Frühe entzündliche Vorgänge scheinen eine große Rolle in der Entstehung der globalen Hirnschädigung in der Frühphase nach einer Subarachnoidalblutung (SAB) zu spielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Effekt der anti-inflammatorischen Medikamente Methylprednisolon und Minozyklin auf die Gehirndurchblutung und frühe Hirnschädigung nach SAB zu untersuchen. Hierzu wurde ein randomisiertes und kontrolliertes Tierexperiment durchgeführt. Mit Hilfe des endovaskulären Perforationsmodells wurde bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten eine SAB ausgelöst. Den Tieren wurde 30 Minuten nach Auftreten der SAB Methylprednisolon, Minozyklin oder Kochsalzlösung intraperitoneal verabreicht. Sowohl Methylprednisolon als auch Minozyklin verminderten den Anteil Caspase 3 positiver Zellen in immunhistochemischen Färbungen der Hippocampie der Versuchstiere signifikant. In Bezug auf die klinische Untersuchung, den intrakraniellen Druck und die Hirndurchblutung der Ratten ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Die Ergebnisse suggerieren, dass Methylprednisolon und Minozyklin den akuten Zellschaden nach SAB reduzieren. Daher könnten sich beide Mittel als geeignet für die Therapie der „Early Brain Injury“ nach SAB erweisen. Weitere Studien zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Wirkmechanismen von Methylprednisolon und Minozyklin auf die Frühphase der SAB sind nötig. / Early inflammatory processes may play an important role in the development of early brain injury (EBI) after subarachnoid hemorrhage (SAH). The aim of this study was to investigate the effect of early treatment with methylprednisolone and minocycline on cerebral perfusion and global braindamage after SAH. We performed a randomized and controlled experiment using male Sprague-Dawley rats. The animals were subjected to SAH using the endovascular filament model. 30 minutes after SAH, they were randomly assigned to receive an intraperitoneal injection of methylprednisolone, minocycline or saline. Treatment with methylprednisolone or minocycline did not result in a significant improvement of cerebral perfusion, intracranial pressure or neurological recovery. Hippocampal damage significantly attenuated in both methylprednisolone and minocycline treated animals. Therefore, early treatment with the anti-inflammatory drugs methylprednisolone or minocycline in the acute phase after SAH has the potential to reduce brain damage and exert a neuroprotective effect.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet experimentelle Untersuchungen zur neuroprotektiven Wirkung des körpereigenen Lipids L-alpha-Lysophosphatidylinositol (LPI). Die Vermittlung dieser Wirkung soll durch den zentralnervös exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor 55 (GPR55) erfolgen. Als Modelsystem diente die organotypische hippocampale Schnittkultur (OHSC) der Ratte, welche exzitotoxisch mittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) geschädigt wurde, um Neurodegeneration zu initiieren. Die Inkubation mit LPI nach NMDA-Schädigung reduzierte die Anzahl toter Neurone und die der Mikroglia in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus. Ein Clodronat-induzierter Verlust der Mikroglia und die siRNA-vermittelte Herabregulation von Gpr55 hoben jeweils den neuroprotektiven Effekt von LPI in der OHSC auf. Diese Beobachtungen wiesen auf eine Mikroglia- und GPR55 abhängige Neuroprotektion hin. LPI wirkte zudem synergistisch und verstärkte die (bekannter Maßen) durch Cannabinoide induzierte und über den Cannabinoid Typ 1 Rezeptor vermittelte Neuroprotektion. Ferner wurde Gpr55 mittels qPCR in Mikroglia und Astrozyten nachgewiesen. LPI steuerte außerdem die Expression von Gpr55 in Mikroglia und beeinflusste deren Migrationsverhalten. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass LPI in einem in vitro Modellsystem zur Untersuchung des sekundären neuronalen Schadens protektiv wirkt und für die Vermittlung dieser Neuroprotektion Mikroglia und GPR55 in Frage kommen.

