Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein. / Hereditary Angioedema (HAE) is a rare autosomal dominant disease due to quantitative or functional deficiency of the C1 inhibitor (C1-INH) protein. The C1-INH protein, a serine protease inhibitor (serpin), is the sole inhibitor of the C1r and C1s components of the classical complement pathway and the major regulator of factors XI and XII in the intrinsic blood coagulation and of plasma kallikrein in the contact system. With C1-INH deficiency, proper control of these systems is lacking and vasoactive peptides are generated in excess and are responsible for the characteristic symptoms like recurrent non pruritic swellings of the skin or mucosa as well as painful crampi of the abdomen. HAE episodes are triggered by psychological and/or physiological stress and often manifest in the laryngeal region with the risk of suffocation. This thesis describes the genetic analysis of the C1-INH gene in 208 families with 359 members which were suspicious for HAE and were sent from specialised outpatient clinics from 1999 to 2005. In 32 patients large deletions of the C1-INH gene were detected by Southern-Blot and dHPLC. Sequencing of all 8 exons and flanking intronic regions revealed 93 point mutations and small deletions/insertions. In 96 families with 172 members 80 different point mutations were detected which have not been published in the literature yet. As a result the HAE-database can be enlarged to 279 known mutations in the C1-INH gene. A large number of patients presented with missense mutations of unknown causality. On the basis of their localisation or homology, 29 mutations were chosen and inserted into an expression vector by site-directed mutagenesis and expressed in HEK-293 cells. The activity of the recombinant proteins was measured by a functional C1-INH assay. While most recombinant proteins resulted in almost no detectable activity thus verifying their causality for HAE, some mutant proteins showed only a reduced activity compared to wildtype. The underlying point mutations are therefore likely to be rare polymorphisms. In order to gain further insight into the effects of different mutations they were modelled into a 3D-model of the C1-INH protein and compared to a wildtype model of the C1-INH. While the model demonstrated remarkable structural alterations for some mutations it failed to do so for other clearly inactivating mutations. Since no 3D-crystallography of C1-INH is available yet, the model is based on sequence similarity of the serpin domain to other serpins with apparent limitations. Routine genetic analysis of the C1-INH gene has identified mutations in most of the HAE families and has characterised several HAE carriers prior to manifestation of life threatening symptoms. Recombinant expression and measurement of the activity of mutated C1-INH proteins is a useful tool to elucidate the causality of missense mutations and helps to characterize the role of individual amino acid residues within the C1-INH protein.

