptoren untersucht. Dexamethasonverabreichung (1 Ž 0,1mg/kg/d, i. v.) unmittelbar nach der letzten Clenbuteroldosis über 5 Tage beschleunigte die Wiederherstellung der down-regulierten Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren und des Isoprenalin-induzierten Anstiegs des intrazellulären cAMP-Gehaltes (p < 0,05, n = 4). Schon 24 Stunden nach der ersten Dexamethasongabe waren beide Parameter von den Durchschnittswerten am Tag vor Behandlungsbeginn statistisch nicht zu unterscheiden. Die Anzahl der lymphozytären b2-Adrenozeptoren stieg sogar ab dem dritten Tag der Dexamethasonbehandlung bis auf das Doppelte bei unbehandelten Tiere an. Nach dem Absetzen der Dexamethasonbehandlung kam es zu einer langsam Abnahme der Rezeptorendichte und ihrer Ansprechbarkeit, wobei die vor der Clenbuterolbehandlung gemessenen Werte erst nach 4 Tagen erreicht wurden. Bei gleichzeitiger Behandlung der Tiere mit Clenbuterol und Dexamethason konnte durch das Glukokortikoid die Clenbuterol-induzierte Abnahme der b2-Adrenozeptorendichte und deren Ansprechbarkeit vollständig verhindert werden. Weder durch die Clenbuterol-abhängige Down-Regulation noch durch die Dexamethason-bedingte Hochregulation kam es zu signifikanten Veränderungen der Dissoziationskonstante (KD) und somit der Affinität von ICYP zu b2-Adrenozeptoren. Die Ergebnisse zeigen, daß es unter Behandlung mit Clenbuterol zu einer schnell einsetzenden, umfangreichen Down-Regulation der b2-Adrenozeptorendichte an Lymphozyten des Pferdes kommt und daß diese Toleranzentwicklung durch Glukokortikoide vollständig wieder aufgehoben oder verhindert werden kann. Zur Therapie der COB von Pferden scheint somit die kombinierte Anwendung von b2-Mimetika und Glukokortikoiden von Vorteil zu sein. / 7. Summary Characterization of b-adrenergic Receptors on Equine Lymphocytes and their Regulation under the Influence of Clenbuterol and Dexamethasone Getu Abraham Institute of Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig, Germany June, 2001 86 pp., 205 ref., 7 tab., 23 fig. b-Adrenoceptors and their regulation by pharmacological active substances have not yet been characterized in equine lymphocytes. In this study, b-adrenoceptors were identified and subclassified by (-)-[125I]-iodocyanopindolol (ICYP) binding, a potent b2-adrenergic antagonist, as well as by their isoprenaline-induced responsiveness using radioimmunoassay in intact viable equine lymphocytes. The specific ICYP binding was rapid, saturable (maximum number of binding sites 320 ± 20 ICYP binding sites/cell, means±SEM, n = 12) and of high affinity (KD-value for ICYP 14.37 ± 1.66 pmol/l, means±SEM, n = 12). The competition binding studies with agonists and antagonists showed the affinity and stereoselectivity to be expected for b-adrenergic receptors. The unlabelled selective b2-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 was about 1500 times more potent in inhibiting ICYP binding than was the b1-selective adrenoceptor antagonist CGP 20712A. It is, therefore, concluded that in intact equine lymphocytes ICYP labels a class of functional b-adrenoceptors, that belong predominantly (> 90 %) to the b2-adrenoceptor subtype. A minor (< 10 %) b1-adrenoceptor component, however, cannot be completely ruled out. The binding sites were stereoselective, as the (-)-isomer of propranolol was about 40 times more potent to inhibit ICYP binding than was the (+)-isomer. Agonists competed for specific binding with a rank order of potency (-)-isoprenaline > (-)-adrenaline > (-)-noradrenaline, which is typical for a b2-subtype of adrenergic receptor; the same order of potency was obtained for agonist-induced stimulation of lymphocyte cyclic AMP content. Thus, it can be concluded that ICYP is a promising compound for the reliable determination of the binding characteristics of b-adrenoceptors of equine lymphocytes and besides that, this might give an insight in providing physiologically significant information about the regulation of the b-adrenergic receptor system. Based upon this study, we further investigated, in 12 healthy thoroughbred horses, the effects of the b2-agonist clenbuterol and the glucocorticoid dexamethasone on the lymphocyte b2-adrenenergic receptor density and affinity as well as on its responsiveness (assessed by lymphocyte cyclic AMP responses to 10 µmol/l (-)-isoprenaline). Clenbuterol (2Ž0.8µg/kg/d, i. v. for 12 days) decreased ICYP binding sites only 48 h after application by ~30-40 %; concomitantly, lymphocyte cAMP response to (-)-isoprenaline was significantly reduced (p < 0.05, n = 8). The values remained at these low