Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein.

One strategy to repair an injured or degenerated retina is to stimulate the replacement of damaged or dead neurons with cells derived from endogenous stem- or progenitor cells. A successful strategy requires knowledge about how the proliferation and differentiation of the endogenous cells are regulated. In particular, this knowledge will be important in the establishment of protocols that produce sufficient numbers of specific neurons. The main aim of this thesis was to find and characterise factors regulating the proliferation and differentiation of retinal progenitor cells (RPCs) and hence, contribute to the knowledge of how to use progenitor cells for retinal repair.    The major result in this thesis is that GABA contributes to and maintains RPC proliferation. Inhibition of GABAA receptors decreases the proliferation of non-pigmented ciliary epithelial (NPE) cells and RPCs in the intact retina. We propose that this effect is mediated through changes in the membrane potential and voltage-gated calcium channels, which in turn regulate components of the cell cycle. Furthermore, we show that one of the endogenous RPC sources, the Müller cells, consists of two subpopulations based on Pax2 expression. This is interesting because Pax2 may suppress the neurogenic potential, characterised by de-differentiation and proliferation, in Müller cells. Finally, we show that over-expression of FoxN4 induces differentiation-associated transcription factors in the developing chick retina. However, FoxN4 over-expression did not trigger differentiation of NPE cells. These results indicate that the intrinsic properties of the RPCs are determinant for FoxN4-induced differentiation. The results presented in this thesis advance our understanding of how specific cells may be generated from different sources of RPCs. Our results show that the different sources are highly diverse in their potential to proliferate and produce neurons. GABA, Pax2 and FoxN4 may be factors to consider when designing strategies for retinal repair. However, the results indicate that the specific responses to these factors are highly associated with the specific properties of the progenitor cells. / <p>Doctor of Philosophy <strong>(Faculty of Medicine)</strong></p>

The volume homeostasis of retinal glial cells is mediated by an autocrine purinergic mechanism of ion channel opening which is activated in response to a decrease in the extracellular osmolarity. Here, I show that erythropoietin (EPO) prevents the osmotic swelling of glial somata in retinal slices from control and diabetic rats, with a half-maximal effect at approximately 0.01 nM. The downstream signaling evoked by EPO includes a release of vascular endothelial growth factor from the cells which was blocked by Janus kinase and extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2 inhibitors. Transactivation of kinase insert domain-containing receptor/fms-like tyrosine kinase 1 (KDR/flk-1) evokes a calcium-dependent, exocytotic release of glutamate, followed by activation of group I/II metabotropic glutamate receptors which results in calcium-independent release of ATP and adenosine from the cells. The final step in this cascade is the activation of adenosine A(1) receptors which results in protein kinase A- and phosphoinositide 3-kinase-mediated opening of potassium and chloride channels. EPO receptor protein was immunohistochemically localized to the inner retina and photoreceptor inner segments. In isolated glial cells, EPO receptor protein is selectively localized to fibers which traverse the inner nuclear layer in situ. Inhibition of glial swelling might contribute to the neuroprotective action of EPO in the retina under pathological conditions.

Müllerzellen - die dominierenden Gliazellen der Netzhaut - üben vielfältige Funktionen und Aufgaben im retinalen „Zellnetzwerk“ aus. Ihre wohl wichtigste Funktion ist die Aufrechterhaltung der Volumen- und Ionenhomöostase der Retina. Forschungsergebnisse der letzten Jahre deuten darauf hin, dass pathologische Veränderungen in der Volumenregulation von Müllerzellen bei vielen Erkrankungen der Netzhaut eine bedeutende Rolle spielen. Diese Promotionsarbeit befasst sich mit morphologischen Veränderungen in der Netzhaut von Wildtypmäusen sowie von drei Mausstämmen mit genetischen Veränderungen (Überexpression von dnSNARE, P2Y1-defizient, IP3-R2-defizient) unter pathologischen Bedingungen. In den experimentellen Untersuchungen fand das in Vorarbeiten bereits etablierte Ischämie-Reperfusions-Modell Anwendung. Es ist bekannt, dass Müllerzellen nach retinaler Ischämie Veränderungen durchmachen, die als reaktive Gliose bezeichnet werden. Reaktive Müllerzellen sind nicht mehr in der Lage, bestimmte Funktionen zu erfüllen, die sie in der gesunden Netzhaut haben, dazu gehört eine Einschränkung der Fähigkeit zur Volumenregulation. Ziel der Arbeit war es erstens, eine Charakterisierung der Mausnetzhäute hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der Retina vorzunehmen und zweitens zu untersuchen, inwiefern sich eine Störung der Müllerzellfunktion – wie sie bei allen drei genetisch veränderten Mauslinien vorliegt – auf das Überleben der Nervenzellen unter extremen Stressbedingungen wie z.B. einer Ischämie auswirkt. Denn gerade unter den mit einer Ischämie einhergehenden Bedingungen sollte die Funktion der Müllerzellen zum Erhalt der retinalen Ionen- und Volumenhomöostase von entscheidender Bedeutung sein.