Aortocoronary bypass or valve surgery usually require cardiac arrest using cardioplegic solutions. Although, in principle, in a number of cases beating heart surgery (so-called off-pump technique) is possible, aortic or valve surgery or correction of congenital heart diseases mostly require cardiopulmonary arrest. During this condition, the heart-lung machine also named cardiopulmonary bypass (CPB) has to take over the circulation. It is noteworthy that the invention of a machine bypassing the heart and lungs enabled complex cardiac operations, but possible negative effects of the CPB on other organs, especially the brain, cannot be neglected. Thus, neuroprotection during CPB is still a matter of great interest. In this review, we will describe the impact of CPB on the brain and focus on pharmacological and non-pharmacological strategies to protect the brain.

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In Alzheimer’s disease (AD), different types of neurons and different brain areas show differential patterns of vulnerability towards neurofibrillary degeneration, which provides the basis for a highly predictive profile of disease progression throughout the brain that now is widely accepted for neuropathological staging. In previous studies we could demonstrate that in AD cortical and subcortical neurons are constantly less frequently affected by neurofibrillary degeneration if they are enwrapped by a specialized form of the hyaluronan-based extracellular matrix (ECM), the so called ‘perineuronal net’ (PN). PNs are basically composed of large aggregating chondroitin sulphate proteoglycans connected to a hyaluronan backbone, stabilized by link proteins and cross-linked via tenascin-R (TN-R). Under experimental conditions in mice, PN-ensheathed neurons are better protected against iron-induced neurodegeneration than neurons without PN. Still, it remains unclear whether these neuroprotective effects are directly mediated by the PNs or are associated with some other mechanism in these neurons unrelated to PNs. To identify molecular components that essentially mediate the neuroprotective aspect on PN-ensheathed neurons, we comparatively analysed neuronal degeneration induced by a single injection of FeCl3 on four different mice knockout strains, each being deficient for a different component of PNs. Aggrecan, link protein and TN-R were identified to be essential for the neuroprotective properties of PN, whereas the contribution of brevican was negligible. Our findings indicate that the protection of PN-ensheathed neurons is directly mediated by the net structure and that both the high negative charge and the correct interaction of net components are essential for their neuroprotective function.

Die erfolgreiche Übertragung der vielversprechenden Ergebnisse aus zahlreichen Kleintierstudien zu den neuroprotektiven und -regenerativen Eigenschaften des Wachstumsfaktors G-CSF auf eine multizentrische randomisierte Phase-IIa-Studie misslang. Bei näherer Betrachtung fiel eine deutlich höhere Dosierung des Wachstumsfaktors in der humanen Studie im Vergleich zu den erfolgreichen präklinischen Studien auf, sodass Fragen nach einem schädigenden Einfluss möglicher immunologischer Veränderungen aufkamen.Um dies zu überprüfen, wurde in einem murinen Schlaganfallmodell eine quantitative FACS-Analyse des frühen entzündlichen Hirninfiltrats und der Immunzellpopulationen im peripheren Blut mit besonderem Augenmerk auf neutrophile Granulozyten 24 Stunden nach (Schein-)Schlaganfall durchgeführt. Ergänzend erfolgte eine immun-histochemische Beurteilung des Infiltrationsverhaltens neutrophiler Granulozyten, wobei neben der räumlichen Verteilung die Zellmorphologie untersucht wurde.