levels throughout the following 10 days of treatment. After withdrawal of clenbuterol the density and responsiveness of b2-adrenoceptors gradually increased, reaching pre-drug levels after 4 days. Next the effects of dexamethasone on clenbuterol-induced desensitisation were studied. Administration of dexamethasone (1Ž0.1mg/kg/d, i. v. for five days) immediately after clenbuterol withdrawal accelerated b2-adrenergic receptor recovery (p < 0.05, n = 4): only 24 hours after administration dexamethasone restored the number of binding sites and cAMP response to (-)-isoprenaline to levels statistically indistinguishable from the values before starting clenbuterol treatment. Three days after dexamethasone administration the density of lymphocyte b2-adrenoceptors was further increased about two fold the pre-treatment values, and this increase declined gradually after dexamethasone withdrawal, reaching baseline values after 4 days. Furthermore, in groups simultaneously exposed to both drugs dexamethasone completely prevented clenbuterol-induced decrease in lymphocyte b2-adrenoceptor density and responsiveness. No significant change was observed in the dissociation constant and, thus, in the affinity of ICYP to b-adrenoceptors remained unchanged during or after treatment with either clenbuterol or dexamethasone. It is concluded that dexamethasone (glucocorticoids) can reverse and prevent clenbuterol-induced down-regulation of the lymphocyte b2-adrenoceptors and thus, a combined therapy with clenbuterol and dexamethasone may be potentially beneficial in COPD of horses.

München, Techn. University, Diss., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2000. / Zsfassung in dt. Sprache. - Auch als CD-Rom.

University, Diss., 2001--Köln.

Die Organtransplantation stellt ein therapeutisches Verfahren für Patienten mit irreversibel geschädigten Organen dar. Doch weist dieses Behandlungskonzept weiterhin einen wesentlichen Nachteil auf: noch immer wird der langfristige Erfolg der Therapie zu oft durch die so genannte Transplantatabstoßung gefährdet. Hierbei handelt sich um eine vom Organtransplantat ausgelöste Immunantwort, die zu dessen Zerstörung führt. Die derzeit einzige Möglichkeit eine Abstoßung zu verhindern, ist die Unterdrückung des Immunsystems mit so genannten Immunsuppressiva. Auch wenn diese erstmals in den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts erfolgreich eingesetzten Medikamente ständig verbessert werden, bleiben die von ihnen ausgelösten Nebenwirkungen weiterhin ein ernstzunehmendes Problem. Sie unterdrücken die gesamte körpereigene Abwehr, was zum Schutz der Organtransplantate vor Abstoßung gewünscht ist, doch fördern sie hierdurch die Entstehung von Tumoren und Infektionen. Bei der Transplantatabstoßung handelt es sich um eine von CD4+ T-Lymphozyten ausgelöste Immunantwort. Diese Lymphozyten werden von allogenen Peptiden, die von Spender-MHC-Molekülen stammen, über den indirekten Weg der Alloantigenerkennung aktiviert. An der Transplantatabstoßung ist zwar eine Vielzahl von Alloantigenen beteiligt, doch ist es möglich, Peptidantigene zu identifizieren, die einen nachweisbaren Effekt auf die Transplantatabstoßung ausüben. So wurde in der eigenen Arbeitsgruppe die für die Abstoßung allogener Organtransplantate beteiligten MHC (RT1u)-Peptidantigene charakterisiert. Insbesondere die Bedeutung des aus 19 Aminosäuren bestehenden allogenen Peptids P1 für die Alloimmunantwort wurde intensiv untersucht. So weisen P1-spezifische T-Lymphozyten ein ausgeprägtes Th1-Cytokin-Muster auf und beschleunigen die Abstoßung von Wistar-Furth-Organtransplantaten in Lewis-Ratten. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des T-Zellrezeptor Vb-Repertoires P1-spezifischer T-Lymphozyten mit der Methode des PCR-ELISA. In einem ersten Schritt wurden Thymozyten und T-Lymphozyten unterschiedlicher Lymphknotenstationen untersucht. Thymozyten exprimierten alle 22 TCR Vb-Elemente und einzig TCR Vb14 war überrepräsentiert. Die T-Lymphozyten der cervikalen, mesenterialen, iliakalen und poplitealen Lymphknoten zeigten ebenfalls eine charakteristische Überexpression bestimmter TCR Vb-Elemente. So exprimierten cervikale T-Lymphozyten bevorzugt die TCR Vb-Elemente 2, 6, 8.3 und 16, mesenteriale T-Lymphozyten die TCR Vb-Elemente 2, 4, und 8.1, illiakale T-Lymphozyten die TCR Vb-Elemente 2 und 6 und popliteale T-Lymphozyten die TCR Vb-Elemente 2, 4 und 9. Die Immunisierung mit dem nicht-immunogenen Kontrollpeptid (Autoantigen) Ac führte zu einer leichten Veränderung des T-Zellrezeptor-Repertoires, bei der die TCR Vb-Elemente 14 und 16 überexprimiert