Die vorliegende kumulative Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Antje Grosche umfasst neben einer Einführung in die Physiologie der dominierenden Gliazellen der Netzhaut – der Müllerschen Gliazellen - zehn Originalarbeiten zur Bedeutung von Gliotransmittern für die Volumenregulation der Müllerzellen. Eine effiziente Volumenregulation gilt als Voraussetzung dafür, dass Müllerzellen ihrer Rolle als stabilisierendes Element hinsichtlich des Ionen- und Wasserhaushaltes in der Netzhaut gerecht werden können. Aus Vorarbeiten war bekannt, dass Müllerzellen typische Eigenschaften, wie die hohe Kaliumleitfähigkeit ihrer Membranen und damit einhergehend eine ausgeprägte Fähigkeit zur Volumenregulation, in der pathologisch veränderten Netzhaut verlieren (Pannicke et al., 2004; Wurm et al., 2006b). Diese Reaktion der Müllerzellen auf Netzhautschädigungen wird als gliotische Aktivierung bezeichnet und konnte in der soeben beschriebenen Ausprägung im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit an Netzhäuten von Patienten mit uvealem Melanom bestätigt werden (Grosche et al., 2012). Weiterhin wurde die Relevanz einer in früheren Arbeiten identifizierten glutamaterg-purinergen Signalkaskade für die Funktion von gliotischen Müllerzellen detailliert untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Habilitationsschrift wird nachgewiesen, dass sowohl im Modell für eine akute Schädigung der Netzhaut (Netzhautablösung im Schwein, Wurm et al., 2011), als auch bei einer chronischen Erkrankung (Streptozotocin-induzierter Diabetes in der Ratte, Wurm et al., 2008c) durch Aktivierung besagter Kaskade trotz verminderter Kaliumströme die Volumenregulation der Zellen wieder hergestellt werden kann. Ein zweiter Schwerpunkt der Untersuchungen war die umfassende Analyse der Expressions-muster und Funktion der an der Volumenregulation beteiligten Rezeptoren (insbesondere P2Y-Rezeptoren) in juvenilen und adulten Müllerzellen. Daten über die Differenzierung von Müllerzellen der Ratte während der ersten drei Postnatalwochen unterstreichen die herausragende Bedeutung von P2Y-Rezeptoren bzw. belegen deren Beteiligung an verschiedenen Müllerzellfunktionen (Volumenregulation, kalziumabhängige Signalwege). Interessanterweise wurden die meisten Effekte von ATP über die Aktivierung von P2Y1-Rezeptoren vermittelt (Wurm et al., 2009a, 2010). Zudem konnte durch Einsatz von P2Y1-Rezeptor-, IP3 Rezeptorsubtyp 2- und A1-Rezeptor-defizienten Mäusen belegt werden, dass ein störungsfreies Wirken der glutamaterg-purinergen Signalkaskade (neben der hohen Kaliumleitfähigkeit der Membranen) auch in unbehandelten Müllerzellen essentiell für deren Volumenregulation ist (Wurm et al., 2009b, 2010; Lipp et al., 2009). Im dritten Themenkomplex wurde der Frage nachgegangen, welche Mechanismen bei der Freisetzung der in die Volumenregulation involvierten Gliotransmitter eine Rolle spielen. So konnte eine exozytotische Ausschüttung von Glutamat bestätigt werden, während die Freisetzung von ATP primär durch Hemichannels (Linnertz et al., 2011; Brückner et al., 2012; Slezak et al., 2012) und die von Adenosin durch Nukleosidtransporter sowie extrazelluläre Degradation von ATP/ADP vermittelt wird (Wurm et al., 2010). Abschließend ordnet das Kapitel „Zusammenfassung und Ausblick“ die neu gewonnenen Erkenntnisse dieser Habilitationsschrift über die Rolle von Gliotransmittern für die Funktionen von Müllerzellen (einschließlich unveröffentlichter Daten aus weiterführenden Experimenten) für zukünftige Forschungsvorhaben ein.