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Der Schlaganfall 1 1.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Relevanz 1 1.1.2 Ätiologie und Pathogenese 1 1.1.3 Klinische Symptomatik 2 1.1.4 Rekanalisierende Therapie 2 1.2 Immunologie des Schlaganfalls 3 1.2.1 Das Gehirn als immunprivilegiertes Organ 3 1.2.2 Immunantwort nach Schlaganfall 3 1.2.3 Bedeutung neutrophiler Granulozyten für die Immunantwort 6 1.2.4 Rolle des neutrophilen Granulozyten im Schlaganfall 7 1.3 Der Granulozyten Kolonie-stimulierende Faktor 10 1.3.1 G-CSF im Schlaganfall 10 1.3.2 Einführung 12 1.3.3 Präklinische Schlaganfallstudien mit G-CSF 14 1.3.4 klinische Schlaganfallstudien mit G-CSF 14 1.4 Dosistranslation von experimentellen zu klinischen Studien 16 2 Zielstellung der Arbeit 17 3 Material und Methoden 18 3.1 Versuchstiere 18 3.2 Schlaganfallmodell 18 3.3 Ein- und Ausschlusskriterien 19 3.4 Versuchsplan 20 3.5 Behandlung mit G-CSF 21 3.6 Euthanasie und transkardiale Perfusion 22 3.7 Quantifizierung der Leukozytenzahl im Vollblut 23 3.8 Durchflusszytometrische Aufarbeitung 23 3.8.1 Lyse- und Färbeprotokoll Blut 23 3.8.2 Isolation von Immunzellen aus dem Maushirn und Färbeprotokoll 24 3.9 Durchflusszytometrische Analyse 25 3.10 Histopathologische Aufarbeitung 26 3.10.1 Anfertigung histologischer Schnitte im Kryostat 26 3.10.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 27 3.10.3 Immunfluoreszenz 27 3.10.4 Differenzierung von Granulozyten und Monozyten 29 3.10.5 Immunhistochemische Auszählung 29 3.10.6 Darstellung der räumlichen Verteilung 31 3.11 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 34 4.1 Durchflusszytometrie 34 4.1.1 Veränderungen des Körper- und Milzgewichts 34 4.1.2 Immunzellpopulationen im peripheren Blut 35 4.1.3 Immunzellpopulationen im Hirnisolat 38 4.2 Immunhistochemie 42 4.2.1 Differenzierung von Monozyten und Granulozyten 42 4.2.2 Quantitative Analyse 43 4.2.2.1 Ipsilateral / kontralateral 44 4.2.2.2 Meningeal / intrazerebral 45 4.2.2.3 Rund / stäbchenförmig 46 4.2.3 Räumliche Verteilung der neutrophilen Granulozyten 47 5 Diskussion 51 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 51 5.2 G-CSF und die Einwanderung neutrophiler Granulozyten 53 5.3 G-CSF und die Zusammensetzung des frühen entzündlichen Infiltrats im Gehirn 54 5.4 G-CSF und die räumliche Verteilung einwandernder neutrophiler Granulozyten 56 5.5 G-CSF und die Zellmorphologie einwandernder neutrophiler Granulozyten 58 5.6 G-CSF und die periphere bzw. systemische Immunantwort 60 5.7 Methodische Einflussfaktoren und Limitationen der Arbeit 63 5.7.1 Berechnung der murinen Äquivalenzdosis 63 5.7.2 Wahl des Schlaganfallmodells 64 5.7.3 Immunologische Unterschiede zwischen Maus und Mensch 65 5.7.4 Methoden und Versuchstieranzahl 66 5.7.4.1 Durchflusszytometrie 66 5.7.4.2 Immunhistochemie 67 5.8 Ausblick 68 6 Zusammenfassung 70 Literaturverzeichnis XI Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XXVII Tabellarischer Lebenslauf XXVIII Publikationen XXIX Danksagung XXX

Neurodegenerative Augenerkrankungen wie die diabetische Retinopathie und das Glaukom zählen in der westlichen Welt zu den häufigsten Erblindungsursachen. Unter dem Einfluss hypoxischer/ischämischer Bedingungen oder auch neuro-inflammatorischer Zytokine kommt es zum Untergang von retinalen Ganglienzellen (RGC) und deren Axone sowie von amakrinen Zellen und folglich zum irreversiblen Sehverlust. Die neuronalen Zellen der Netzhaut, insbesondere RGC, gelten aufgrund ihres hohen Bedarfs an Metaboliten gegenüber hypoxischen/ischämischen Episoden als besonders vulnerabel. Retinale Müllerzellen (RMC) sezernieren signifikante Mengen