No description available.

No description available.

By means of the analytical formula of specific impedance for the spherical cells in suspensionintroduced by Kenneth S. Cole in 1928, a bioimpedance simulator has been developed for thegeneration of specific impedance spectrums of suspension of cells. With the help of the simulatorthe user can obtain different impedance spectrums according with the biophysical parameters ofthe cell suspension. Then, generate different kind of plots in order to understand and interpret allthe resulting information.With the selection of different values and range of the biophysical parameters to obtain thespectrums, it is possible to simulate different kinds of physiological process and observe theirelectrical bioimpedance behaviour in a certain range of frequencies. The performance of thesimulator has been validated simulating Cellular Edema and Haemorrhage has been alsosimulated.

Physiological Reports published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of the American Physiological Society and The Physiological Society. A volume-regulated anion channel (VRAC) has been electrophysiologically characterized in innumerable mammalian cell types. VRAC is activated by cell swelling and mediates the volume regulatory efflux of Cl− and small organic solutes from cells. Two groups recently identified the mammalian leucine-rich repeat containing protein LRRC8A as an essential VRAC component. LRRC8A must be coexpressed with at least one of the other four members of this gene family, LRRC8B-E, to reconstitute VRAC activity in LRRC8−/− cells. LRRC8 genes likely arose with the origin of chordates. We identified LRRC8A and LRRC8C-E orthologs in the zebrafish genome and demonstrate that zebrafish embryo cells and differentiated adult cell types express a swelling-activated Cl− current indistinguishable from mammalian VRAC currents. Embryo cell VRAC currents are virtually eliminated by morpholino knockdown of the zebrafish LRRC8A ortholog lrrc8aa. VRAC activity is fully reconstituted in LRRC8−/− human cells by coexpression of zebrafish lrrc8aa and human LRRC8C cDNAs. lrrc8aa expression varies during zebrafish embryogenesis and lrrc8aa knockdown causes pericardial edema and defects in trunk elongation and somatogenesis. Our studies provide confirmation of the importance of LRRC8A in VRAC activity and establish the zebrafish as a model system for characterizing the molecular regulation and physiological roles of VRAC and LRRC8 proteins.

Accumulation of osmotically active metabolites, which create an osmotic gradient estimated at ∼60 mOsM, and cell swelling are prominent features of ischemic myocardial cell death. This study tests the hypothesis that reduction of ischemic swelling by enhanced cell volume regulation is a key mechanism in the delay of ischemic myocardial cell death by ischemic preconditioning (IPC). Experimental protocols address whether: (i) IPC triggers a cell volume regulation mechanism that reduces cardiomyocyte swelling during subsequent index ischemia; (ii) this reduction in ischemic cell swelling is sufficient in magnitude to account for the IPC protection; (iii) the molecular mechanism that mediates IPC also mediates cell volume regulation. Two experimental models with rabbit ventricular myocytes were studied: freshly isolated pelleted myocytes and 48-h cultured myocytes. Myocytes were preconditioned either by distinct short simulated ischemia (SI)/simulated reperfusion protocols (IPC), or by subjecting myocytes to a pharmacological preconditioning (PPC) protocol (1 μM calyculin A, or 1 μM N6-2-(4-aminophenyl)ethyladenosine (APNEA), prior to subjecting them to either different durations of long SI or 30 min hypo-osmotic stress. Cell death (percent blue square myocytes) was monitored by trypan blue staining. Cell swelling was determined by either the bromododecane cell flotation assay (qualitative) or video/confocal microscopy (quantitative). Simulated ischemia induced myocyte swelling in both the models. In pelleted myocytes, IPC or PPC with either calyculin A or APNEA produced a marked reduction of ischemic cell swelling as determined by the cell floatation assay. In cultured myocytes, IPC substantially reduced ischemic cell swelling (P < 0.001). This IPC effect on ischemic cell swelling was related to an IPC and PPC (with APNEA) mediated triggering of cell volume regulatory decrease (RVD). IPC and APNEA also significantly (P < 0.001) reduced hypo-osmotic cell swelling. This IPC and APNEA effect was blocked by either adenosine receptor, PKC or Cl- channel inhibition. The osmolar equivalent for IPC protection approximated 50-60 mOsM, an osmotic gradient similar to the estimated ischemic osmotic load for preconditioned and non-preconditioned myocytes. The results suggest that cell volume regulation is a key mechanism that accounts for most of the IPC protection in cardiomyocytes.

No description available.