waren. Das Adjuvant TiterMax beeinflusste kaum das TCR Vb-Repertoire. Die Immunisierung mit dem allogenen Peptid P1 führte zu einer eindeutigen Beeinflussung des T-Zellrezeptor-Repertoires. Popliteale T-Lymphozyten, die 7 Tage nach Immunisierung analysiert wurden, zeigten ein Repertoire, bei dem die TCR Vb-Elemente 15, 16, 17 und 20 überexprimiert waren. Dieses Repertoire war am Tag 3 nach Immunisierung noch nicht so ausgebildet. Wurden die antigenspezifischen T-Lymphozyten nach ihrer Isolierung mit P1 in vitro restimuliert, so waren in diesem T-Zellrezeptor-Repertoire die TCR Vb-Elemente 8.3, 15, 16 und 20 überexprimiert. Zum Vergleich: in naiven T-Lymphozyten waren die Vb-Elemente 2, 4 und 9 überexprimiert. Damit war es zu einer deutlichen Verschiebung im T-Zellrezeptor-Repertoire antigenspezifischer T-Lymphozyten gekommen, die auf das Peptidantigen P1 zurückzuführen ist. Mit der Methode des PCR-ELISA wurde das T-Zellrezeptor-Repertoire antigenspezifischer T-Lymphozyten bestimmt. Hiermit sind wesentliche Voraussetzungen geschaffen worden, um T-Zellklone zu etablieren und ihre Bedeutung für die Transplantatabstoßung genauer zu untersuchen. / Organ transplantation is an important medical therapy for patients with irreversibly damaged organs. However, this therapeutic intervention has a great disadvantage because the long-term success of organ allografts is still too often endangered by the so called allograft rejection, an immune response directed to the allograft and leading to its destruction. The major approach for the prevention and management of allograft rejection is to suppress the immune system with immunosuppressive agents. These agents were introduced into transplantation medicine in the 1960s and since that time they have been continually improved. However, their side effects remain a seriousness problem because the suppression of the immune defence inhibits the allograft rejection on the one hand but causes infections and increases tumour incidence on the other hand. The allograft rejection is mediated by CD4+ T lymphocytes and the responsible antigens recognized by them are allogenic peptides processed from donor MHC molecules. Although a large number of allgenenic peptides are involved in allograft rejection, it is possible to identify certain peptide antigens involved in allograft rejection. In our group allogeneic peptides from MHC class I molecules from Wistar Furth rats were investigated. The significance of the allogeneic peptide P1, consisting of 19 amino acids, in inducing allograft rejection was analysed in detail. P1-specific T lymphocytes demonstrated a Th1-cytokine dominated profile and accelerated the rejection of allografts in Lewis rats donated by Wistar Furth rats. The aim of this study was to characterise the T cell receptor (TCR) Vb repertoire of P1-specific T lymphocytes with the PCR-ELISA technique. First, thymocytes and T lymphocytes from different lymph nodes were analysed. Thymocytes expressed all 22 TCR Vb elements and only TCR Vb14 was overrepresented. The T lymphocytes of cervical, mesenteric, iliacal und popliteal lymph nodes also demonstrated a certain repertoire of overrepresented TCR Vb elements. In cervical T lymphocytes the expression levels of the TCR Vb elements 2, 6, 8.3 and 16 were increased; in mesenteric T lymphocytes the TCR Vb elements 2, 4 and 8.1; in illiacal T lymphocytes the TCR Vb elements 2 and 6; and in popliteal T lymphocytes the TCR Vb elements 2, 4 and 9. The immunisation with the autoantigen Ac led to a small variation of the TCR Vb repertoire and the TCR Vb elements 14 and 16 were overrepresented. The adjuvant TiterMax did not influence the TCR Vb repertoire. In contrast, the immunisation with the allogeneic peptide P1 clearly influenced the T cell receptor repertoire. Popliteal T lymphocytes analysed 7 days after immunisation demonstrated a TCR Vb repertoire where the TCR Vb elements 15, 16, 17 und 20 were overrepresented. On day 3 after immunisation this repertoire was not yet clearly developed. In P1-specific T lymphocytes restimulated in vitro the expression levels of the TCR Vb elements 8.3, 15, 16 and 20 were increased. In comparison, in naïve T lymphocytes the TCR Vb elements 2, 4 and 9 were overrepresented. These results underline that the immunisation with peptide P1 induces a characteristic TCR Vb repertoire. The TCR Vb repertoire of P1-specific T lymphocytes was analysed with the PCR-ELISA technique. The determination of the T cell receptor repertoire is a prerequisite to establish T cell clones and to analyse their involvement in allograft rejection.