an neuroprotektiven Faktoren, zu denen PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF gehören. Es gibt Hinweise, dass RMC das progredient verlaufende Absterben von RGC unter apoptosefördernden Bedingungen zu bremsen vermögen bzw. die axonale Regeneration beschädigter RGC fördern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression neuroprotektiver Mediatoren in RMC und retinalen neuronalen Zellen in Kokulturen sowie vergleichend unter Normoxie und Hypoxie analysiert. Unter diesen Bedingungen wurden auch Überleben und Apoptose neuronaler Zellen untersucht. Mit der Zielstellung, den Stellenwert der PEDF-vermittelten Förderung des Überlebens von RGC zu erkunden, erfolgten Untersuchungen zu PEDF und PEDFRezeptoren, insbesondere zu deren Expressionsregulation in Gegenwart neuroprotektiver Mediatoren sowie normoxischer bzw. hypoxischer Müllerzell-konditionierter Medien (NCM bzw. HCM). In den Zellkultur-Versuchen kam es unter Hypoxie zu einer signifikant gesteigerten Anzahl apoptotischer R28-Zellen. Aus der Gegenwart von RMC in Kokulturen, jedoch nicht durch Zugabe von NCM bzw. HCM, resultierte ein signifikant vermindertes Apoptoseniveau im Vergleich zu homotypischen Kulturen. Die Anwesenheit der RMC führte unter Normoxie zu einer erhöhten Proteinkinase B-/Akt-Aktivität in kokultivierten R28-Zellen. Die neuroprotektiven Effekte der glialen Mediatoren sind somit möglicherweise an modulatorische Aktivitäten gleichzeitig präsenter neuronalen Zellen gebunden. Mögliche gliale Mediatoren sind PEDF, VEGF und IL-6, die die Expression Apoptose-relevanter Gene in R28-Zellen modulierten: Die Expression von proapoptotischen Genen (Bad) zeigte sich nach Stimulation mit PEDF und VEGF, besonders in Kombination mit IL-6 unter Hypoxie, vermindert, diejenige von antiapoptotischen Genen (Bcl-2, Bcl-xL) wurde nach Stimulation mit VEGF und IL-6 hochreguliert. Retinale Neuronen selbst (RGC und R28-Zellen) exprimieren PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF, wie auch die PEDF-Rezeptoren PEDF-R undLmR; ein erhöhtes PEDF-, VEGF-, PEDF-R- und LmR-Niveau zeigte sich dabei unter Hypoxie. In RMC war unter Hypoxie die mRNA-Expression der neuroprotektiv wirkenden Mediatoren (PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF) und der PEDF-Rezeptoren signifikant gesteigert. Es wurde gemutmaßt, dass die Expression dieser Moleküle weiterhin unter der Kontrolle sezernierter Faktoren retinaler Neuronen steht. In der Tat zeigten RMC, welche in Gegenwart von RGC oder R28-Zellen kultiviert wurden, eine gesteigerte PEDF-, VEGF- und IL-6-Expression. Die hypoxieinduzierte PEDF-Rezeptor-Expression in R28-Zellen erfuhr durch PEDF-, VEGF und IL-6-Stimulation eine Steigerung. Die Kultivierung von RGC in Gegenwart von NCM sowie HCM bedingte eine verminderte LmR-Expression und diejenige in Gegenwart von NCM eine verminderte PEDF-R-Expression. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hypoxie bzw. die folglich hochregulierten Mediatoren (wie VEGF und IL-6) die Expression dieser Rezeptoren und möglicherweise das Überleben neuronaler Zellen in Gegenwart von RMC beeinflussen. Insgesamt legen die Ergebnisse nahe, dass RMC und retinale neuronale Zellen über sezernierte Mediatoren (PEDF, VEGF, IL-6 und BDNF) interagieren und dass die Expression neuroprotektiver Faktoren in beiden Zellpopulationen einer gegenseitigen bidirektionalen Einflussnahme unterliegt. Um einer therapeutischen Neuroprotektion, die den Verlust von RGC verhindert oder eine Regeneration geschädigter Zellen anstrebt, näher zu kommen, sollten eine Modulation des mediatorgesteuerten Überlebens retinaler neuronaler Zellen und der zugrundeliegenden intrazellulären