The volume homeostasis of retinal glial cells is mediated by an autocrine purinergic mechanism of ion channel opening which is activated in response to a decrease in the extracellular osmolarity. Here, I show that erythropoietin (EPO) prevents the osmotic swelling of glial somata in retinal slices from control and diabetic rats, with a half-maximal effect at approximately 0.01 nM. The downstream signaling evoked by EPO includes a release of vascular endothelial growth factor from the cells which was blocked by Janus kinase and extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2 inhibitors. Transactivation of kinase insert domain-containing receptor/fms-like tyrosine kinase 1 (KDR/flk-1) evokes a calcium-dependent, exocytotic release of glutamate, followed by activation of group I/II metabotropic glutamate receptors which results in calcium-independent release of ATP and adenosine from the cells. The final step in this cascade is the activation of adenosine A(1) receptors which results in protein kinase A- and phosphoinositide 3-kinase-mediated opening of potassium and chloride channels. EPO receptor protein was immunohistochemically localized to the inner retina and photoreceptor inner segments. In isolated glial cells, EPO receptor protein is selectively localized to fibers which traverse the inner nuclear layer in situ. Inhibition of glial swelling might contribute to the neuroprotective action of EPO in the retina under pathological conditions.

Müllerzellen - die dominierenden Gliazellen der Netzhaut - üben vielfältige Funktionen und Aufgaben im retinalen „Zellnetzwerk“ aus. Ihre wohl wichtigste Funktion ist die Aufrechterhaltung der Volumen- und Ionenhomöostase der Retina. Forschungsergebnisse der letzten Jahre deuten darauf hin, dass pathologische Veränderungen in der Volumenregulation von Müllerzellen bei vielen Erkrankungen der Netzhaut eine bedeutende Rolle spielen. Diese Promotionsarbeit befasst sich mit morphologischen Veränderungen in der Netzhaut von Wildtypmäusen sowie von drei Mausstämmen mit genetischen Veränderungen (Überexpression von dnSNARE, P2Y1-defizient, IP3-R2-defizient) unter pathologischen Bedingungen. In den experimentellen Untersuchungen fand das in Vorarbeiten bereits etablierte Ischämie-Reperfusions-Modell Anwendung. Es ist bekannt, dass Müllerzellen nach retinaler Ischämie Veränderungen durchmachen, die als reaktive Gliose bezeichnet werden. Reaktive Müllerzellen sind nicht mehr in der Lage, bestimmte Funktionen zu erfüllen, die sie in der gesunden Netzhaut haben, dazu gehört eine Einschränkung der Fähigkeit zur Volumenregulation. Ziel der Arbeit war es erstens, eine Charakterisierung der Mausnetzhäute hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der Retina vorzunehmen und zweitens zu untersuchen, inwiefern sich eine Störung der Müllerzellfunktion – wie sie bei allen drei genetisch veränderten Mauslinien vorliegt – auf das Überleben der Nervenzellen unter extremen Stressbedingungen wie z.B. einer Ischämie auswirkt. Denn gerade unter den mit einer Ischämie einhergehenden Bedingungen sollte die Funktion der Müllerzellen zum Erhalt der retinalen Ionen- und Volumenhomöostase von entscheidender Bedeutung sein.

Our lab has shown that conditionally disrupting the tcfap2beta gene, responsible for the activating protein-2beta (AP-2beta) transcription factor, exclusively in the craniofacial neural crest cells, leads to anterior segment dysgenesis. Subsequent loss of the corneal endothelium results in the adherence of the iris to the corneal stroma, causing closure of the iridocorneal angle. The activating protein-2beta neural crest cell knockout (AP-2beta NCC KO) model involves a complete blockage of the both the conventional (through the trabecular meshwork) and non-conventional (uveoscleral) pathways for aqueous humor drainage, and therefore it could be used as a powerful experimental model for glaucoma. As shown by our previous work, elevated intraocular pressure (IOP) and a 35% decrease in the number of cells in the retinal ganglion cell (RGC) layer was observed in AP-2beta NCC KO mice by 2 months; 6 to 11 months sooner than other reported mouse models of glaucoma. These observations suggested that the AP-2beta NCC KO mouse could be a novel and cost-effective experimental model for glaucoma if the RGC loss occurred progressively rather than due to a congenital defect. The purpose of this research project was to investigate how the retinal ganglion cell layer and macroglial activity changes with respect to age in the AP-2beta NCC KO mutant through immunofluorescence. Specifically, it was investigated whether the loss of RGCs was progressive and due to the increased IOP caused by the blockage of the uveoscleral drainage pathway. A significant decrease in the number of RGCs was observed between P4 and P10 in the retinal periphery of both WT and AP-2beta NCC KO mice (p<0.05), which is indicative of the programmed cell death that occurs due to retinal pruning during development. No statistical difference between WT and AP-2beta NCC KO mice phenotypes was observed at postnatal day 4 (P4), suggesting that no developmental defect resulted in the significant loss of RGCs at 2 months. In all other time points investigated, while no statistical difference was found between WT and the AP-2 NCC KO mutant, a clear downward trend was present in the AP-2 NCC KO mutant retinal ganglion cell layer from P10 to P40. There was also an expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) by Müller cells, indicating the presence of neuroinflammation at P35 and P40. This substantiates the potential P42 starting point of neurodegeneration our lab previously observed. This was further corroborated with Müller cell-associated expression of GFAP at P35 and P40 exclusively in the AP-2beta NCC KO mouse. Overall, we have shown that the retinal damage observed in our AP-2beta NCC KO mouse is not due to a developmental defect, but rather occurs over time. Thus, this mouse model, which appears to block both the conventional and unconventional uveoscleral pathways, has a profound effect on aqueous humor drainage. As a result, the model requires relatively little time to observe an increase in IOP and subsequent RGC loss. Our findings suggest that the AP-2beta NCC KO mouse can be a novel, powerful, and extremely cost-effective experimental model for glaucoma. / Thesis / Master of Science (MSc)