Die Lebertransplantat-Spontantoleranz ist eines der immunologisch beeindruckensten Phänomene. Die Fähigkeit, Toleranz für sich selbst und auch für mittransplantierte Organe über die MHC Barriere hinweg zu induzieren, ist einzigartig. Dies steht im Gegensatz zum zentralen Dogma der Transplantationsimmunologie, wonach MHC differente Organe nach Transplantation ohne Immunsuppression irreversibel zerstört werden. Ziel der Arbeit war, die verschiedenen intrahepatischen CD4+ T-Lymphozyten durchflusszytometrisch zu charakterisieren und eine in vitro Aktivierung naiver Leukozyten mit der in vivo zu vergleichen. Dies wurde mit der Fragestellung verknüpft, ob es einen möglichen Phänotyp regulatorischer intrahepatischer T-Lymphozyten gibt, der für die Induktion von Spontantoleranz verantwortlich ist. Auch wurde das Zytokinmuster dieser intrahepatischen T-Lymphozyten bestimmt, um eine mögliche funktionelle Aussage treffen zu können. Für die Versuche wurden Lebertransplantationen von Lewis-Spendertieren (LEW) auf Dark Agouti (DA) Empfänger durchgeführt. Die Transplantate wurden dauerhaft (> 300 Tage p.op.) spontan, d.h. ohne Immunsuppression toleriert. Andere vaskularisierte Organe, wie z.B. Herzen, wurden von DA-Empfängern abgestoßen. Die intrahepatischen und Milz T-Lymphoyzten wurden an den Tagen 3, 30 und 100 nach Transplantation untersucht. Unmittelbar nach Lebertransplantation kam es zu einem massiven Anstieg der intrahepatischen Leukozyten. Das Leberinfiltrat wurde dabei von aktivierten CD4+ T-Lymphozyten dominiert (ca. 23 Prozent CD4+CD45RCneg T-Lymphozyten), von denen ca. 50 Prozent den IL-2 Rezeptor exprimierten. Als Zeichen einer intrahepatischen Immunantwort wurde gewertet, dass das Verhältnis aktivierter CD4+CD45RCneg zu ruhenden CD4+CD45RCpos T-Lymphozyten dynamisch war. Zur funktionellen Charakterisierung der verschiedenen Populationen an CD4+ T-Lymphozyten wurden die Zytokinmuster dieser Zellen mit zwei verschiedenen Verfahren bestimmt. Zum einen wurden die sezernierten Zytokine INF-gamma, TNF-alpha, IL-10 und IL-13, zum anderen deren spezifische mRNAs semiquantitativ nachgewiesen. Für die sezernierten Zytokine waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Subpopulationen nachzuweisen. Bei der Analyse der mRNA-Transkription zeigte sich jedoch, dass die CD4+CD45RCneg T-Lymphozyten stärker die Th2-Zytokine IL-10 und IL-13 exprimierten, während die CD4+CD45RCpos T-Lymphozyten stärker die Th1-Zytokine INF-gamma, TNF-alpha exprimierten. In dieser Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die CD4+CD45RCpos und CD4+CD45RCneg T-Lymphozyten jeweils heterogene Zellpopulationen sind, die noch in CD4posCD45RCpos, CD4hochposCD45RChochpos, CD4posCD45RCneg und CD4hochposCD45RCneg T-Lymphozyten differenziert werden können. Die CD4hochposCD45RChochpos repräsentieren dabei mit großer Wahrscheinlichkeit naive T-Lymphozyten, wohingegen die CD4hochposCD45RCneg aktivierte T-Lymphozyten darstellen. Wir gehen davon aus, dass die CD4posCD45RCpos T-Lymphozyten auch ruhende Gedächtniszellen und die CD4posCD45RCneg T-Lymphozyten auch aktivierte Gedächtniszellen enthalten. Der Nachweis intrahepatischer Gedächtnis T-Lymphoyzten zeigt, dass die Leber immunologisch ein überaus interessantes Organ repräsentiert. Ihre Fähigkeit zur Induktion von Spontantoleranz ist einzigartig, so dass von diesem Organ weitere grundlegende Erkenntnisse zum Phänomen der Toleranz erwartet werden. / Summary of Paul Schmitz’s thesis with the title “Mechanisms of immunological tolerance after liver transplantation: Analysis of the cytokine pattern of intrahepatic CD4+ CD45pos and CD4+ CD45RCneg T lymphocytes” Without the requirement for immunosuppression liver allografts of some rat strain combinations are spontaneously accepted despite a complete mismatch of molecules of the major histoincompatibility complex (MHC). Furthermore, liver grafts may induce immunological tolerance to a subsequent heart, kidney or skin graft from the same donor. Without liver grafts these organs are destroyed by the recipient’s immune system. The survival of liver grafts is, however, not related to a failure of the recipient to mount an immunological response against donor MHC molecules. An immune-mediated damage of the transplanted livers with an accompanying infiltrate and up-regulation of pro-inflammatory cytokines is temporarily observed. This is in contrast to the well-established maxim of transplantation immunology that rejection will occur when