Signalübertragungswege in Betracht gezogen werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Einführung in die Thematik 1.2 Glia- und neuronale Zellen der Retina 1.2.1 Gliale Müllerzellen (RMC) 1.2.2 Retinale Ganglienzellen (RGC) 1.3 Diabetische Retinopathie 1.3.1 Formen und Behandlungsoptionen der diabetischen Retinopathie 1.3.2 Pathogenese und Ätiologie der diabetischen Retinopathie 1.4 Glaukom 1.4.1 Formen und Behandlungsoptionen des Glaukoms 1.4.2 Pathogenese und Ätiologie des Glaukoms 1.5 Neuromodulatorische Faktoren der Retina 1.5.1 Pigment epithelium-derived factor (PEDF) 1.5.2 Vascular endothelial growth factor (VEGF) 1.5.3 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 1.5.4 Interleukin-6 (IL-6) 2. Zielstellung 3. Material und Methoden 3.1 Chemikalien und Lösungen 3.2 Geräte und Verbrauchsmaterial 3.3 Software 3.4 Methoden 3.4.1 Präparation und Kultur von retinalen Ganglienzellen (RGC) 3.4.2 Präparation und Kultur von retinalen Müllerzellen (RMC) 3.4.3 Kultur von R28-Zellen 3.5 Zellkultivierung 3.5.1 Trypsinierung 3.5.2 Zellzahlbestimmung 3.5.3 Kryokonservierung 3.6 Zellkulturansätze mit retinalen Zellen 3.6.1 Zytokinstimulation 3.6.2 Neutralisierende Antikörper 3.6.3 Weitere Additive 3.6.4 Gewinnung konditionierter RMC-Medien und deren Einfluss auf retinale Zellen 3.7 Transfektion von RMC mit siRNA 3.8 Kokultur von RMC mit neuronalen Zellen 3.9 RNA-Isolation 3.10 Reverse Transkription 3.11 Polymerase-Kettenreaktion nach Reverser Transkription (RT-PCR) 3.11.1 Quantitative Real-Time-PCR (qPCR) 3.11.2 Effizienz der qPCR 3.12 Agarose-Gel-Elektrophorese 3.13 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 3.14 Phospho-Akt1 (Ser473) Sandwich ELISA 3.15 Cell Death Detection ELISA 3.16 Proteinbestimmung 3.17 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie auf überlebensrelevante Ereignisse in retinalen neuronalen Zellen 4.1.1 Beeinflussung der Apoptose von R28-Zellen 4.1.2 Beeinflussung der Proteinkinase B-/Akt-Aktivierung in R28-Zellen 4.2 Einfluss glialer Mediatoren auf die Expression von Neuroprotektinen und PEDFRezeptoren in retinalen neuronalen Zellen 4.2.1 Expression und Regulation von Neuroprotektinen in retinalen neuronalen Zellen 4.2.1.1 VEGF-, PEDF- und BDNF-Expression unter Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie 4.2.1.2 Regulation von VEGF, PEDF und BDNF durch neuroprotektive Faktoren 4.2.2 Expression und Regulation der Rezeptoren PEDF-R und LmR in retinalen neuronalen Zellen 4.2.2.1 Expression von PEDF-R und LmR unter Einfluss von glialen Mediatoren und Hypoxie 4.2.2.2 Untersuchungen zu Mechanismen der hypoxieinduzierten PEDF-R- und LmR Hochregulation unter Normoxie und Hypoxie 4.3 Expression und Regulation von glialen Neuroprotektinen und PEDF-Rezeptoren in Müllerzellen 4.3.1 Regulation der VEGF-, PEDF-, IL-6- und BDNF-Expression in Müllerzellen durch neuronale Faktoren 4.3.1.1 VEGF-, PEDF-, IL-6- und BDNF-Expression in Müllerzellen unter Einfluss der Gesamtheit sezernierter neuronaler Faktoren und Hypoxie 4.3.1.2 PEDF-regulierte VEGF- und BDNF-Expression 4.3.2 Expression und Regulation der Rezeptoren PEDF-R und LmR in Müllerzellen 4.4 Regulation der Expression Apoptose-relevanter Moleküle in R28-Zellen durch neuroprotektive Faktoren 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Abbildungsverzeichnis 8. Tabellenverzeichnis 9. Literaturverzeichnis 10. Anlagen 10.1 Selbstständigkeitserklärung 10.2 Curriculum Vitae 10.3 Publikationen 10.4 Danksagung

Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\'s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen. / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\'s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.