Die diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie (DW-MRT) ist ein fester Bestandteil der radiologischen Diagnostik des Zentralnervensystems (ZNS), und zwar nicht nur bei Schlaganfällen sondern zunehmend auch bei Hirntumoren, Schädelhirntraumata, demyelinisierenden, degenerativen sowie entzündlichen Erkrankungen. Diese Pathologien gehen in der Regel mit einer Veränderung der lokalen Diffusionsbedingungen einher, die eine reguläre Diffusionsbildgebung beeinträchtigen. Durch die Bestimmung der Diffusionsparameter lassen sich mit Hilfe verschiedener mathematischer Verfahren Faserverbindungen visualisieren. Wie sich diese unterschiedlichen Methoden in Regionen mit aversiven Diffusionsbedingungen verhalten, konnte mit der Arbeit erstmals systematisch gezeigt werden. Hierzu wurden 29 Patientenuntersuchungen ausgewertet. Als Einschlusskriterium galt eine unilaterale, diffusionsrelevante Läsion mit Bezug zur Pyramidenbahn. Ausschlusskriterium war eine vollständige Hemiparese als Zeichen einer vollständigen Zerstörung der relevanten Leitungsbahn. Im Einzelnen handelte es sich bei den untersuchten Läsionen um drei höhergradige Astrozytome (WHO Grad III-IV), drei niedriggradige Astrozytome, acht Glioblastome, zwei Karzinommetastasen, zwei arteriovenöse Malformationen und je eine entzündliche Parasitose, ein Oligodendrogliom, eine Gliomatose und ein Kavernom. Untersucht wurden zwei deterministische (einfaches und interpoliertes streamlining) und drei probabilistische Methoden (ohne crossing fibers; mit Berechnung von zwei Fasern pro Voxel und constrained/bayesian). Läsionen jeglicher Art verursachten signifikant mehr Fehlschläge bei deterministischer als bei probabilistischer Traktographie. In neun Untersuchungen bei einfacher und in acht Untersuchungen bei interpolierter Traktographie zeigten sich fasch negative Ergebnisse. Probabilistisches Traktographieren eliminiert nicht falsch negative Ergebnisse, reduziert sie jedoch unter den oben genannten aversiven Difussivitätsbedingungen mit denen intraaxiale Läsionen einhergehen. Klinisches Wissen über die verbliebene Traktintegrität ermöglicht die Umwandlung der Traktographieergebnisse in Wahrscheinlichkeitswerte innerhalb eines Bayschen Modells. Außerdem ist nur unter Miteinbeziehung klinischer Informationen eine Traktographie nach dem constrained Modell möglich. Obwohl die probabilistische Traktographie weniger anfällig für falsch negative Ergebnisse ist als die deterministische, geht die erhöhte Sensitivität der Algorithmen auf Kosten der Spezifität. Dies zeigt sich in signifikant erhöhten bilateralen Traktvolumina und einem übermäßigen Unterschied der Traktvolumina von Läsionsseite zu kontralateraler Seite. Die probabilistisch, unconstrained durchgeführte Traktographie der Pyramidenbahn zeigte eine signifikant, durch die Läsion verursachte Volumenminderung des Traktes, während dies im constrained modellierten Fall durch die Daten nicht gezeigt werden konnte. Dies zeigt die Robustheit des Constrained Modells unter den aversiven klinischen Bedingungen einer intraaxialen Läsion ohne den Nachteil von erhöhten Fehltraktographien. Es kann konstatiert werden, dass sich die deterministischen Traktographieverfahren zur präoperativen Orientierung vor neurochirurgischen Eingriffen eignen. Jedoch ist eine nicht zu unterschätzende Anzahl von falsch negativen Ergebnissen zu berücksichtigen. In zweifelhaften Fällen sollte zusätzlich eine Darstellung mittels probabilistischen Algorithmen, am besten mittels Constrained Modell durchgeführt werden. / Diffusion weighted magnetic resonance imaging (DW-MRI) is a common part of radiologic diagnostics of the central nervous system (CNS). Not only for the diagnosis of strokes but also in tumors, trauma, degenerative, demyelinising and inflammatory diseases. These pathologies normally include an affection of local diffusion parameters, witch impede a regular diffusion imaging. Through estimating diffusion parameters it is possible to visualize fibre connections with different mathematical methods (diffusion tensor imaging, DTI). For the first time in this thesis it could be shown how these different methods are affected by aversive diffusion conditions. 29 examinations were evaluated. Including criteria in the study were unilateral diffusion relevant lesions with reference to the pyramidal tract. Exclusion criteria were a complete paresis or plegia as sign for a complete destruction of the relevant tract. In special 3 high grade astrocytomas (WHO III-IV) 3 low grade astrozytomas, 8 glioblastomas, 2 metastasis, 2 artero-venous-malformations and each one parasitosis, oligodendroglioma, gliomatosis and cavernoma. Two deterministic (one with a fixed step length and one with probabilistic sampling)) and three probabilistic methods (with /without crossing fibres and within a constrained Bayesian framework) were performed on the same data. Lesions of all kinds caused significantly more false negative results in deterministic tracking. 9 examinations in simple and 8 in interpolated traktographies showed false negative results. Probabilistic tracking did not eliminate false negative results, but reduced them under the aversive diffusion parameters. Clinical knowledge on remaining tract integrity allows the conversion of the tracing results into probabilities within a Bayesian model. The lowered false negative rate of the probabilistic methods compared to the deterministic methods is the raised sensitivity at expenses on a lowered specificity. This can be seen in significantly raised bilateral tract lumina and an overestimated difference between tract volumes on lesion and non affected side. The probabilistic unconstrained tractographie showed a significant lowered tract volume due to the lesion; however this could not be shown for the constrained modelling. This shows the robustness of the constrained model under the aversive clinical conditions of intraaxial lesions without the disadvantage of more false tractrographies. It can be stated, that preoperative tractographies are a useful instrument of pre interventional orientation before neurosurgical operations. However a not quite low number of false negative results have to be accounted. In problematic cases an additional visualisation with probabilistic algorithms should be performed, preferably in a constrained model.