donor and recipient transplantation antigens are mismatched, especially those encoded by MHC. The liver contains a large population of resident and migratory T lymphocytes. Since T lymphocytes mediate both rejection and tolerance, the aim of the study was to phenotype intrahepatic CD4+ T lymphocytes by flow cytometry. In addition, secreted cytokines as well as cytokine-specific mRNA were analysed. With these investigations we wanted to identify an intrahepatic T cell subpopulation with regulatory properties. For the orthotopic liver transplantation we used rats of the inbred strains Lewis, as donors, and Dark Agouti, as recipients. The liver grafts in this strain combination survived permanently (>300 days), although heart grafts from the same donor were rejected. T lymphocytes isolated from liver grafts and spleens were analysed on days 3, 30, and 100 after transplantation. The amount of immune cells from the recipient increased dramatically in liver allografts within 3 days after transplantation. With approximately 23% activated CD4+ CD45RCneg dominated this infiltrate and the ratio of activated CD4+CD45RCneg and rested CD4+CD45RCpos increased. This observation was interpreted as an intrahepatic immune response mediated by infiltrated immune cells. The presence of the cytokines INF-gamma, TNF-alpha, IL-10 und IL-13 was analysed in the supernatant of isolated intrahepatic T incubated for 3 days in vitro. Cytokine-specific mRNA was semiquantified by ELISA-PCR. The supernatants did not demonstrate any differences between both subpopulations. In contrast, the results of the ELISA-PCR revealed increased mRNA levels of the Th2 cytokines IL-10 and IL-13 for CD4+CD45RCneg T lymphocytes and increased levels of the Th1 cytokines INF-gamma and TNF-alpha for CD4+CD45RCpos T lymphocytes. In the present study it was also shown that both populations of CD4+CD45RCpos (rested) and CD4+CD45RCneg (activated) T lymphocytes were heterogeneous and divisible into CD4posCD45RCpos, CD4strong pos CD45RCstrong pos and CD4pos CD45RCneg, CD4strong posCD45RCneg T cells by flow cytometry. The CD4strong pos CD45RCstrong pos T cells may also represent naïve T cells, whereas the CD4strong pos CD45RCneg may be a certain type of activated T cells. We have evidence that rested memory T lymphocytes are located within the population of CD4pos CD45RCpos T lymphocytes and activated memory T lymphocytes are present within the population of CD4pos CD45RCneg T lymphocytes. The proof of intrahepatic memory T cells indicates that the liver represents an immunologically important organ. Its ability to induce spontaneous tolerance in many fully mismatched donor recipient combinations is unique and additional studies are necessary to further explore the true potential of intrahepatic T cells for tolerance induction.

T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains. / Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation.

Ein durch „Ca2+ Release Activated Ca2+ (CRAC)“-Kanal vermittelter Ca2+-Einstrom ist unverzichtbar für die vollständige Aktivierung von T-Zellen und eine produktive Immunantwort. Im Jahr 2006 führte die Entdeckung des transmembranen Proteins Orai1, einer porenbildenden Untereinheit des CRAC-Kanals, zu einem besseren Verständnis dieses Signalweges. Eine Mutation in Orai1 hat durch die Aufhebung der CRAC-Kanal Funktion eine schwere kombinierte Immundefizienz (SCID) zur Folge (Feske, S. et al. 2006). Die im Rahmen dieser Arbeit präsentierten Experimente hatten die nähere Erforschung der Rolle von Orai1 in Bezug auf die Aktivierung und Entwicklung von Lymphozyten sowie auf die pathogenetische Bedeutung für humane Immundefektsyndrome zum Ziel. So konnte hier durch das Sequenzieren genomischer DNA mehrerer SCID-Patienten eine neue Mutation in Orai1 aufgedeckt werden. Mithilfe intrazellulärer Durchflusszytometrie und Real-Time-PCR gelang es, die Expression von Orai1 auf humanen und murinen Immunzellen, einschließlich T- und B-Lymphozyten, nachzuweisen. Darüber hinaus wurden Orai1 „knock-in“ Mäuse analysiert, welche transgen für eine bei zwei SCID-Patienten gefundene Mutation (R91W) (Feske, S. et al. 2006) sind. Dadurch war es möglich die Funktion von Orai1 und die des CRAC-Kanal vermittelten Ca2+-Einstroms für die Entwicklung und Aktivierung von Lymphozyten zu analysieren. Diese transgenen Mäuse stellen das zu diesem Zeitpunkt erste Tiermodell dar, mit dessen Hilfe die Rolle von CRAC-Kanälen in vivo studiert werden kann.