Retinal ganglion cells play a crucial role in the relay of visual signals from the eye to the brain. This cell type is affected and eventually lost in the eye disease glaucoma, resulting in progressive and irreversible loss of vision. Studies of the molecular mechanisms leading to retinal ganglion cell death are important for the understanding of the disease and for designing future treatments. This thesis addresses and studies these molecular mechanisms, including alterations in gene expression after experimental retinal injuries. The effects of a neuroprotective drug, brimonidine, after transient retinal ischemia were also studied in order to help explain the mechanisms behind the protective properties of this drug. Several methods, including quantitative reverse transcriptase PCR, micro-arrays, western blot and immunohistochemistry, were used. The results showed that transient retinal ischemia triggers cell division in Müller cells and alters the gene expression of growth factors, their receptors, and intermediate filaments in the retina. Several genes related to the apoptosis process were less affected. Pre-treatment with brimonidine increased the levels of certain growth factors (BDNF, NT3, CNTF, FGF9) compared with vehicle. Brimonidine also had marked effects on genes related to progenitor cells, among them the recognized neural stem cell marker nestin. The increase in levels of nestin after ischemia was countered by brimonidine treatment. Moreover, retinal ganglion cell death following either optic nerve transection or optic nerve crush appears to involve the extrinsic apoptotic pathway although the gene expression response appears to differ between these injuries. The results obtained in this work contribute to an increased understanding of retinal injuries and highlight the importance of Müller cells in the endogenous defense against retinal injuries.

Müller cells are major glial cells in the retina and have a broad range of functions that are vital for the retinal neurons. During retinal injury gliotic response either leads to Müller cell dedifferentiation and formation of a retinal progenitor or to maintenance of mature Müller cell functions. The overall aim of this thesis was to investigate the intra- and extracellular signaling of Müller cells, to understand how Müller cells communicate during an injury and how their properties can be regulated after injury. Focus has been on the α2-adrenergic receptor (α2-ADR) and endothelin receptor (EDNR)-induced modulation of Müller cell-properties after injury. The results show that α2-ADR stimulation by brimonidine (BMD) triggers Src-kinase mediated ligand-dependent and ligand-independent transactivation of epidermal growth factor receptor (EGFR) in both chicken and human Müller cells. The effects of this transactivation in injured retina attenuate injury-induced activation and dedifferentiation of Müller cells by attenuating injury-induced ERK signaling. The attenuation was concomitant with a synergistic up-regulation of negative ERK- and RTK-feedback regulators during injury. The data suggest that adrenergic stress-signals modulate glial responses during retinal injury and that α2-ADR pharmacology can be used to modulate glial injury-response. We studied the effects of this attenuation of Müller cell dedifferentiation on injured retina from the perspective of neuroprotection. We analyzed retinal ganglion cell (RGC) survival after α2-ADR stimulation of excitotoxically injured chicken retina and our results show that α2-ADR stimulation protects RGCs against the excitotoxic injury. We propose that α2-ADR-induced protection of RGCs in injured retina is due to enhancing the attenuation of the glial injury response and to sustaining mature glial functions. Moreover, we studied endothelin-induced intracellular signaling in Müller cells and our results show that stimulation of EDNRB transactivates EGFR in Müller cells in a similar way as seen after α2-ADR stimulation. These results outline a mechanism of how injury-induced endothelins may modulate the gliotic responses of Müller cells. The results obtained in this thesis are pivotal and provide new insights into glial functions, thereby uncovering possibilities to target Müller cells by designing neuroprotective treatments of retinal degenerative diseases or acute retinal injury.