The volume homeostasis of retinal glial cells is mediated by an autocrine purinergic mechanism of ion channel opening which is activated in response to a decrease in the extracellular osmolarity. Here, I show that erythropoietin (EPO) prevents the osmotic swelling of glial somata in retinal slices from control and diabetic rats, with a half-maximal effect at approximately 0.01 nM. The downstream signaling evoked by EPO includes a release of vascular endothelial growth factor from the cells which was blocked by Janus kinase and extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2 inhibitors. Transactivation of kinase insert domain-containing receptor/fms-like tyrosine kinase 1 (KDR/flk-1) evokes a calcium-dependent, exocytotic release of glutamate, followed by activation of group I/II metabotropic glutamate receptors which results in calcium-independent release of ATP and adenosine from the cells. The final step in this cascade is the activation of adenosine A(1) receptors which results in protein kinase A- and phosphoinositide 3-kinase-mediated opening of potassium and chloride channels. EPO receptor protein was immunohistochemically localized to the inner retina and photoreceptor inner segments. In isolated glial cells, EPO receptor protein is selectively localized to fibers which traverse the inner nuclear layer in situ. Inhibition of glial swelling might contribute to the neuroprotective action of EPO in the retina under pathological conditions.

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The volume homeostasis of retinal glial cells is mediated by an autocrine purinergic mechanism of ion channel opening which is activated in response to a decrease in the extracellular osmolarity. Here, I show that erythropoietin (EPO) prevents the osmotic swelling of glial somata in retinal slices from control and diabetic rats, with a half-maximal effect at approximately 0.01 nM. The downstream signaling evoked by EPO includes a release of vascular endothelial growth factor from the cells which was blocked by Janus kinase and extracellular signal-regulated kinases (ERK)1/2 inhibitors. Transactivation of kinase insert domain-containing receptor/fms-like tyrosine kinase 1 (KDR/flk-1) evokes a calcium-dependent, exocytotic release of glutamate, followed by activation of group I/II metabotropic glutamate receptors which results in calcium-independent release of ATP and adenosine from the cells. The final step in this cascade is the activation of adenosine A(1) receptors which results in protein kinase A- and phosphoinositide 3-kinase-mediated opening of potassium and chloride channels. EPO receptor protein was immunohistochemically localized to the inner retina and photoreceptor inner segments. In isolated glial cells, EPO receptor protein is selectively localized to fibers which traverse the inner nuclear layer in situ. Inhibition of glial swelling might contribute to the neuroprotective action of EPO in the retina under pathological conditions.

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Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\'s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen. / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\'s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.

Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\''s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109 / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\''s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109

Abdominelle Komplikationen, zu denen auch das akute Leberversagen nach Einsatz der Herz-Lungen-Maschine und systemischer Hypothermie nach herzchirurgischen Korrekturoperationen neugeborener Patienten zählt, sind seltene, aber dennoch erst zu nehmende unerwünschte Folgen. Die Untersuchungen erfolgten an neugeborenen Schweinen, die in 4 Gruppen eingeteilt wurden: Eine Gruppe wurde mit extrakorporaler Zirkulation in moderater Hypothermie (32°C) operiert (CPB), die zweite Gruppe wurde in tiefer Hypothermie (18°C) und totalem Kreislaufstillstand operiert (DHCA). In der dritten Gruppe (Sham) erfolgte die Instrumentation nach Sternotomie und ohne Einsatz der Herz-Lungen-Maschine. Die Tiere der vierten Gruppe waren unbehandelte Kontrolltiere. Es zeigte sich, dass das Entstehen der Inflammation wesentlich abhängig von der Anwendungsdauer der Herz-Lungen-Maschine ist. Tiefe systemische Hypothermie scheint einen protektiven Effekt auf die Inflammation und Apoptose zu haben. Im Gegensatz dazu verursacht tief-hypothermer Kreislaufstillstand vermehrt die Bildung eines hepatozellulären Ödems. Bei allen untersuchten Aspekten (Inflammation, hepatozelluläres Ödem, Apoptose) zeigt sich deutlich, dass der operative EIngriff selbst Veränderungen an der Leber hervorruft. Insbesondere für das Auftreten von Apoptose ist das chirurgsiche Trauma von größter Bedeutung.

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