Bis heute sind über 50 Chemokine und fast 20 Chemokinrezeptoren identifiziert. Dennoch gibt es Chemokine und Chemokinrezeptoren, deren zugehörige Rezeptoren bzw. Liganden noch nicht bekannt sind. PARC (=CCL18) ist ein ausschließlich in Primaten nachgewiesenes, bisher nur wenig charakterisiertes, im Organismus jedoch weit verbreitetes Chemokin, für das bisher noch kein Rezeptor beschrieben wurde. Die Wirkung dieses Chemokins wurde bisher vor allem an T Lymphozyten nachgewiesen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von PARC auf B-Lymphozyten und das Vorkommen des putativen PARC-Rezeptors DRY12. Dabei wurden B-Zellen von CLL Patienten sowie mehrere standardisierte B-Zelllinien als Untersuchungsgut verwendet. In funktionellen Assays (Kalziummobilisation, Aktinpolymerisation und Chemotaxis) wurde die Wirkung von PARC auf diese Zellen charakterisiert. Untersuchungen zu beteiligten Signalkaskaden wurden durch Einsatz von spezifischen Inhibitoren (Pertussis-Toxin) und mittels Western Blot durchgeführt. Weiterhin wurde das Vorkommen des putativen PARC-Rezeptors DRY12 bei den verschiedenen B Lymphozyten mittels Antikörperfärbung und RT-PCR sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene nachgewiesen. Der Nachweis der genauen Lokalisation des Rezeptors in der Zelle erfolgte mittels Immunfluoreszenzcytologie. Abschließend wurde vergleichend das Vorkommen des DRY12 im Lymphknoten von CLL-Patienten und gesunden Spendern untersucht. PARC löst bei den B-Zellen der CLL-Patienten die Polymerisation von Aktin aus. Es induziert jedoch keine gerichtete Migration der Zellen. PARC wirkt auf die in dieser Arbeit untersuchten B-Zellen also nicht als Chemokin im klassischen Sinne. Seine Wirkung besteht möglicherweise in einem synergistischen Effekt, indem es im Zusammenspiel mit anderen Faktoren die Migration der Zellen beeinflusst. Weiterhin wäre denkbar, dass PARC das Verhalten von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen beeinflusst. Die beteiligte Signalkaskade beinhaltet ein Pertussis-Toxin-sensitives Gi-Protein und die Aktivierung der p42/44-MAP Kinase. Ein intrazellulärer Einstrom von Ca2+ spielt bei der Wirkungsvermittlung von PARC keine Rolle. Der putative PARC-Rezeptor DRY12 konnte bei verschiedenen B-Zellen in unterschiedlicher Intensität nachgewiesen werden. Die Expression des DRY12 scheint sowohl auf Ebene der mRNA als auch auf Proteinebene durch multiple Faktoren reguliert zu sein. Dazu gehören z.B. der Reifungs- und Aktivierungszustand der Zellen oder die Kultivierungsdauer nach dem Auftauen der Zellen bis zur Durchführung des Versuchs. Bisher konnten jedoch keine entsprechenden Zusammenhänge nachgewiesen werden. Der DRY12 ist demnach kein konstitutiv exprimierter Rezeptor. Durch Immunfluoreszenzcytologie konnte die Lokalisation des Rezeptormoleküls auf der Zelloberfläche gezeigt werden. Im Lymphknoten wird DRY12 v.a. von Lymphozyten exprimiert. Bei Makrophagen konnte das Rezeptorprotein nicht nachgewiesen werden. In den Lymphknoten von CLL-Patienten exprimieren die Lymphozyten deutlich mehr DRY12 als Lymphozyten im Gewebe gesunder Individuen. Ein direkter Zusammenhang zwischen Rezeptorexpression und Reaktion auf PARC konnte nicht sicher aufgezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit schließen aber auch nicht aus, dass PARC ein möglicher Bindungspartner von DRY12 ist. Bei der Wirkungsvermittlung spielen vermutlich auch andere Botenstoffe und weitere Faktoren eine Rolle, indem sie die Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber PARC bzw. die Rezeptorexpression des DRY12 beeinflussen. Hinsichtlich der Frage, ob es sich bei DRY12 um einen Rezeptor für PARC handelt, kann diese Untersuchung zu keinem abschließenden Ergebnis gelangen, so dass dieser Aspekt in weiterführenden Analysen eingehender betrachtet werden sollte. / Today there are more than 50 chemokines and almost 20 chemokine receptors described. Despite growing knowledge, the ligands for some orphan chemokine receptors have not been identified and for several chemokines the receptor has not been discovered. PARC (=CCL18) is one of these chemokines for which the receptor has not been recognized. It has been detected in primates only and, despite being widely spread in the organism, it is still poorly characterized. Up to now, the effects of PARC were mainly shown on T-lymphocytes. Therefore, the objective of this study was to investigate the function of PARC and the expression of the putative PARC-receptor DRY12 in B-lymphocytes. For the purpose of the present study, B-CLL-cells and several lymphocytic B-cell-lines served as models to cover different stages of B-cell maturation. In order to characterize the effect of PARC, several