Recent progress in magnetic resonance imaging (MRI) has opened the way for micron-scale resolution, and thus for imaging biological cells. In this thesis work, we performed magnetic resonance microscopy (MRM) on the nervous system of Aplysia californica, a model particularly suited due to its simplicity and to its very large neuronal cell bodies, in the aim of studying cellular-scale processes with various MR contrasts. Experiments were performed on a 17.2 Tesla horizontal magnet, at resolutions down to 25 µm isotropic. Initial work consisted in conceiving and building radiofrequency microcoils adapted to the size of single neurons and ganglia. The first major part of the project consisted in using the manganese ion (Mn2+) as neural tract tracer in the buccal ganglia of Aplysia. Manganese is an MR contrast agent that enters neurons via voltage-gated calcium channels. We performed the mapping of axonal projections from motor neurons into the peripheral nerves of the buccal ganglia. We also confirmed the existence of active Mn2+ transport inside the neural network upon activation with the neurotransmitter dopamine. In the second major part of the project, we tested the potential of two diffusion MRI sequences for microscopy. On the one hand, we explored a very original mechanism for diffusion weighting, DESIRE (Diffusion Enhancement of SIgnal and REsolution), particularly suited for small samples. The two-dimensional DESIRE sequence was implemented and successfully tested on phantoms. The measured enhancement was consistent with theoretical predictions. Using this sequence to produce diffusion weighted images with an unprecedented contrast in biological tissue remains a challenge. On the other hand, a more "standard" sequence was implemented to measure the apparent diffusion coefficient (ADC) in nervous tissue with MRM. This sequence was a three-dimensional DP-FISP (Diffusion Prepared Fast Imaging with Steady-state free Precession), which met criteria for high resolution in a short acquisition time, with minimal artifacts. Using this sequence, we studied the changes in water ADC at different scales in the nervous system, triggered by cellular challenges. The challenges were hypotonic shock or exposure to ouabain. ADC measurements were performed on single isolated neuronal bodies and on ganglia tissue, before and after challenge. Both types of stress produced an ADC increase inside the cell and an ADC decrease at tissue level. The results favor the hypothesis that the increase in membrane surface area associated with cell swelling is responsible for the decrease of water ADC in tissue, typically measured in ischemia or other conditions associated with cell swelling.

Les progrès technologiques récents en imagerie par résonance magnétique (IRM) ont ouvert la voie à une résolution spatiale de l’ordre de quelques microns, et donc à l’imagerie de cellules biologiques. Dans le cadre de ce projet, nous avons réalisé des expériences de microscopie IRM sur le système nerveux de l’aplysie (Aplysia californica), particulièrement adapté de par sa simplicité et de par la très grande taille de ses neurones, en vue d’étudier des processus à échelle cellulaire avec divers contrastes IRM. Les expériences d’imagerie ont été effectuées sur un aimant horizontal 17.2 Tesla, à des résolutions spatiales jusqu’à 25 µm isotrope. Le travail initial a consisté en la conception et fabrication de micro-antennes radiofréquences adaptées à la taille de neurones uniques et de ganglions. La première partie du projet a porté sur l’utilisation de l’ion manganèse (Mn2+) comme traceur de réseaux neuronaux dans le ganglion buccal de l’aplysie. Le manganèse (Mn) est un agent de contraste IRM qui pénètre dans les neurones par les canaux de calcium. La cartographie des projections axonales des neurones moteurs du ganglion dans chacun des nerfs périphériques a été établie. Il a également été démontré l’existence d’un transport actif du Mn2+ au sein du réseau neuronal activé par le neurotransmetteur dopamine. Dans un second temps, on s’est intéressé à deux méthodes de mesure de diffusion par IRM, à échelle microscopique. D’une part, un mécanisme de pondération en diffusion, DESIRE (Diffusion Enhancement of SIgnal and REsolution), original et particulièrement adapté à des échantillons petits, a été exploré. La séquence DESIRE a été implémentée en deux dimensions et testée avec succès sur fantôme. Le rehaussement mesuré était en accord avec les prévisions théoriques. Le grand défi à venir sera d’utiliser cette séquence pour acquérir des images de tissu biologique pondérées en diffusion avec un contraste unique. D’autre part, une séquence plus « classique » a été implémentée pour mesurer le coefficient de diffusion apparent (ADC) dans le tissu nerveux. Il s’agit d’une DP-FISP (Diffusion Prepared Fast Imaging with Steady-state free Precession) en trois dimensions, qui répond aux critères de résolution spatiale et de rapidité, avec un minimum d’artefacts. Cette séquence a permis d’étudier l’évolution de l’ADC de l’eau à différentes échelles du tissu nerveux en réponse à un stress cellulaire. Les deux sollicitations retenues étaient un choc hypotonique ou l’ajout d’ouabaïne. Des mesures d’ADC ont été effectuées sur des corps neuronaux isolés et sur du tissu de ganglion, avant et après sollicitation. Les deux types de stress ont entraîné une augmentation de l’ADC dans la cellule et une diminution globale de l’ADC dans le tissu. Ces résultats soutiennent l’hypothèse que la diffusion ralentie de l’eau habituellement observée dans un tissu ischémié (ou dans d’autres conditions associées à un gonflement cellulaire) est due à l’augmentation de surface membranaire. / Recent progress in magnetic resonance imaging (MRI) has opened the way for micron-scale resolution, and thus for imaging biological cells. In this thesis work, we performed magnetic resonance microscopy (MRM) on the nervous system of Aplysia californica, a model particularly suited due to its simplicity and to its very large neuronal cell bodies, in the aim of studying cellular-scale processes with various MR contrasts. Experiments were performed on a 17.2 Tesla horizontal magnet, at resolutions down to 25 µm isotropic. Initial work consisted in conceiving and building radiofrequency microcoils adapted to the size of single neurons and ganglia. The first major part of the project consisted in using the manganese ion (Mn2+) as neural tract tracer in the buccal ganglia of Aplysia. Manganese is an MR contrast agent that enters neurons via voltage-gated calcium channels. We performed the mapping of axonal projections from motor neurons into the peripheral nerves of the buccal ganglia. We also confirmed the existence of active Mn2+ transport inside the neural network upon activation with the neurotransmitter dopamine. In the second major part of the project, we tested the potential of two diffusion MRI sequences for microscopy. On the one hand, we explored a very original mechanism for diffusion weighting, DESIRE (Diffusion Enhancement of SIgnal and REsolution), particularly suited for small samples. The two-dimensional DESIRE sequence was implemented and successfully tested on phantoms. The measured enhancement was consistent with theoretical predictions. Using this sequence to produce diffusion weighted images with an unprecedented contrast in biological tissue remains a challenge. On the other hand, a more “standard” sequence was implemented to measure the apparent diffusion coefficient (ADC) in nervous tissue with MRM. This sequence was a three-dimensional DP-FISP (Diffusion Prepared Fast Imaging with Steady-state free Precession), which met criteria for high resolution in a short acquisition time, with minimal artifacts. Using this sequence, we studied the changes in water ADC at different scales in the nervous system, triggered by cellular challenges. The challenges were hypotonic shock or exposure to ouabain. ADC measurements were performed on single isolated neuronal bodies and on ganglia tissue, before and after challenge. Both types of stress produced an ADC increase inside the cell and an ADC decrease at tissue level. The results favor the hypothesis that the increase in membrane surface area associated with cell swelling is responsible for the decrease of water ADC in tissue, typically measured in ischemia or other conditions associated with cell swelling.

Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\'s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen. / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\'s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.

Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurde immer deutlicher, dass einwärts-gleichrichtende Kaliumkanäle (Kir) neben ihrer klassischen Rolle im Aufbau und der Konstanthaltung des Ruhemembranpotentials weitere zellspezifische Aufgaben erfüllen.In der vorliegenden Arbeit konnte mittels transgener Maustechnologie gezeigt werden, dass Kir4.1 früh postnatal zunächst Zellkörper-assoziiert auf Oligodendrozyten in der weißen Substanz des Rückenmarks exprimiert wird. Im weiteren Verlauf der Entwicklung kommt es zu einer Hochregulation der Proteinexpression auf perivaskulären und perineuralen astrozytären Fortsätzen in der grauen Substanz. Hier konnte die Kolokalisation von Kir4.1 und einem Wasserkanal (AQP4) auf astroglialen Endfüßen nachgewiesen werden. Das Kir4.1-Expressionsmuster im Rückenmark legt eine Rolle des Kanals in der Kaliumpufferung und möglicherweise in der Kalium-gesteuerten Volumenregulation nahe.Basierend auf den Ergebnissen der Expressionsstudie dieser Arbeit wurde die konkrete Hypothese aufgestellt, dass Kir4.1-Kanäle mittels Kontrolle des transmembranösen Kaliumtransports einen Einfluss auf die osmotische Volumenregulation von Astrozyten haben. Anhand eines Modellsystems konnte unter Verwendung konfokaler 2-Photonen-Lasermikroskopie gezeigt werden, dass die genetische Inaktivierung von Kir4.1 im Knock-Out-Mausmodell zu einer Beeinträchtigung der Wassersekretion aus astrozytären Fortsätzen mit nachfolgender Schwellung führt. Dies zeigt, dass Kir4.1-Kanäle wesentlich zur Volumenregulation in Astrozyten beitragen und dass der Kalium-sekretorische Volumenausgleich über astrogliale Endfüße vermittelt wird. Eine Beeinträchtigung von Expression oder Funktion astroglialer Kir4.1-Kanäle könnte unter pathophysiologischen Bedingungen zu einer Anschwellung von Astrozyten und Verringerung des extrazellulären Raumes beitragen.Eine mögliche pathogenetische Bedeutung von glialen Kir4.1-Kanälen bei neurodegenerativen Erkrankungen wurde anhand eines etablierten Tiermodells für die Motoneuronerkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) untersucht. Erstmals konnte eine Krankheits-assoziierte, fortschreitende Reduktion der Kir4.1-Expression im Ventralhorn des Rückenmarks im SOD1-vermittelten ALS-Mausmodell nachgewiesen werden. Die daraus resultierende extrazelluläre Akkumulation von Kalium könnte durch chronische Depolarisation der Membran der Motoneurone zu deren Tod beitragen. Diese Schlussfolgerung unterstützend konnte in einem in vitro Modellsystem gezeigt werden, dass eine erhöhte extrazelluläre Kaliumkonzentration neurotoxisch wirkt. Die differentielle Expression von Kir4.1 im Rückenmark und die daraus abgeleitete Bedeutung für die Neuron-Glia Interaktion unter physiologischen und pathophysiologischen Aspekten unterstützt die Sichtweise einer dynamischen Interaktion von neuronalen und glialen Zellen im gesunden und kranken Gewebe.