functional assays (calciummobilisation, actinpolymerisation and chemotaxis), specific inhibitors (pertussis toxin) and Western Blotting were used. Expression analyses of the DRY12-receptor were performed by FACS-analysis, RT-PCR and immunofluorescence cytochemistry. In addition, lymph nodes from patients with CLL and healthy donors were stained immunohistochemically. In B-CLL-cells, PARC stimulation leads to phosphorylation of p42/44-MAP-Kinase and polymerization of actin, which can be inhibited by pertussis toxin, but does not induce calcium signaling or chemotactic migration. In this case, PARC is no classical chemokine but may act as synergist to potentiate the effect of other chemokines or may influence the behavior of hematopoetic stemm-cells. The results of the study show expression of the putative PARC-receptor DRY12 present on several subsets of B lymphocytes. As they showed different intensity of expression, DRY12 may be regulated by different factors in translation as well as transduction. Among these factors might be their current state of maturation and activation and the time period from revitalization to the start of the experiments. The reasons for these differences are still unknown. According to these findings, the receptor is not constitutively expressed, but may be itself regulated by several chemokines and other factors. DRY12 is located at the surface of the cell, as shown by immunocytochemistry. In lymph nodes, particularly lymphocytes but not macrophages express DRY12. In lymph nodes of CLL-patients lymphocytes express much more DRY12 than in healthy samples. However, it could not be proved that DRY12 is the agonistic receptor for PARC, as the expression of DRY12 did not completely correlate with the effects on PARC stimulation. But results of this study do not exclude this possibility either, as different factors are considered to influence the effect of PARC and the expression of DRY12 in B-cells. Although there are hints to it, from this study we can not conclude that DRY12 is the agonistic receptor for PARC. Therefore, further investigation is necessary to find the answer to this question.

Bei der Altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) handelt es sich um eine Erkrankung des Auges, die die Macula lutea, die Stelle des schärfsten Sehens betrifft. Sie ist verbunden mit der Degeneration von RPE-Zellen, die zur Dystrophie von Photorezeptoren und damit zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Eine ähnliche Pathophysiologie ist bei der sogenannten Retinalen Pigmentepitheldystrophie (RPED) des Hundes zu beobachten. Die Transplantation von gesunden RPE-Zellen in das betroffene Gebiet stellt eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Die Transplantatabstoßung als Kom-plikation schränkt die klinische Anwendung ein. Eine beim Patienten nach Transplantation lebenslang durchgeführte systemische Immunsuppression ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Deshalb bietet die Gentherapie unter Einbezug immunsuppressiver Zytokine wie beispielsweise des Interleukin-10 (IL-10) eine Lösung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein selbst konstruierter IL-10-Expressionsvektor (Plasmid pCIneoIL-10) mittels Gentransfer in humane RPE-Zellen in vitro eingebracht. Untersucht wurde die Wirkung des sezernierten IL-10 auf die Proliferation von allogenen T-Lymphozyten mit und ohne allogene Makrophagen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC). Neben humanen Spender RPE-Zellen (Spender-hRPE-Zellen) wurde eine immortalisierte Permanent-Zelllinie (hTERT-RPE1-Zellen) eingesetzt, deren Hauptvorteil in einer gleichbleibend hohen Wachstumsrate lag. Als transientes Transfektions-system für den Transfer von IL-10-DNA in hRPE-Zellen wurden kationische Lipide gewählt. Drei verschiedene Lipidformulierungen wurden miteinander verglichen und das optimale Transfektionsreagenz:DNA-Verhältnis, mit dem die höchste Transfektionseffizienz erreicht werden konnte, evaluiert. Eine Transfektionseffizienz von 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise 10,3 ± 4,5 % (Spender-hRPE-Zellen) konnte erreicht werden. Die Transfektion hatte weder einen negativen Einfluss auf die Vitalität der hRPE-Zellen, noch wurde der natürliche Zelltod, die Apoptose, erhöht. Die IL-10-mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Lediglich bei den transfizierten hRPE-Zellen konnte IL-10-mRNA gefunden werden. Mittels ELISA konnte das IL-10-Protein gemessen werden. Die Sekretion des IL-10 in den Kulturüberstand von transfizierten hRPE-Zellen wurde dafür über einen Zeitraum von 7 Tagen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die maximale IL-10-Proteinkonzentration bei beiden Zelllinien am Tag 3 mit Werten von 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1-Zellen) und 3,1 ng/ml (Spender-hRPE-Zellen) lag. Es bestand überdies eine positive Korrelation zwischen Transfektionseffizienz und synthetisiertem IL-10. Es wurde außerdem gezeigt, dass durch Stimulation mit dem immunmodulatorischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-g) hRPE-Zellen MHC Klasse II-Moleküle vermehrt exprimierten. Damit sind sie ebenso wie die Makrophagen zur Antigenpräsentation fähig. Die Wirkung des von den transfizierten hRPE-Zellen sezernierten IL-10 auf die Proliferation von T-Lymphozyten wurde zwischen Tag 2 und Tag 6 (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise zwischen Tag 2 und Tag 4 (Spender-hRPE-Zellen) photometrisch untersucht. Die Proliferation allogener T-Lymphozyten mit beziehungsweise ohne Makrophagen konnte durch das sezernierte IL-10 supprimiert werden. Bei den hTERT-RPE1-Zellen lag ohne die Anwesenheit von professionellen APC am Tag 6 eine signifikante Reduktion der T-Lymphozytenproliferation vor, während bei Kokultivierung mit Makrophagen Signifikanzen am Tag 5 und Tag 6 erkennbar waren. Die immunsuppressive Wirkung von IL-10 konnte mittels Anti-IL-10-Antikörper neutralisiert werden. Damit wurde bewiesen, dass die proliferations-supprimierende Wirkung auf IL-10 zurückzuführen war. Diese Ergebnisse könnten demnach neue Möglichkeiten zur Verhinderung einer Abstoßungsreaktion nach RPE-Zelltransplantation bei Patienten mit AMD eröffnen / Age-related macular degeneration (AMD) is a disease of eyes affecting the macula lutea, the area of the retina with the highest density of retinal pigment epithelial cells (RPE cells). The disease is characterized by degeneration of RPE cells resulting in dystrophy of photoreceptors and finally loss of central vision. Transplantation of healthy RPE cells is a promising possibility for therapy but rejection of the allotransplant limits clinical application. One way to avoid this complications is a systemic immunosuppression of the recipient but this is combined with many side effects. In this thesis a self-constructed IL-10 expression vector (plasmid pCIneoIL-10) has been transferred into human RPE cells in vitro by gene transfer. In addition to human donor RPE cells a permanent RPE cell line (hTERT-RPE1 cells) was employed. Kationic lipids were used as transient transfection system for transfer of pCIneoIL-10 into hRPE cells. Three different lipid formulations and various ratios of transfection reagent:DNA were evaluated for highest transfection efficacy. With the optimized protocols a transfection efficacy of 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1 cells) and 10,3 ± 4,5 % (donor hRPE cells) was achieved. A negative influence on the viability of the hRPE cells after transfection was not observed. The IL-10 mRNA expression was analysed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Only in transfected hRPE cells the IL-10 mRNA-amplicon with 383 bp in size was found. Secretion of IL-10 protein in the cell culture supernatants of transfected hRPE cells was investigated using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) daily for 7 days. The IL-10 protein concentrations peaked at day 3 with 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1 cells) and 3,1 ng/ml (donor hRPE cells). The amount of secreted IL-10 positively correlated with transfection efficacy. After stimulation with the immunmodulatory cytokine interferon-gamma (IFN-g) the expression of MHC class II molecules on hRPE cells is increasing. Therefore they are able to present antigens similar to macrophages. Hence, the effects of recombinantly expressed IL-10 on the proliferation of allogeneic T lymphocytes were investigated both with and without allogeneic macrophages as professional antigen presenting cells (APC). Proliferation of T lymphocytes has been investigated colorimetrically between day 2 and day 6 (hTERT-RPE1 cells) and day 2 and day 4 (donor hRPE cells) respectively. The proliferation of allogeneic T lymphocytes with and without macrophages could be suppressed by the secreted IL-10. Signifikant reduction of proliferation was observed at day 6 in absence of professional APC (14,1 ± 1,1 % to 100% of untransfected control) and between day 5 (44,1 ± 4,9 %) and day 6 (37,4 ± 6,3%) in the presence of macrophages. It was possible to neutralize the immunosuppressive effect of IL-10 with anti-IL-10 antibodies. Proving that the suppressive effect of T lymphocyte proliferation was caused by IL-10. Thus, the specific IL-10 gene transfer into hRPE cells prior to transplantation may prevent rejection process and could prove a reliable method to help prevent loss of central vision due to AMD.