Einleitung: Die Ausbildung eines Netzhautödems ist eine Hauptursache für die Verschlechterung des Sehvermögens bei ischämisch-hypoxischen und inflammatorischen Netzhauterkrankungen. Neben der erhöhten Permeabilität der Blut-Retina-Schranke trägt eine Wasserakkumulation in Netzhautzellen zur Ausbildung eines Netzhautödems bei. Müllerzellen regulieren die retinale Ionen- und Osmohomöostase, indem sie einen transzellulären Ionen- und Wassertransport vermitteln. Zudem kontrollieren Müllerzellen die Größe des Extrazellularraumes, indem sie bei neuronaler Aktivität eine Zellkörperschwellung – ausgelöst durch eine Verkleinerung der extrazellulären Osmolarität – verhindern. Unter pathologischen Bedingungen ist die Volumenregulation gestört, sodass Müllerzellen bei Hypoosmolarität anschwellen. Diese Müllerzellschwellung und eine Glutamat-induzierte Schwellung retinaler Neurone tragen zur Ausbildung eines zytotoxischen Netzhautödems bei. Neuroprotektive Faktoren wie BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und bFGF (basic fibroblast growth factor) stimulieren das Überleben retinaler Neurone und verzögern so die retinale Degeneration. Zielstellung: Es war zu zu ermitteln, ob BDNF die zytotoxische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen der Rattennetzhaut verhindert. Material und Methoden: Es wurden Netzhautschnitte und isolierte Müller- und Bipolarzellen von 55 adulten Long-Evans-Ratten (durchschnittlich 8-15 Zellen pro Versuchsreihe) verwendet. Eine osmotische Schwellung von Müller- und Bipolarzellen wurde durch eine Superfusion der Schnitte oder der Zellen mit einer 60%igen hypoosmolaren Lösung in Ab- oder Anwesenheit von Bariumchlorid induziert. Die maximale Querschnittsfläche von Müller- und Bipolarzellsomata wurde vor und nach einer vierminütigen Superfusion mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop aufgezeichnet. Die nach der Superfusion ermittelte Querschnittsfläche wurde zu den anfänglich gemittelten Kontrollwerten in Beziehung gesetzt und prozentual als Mittelwert mit Standardfehler bestimmt. Mit Hilfe des Prism-Statistikprogramms (Graphpad) wurden die Ergebnisse mittels einem one-way ANOVA Test und einem nachfolgenden Bonferroni\''s multiple comparison Test sowie durch einen Mann-Whitney U Test statistisch analysiert. Ergebnisse: Bei Anwesenheit von BDNF wurde die osmotische Schwellung von Müllerzellen konzentrationsabhängig sowohl in Netzhautschnitten als auch in isolierten Zellen inhibiert. Ebenso inhibierte BDNF konzentrationsabhängig die Schwellung von Bipolarzellen in Netzhautschnitten, jedoch nicht in isolierten Zellen. In Schnitten von postischämischen Netzhäuten bewirkte BDNF eine Schwellungsinhibition von Müllerzellen, nicht aber von Bipolarzellen. Mit pharmakologischen Blockern wurde die durch BDNF induzierte Signalkaskade untersucht. Die BDNF-Schwellungsinhibition von Müllerzellen wurde durch eine Aktivierung von TrkB bewirkt. Die TrkB-Aktivierung führte in Müllerzellen zu einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren sowie zu einer Aktivierung einer glutamatergen-purinergen Signalkaskade, von der bekannt ist, dass sie die osmotische Müllerzellschwellung unterdrückt. Da bFGF die osmotische Müllerzellschwellung inhibiert, wird die Transaktivierung der FGF-Rezeptoren wahrscheinlich durch eine BDNF-induzierte Freisetzung von bFGF aus Müllerzellen vermittelt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass BDNF indirekt auf Bipolarzellen wirkt, indem es eine Freisetzung von Faktoren wie bFGF aus Müllerzellen induziert. Schlussfolgerungen: Die Schwellungsinhibition von Müller- und Bipolarzellen könnte ein neuroprotektiver Mechanismus von BDNF in der Netzhaut darstellen. Während BDNF direkt TrkB auf Müllerzellen aktiviert, ist die Inhibition der Bipolarzellschwellung indirekt und durch die Ausschüttung von glialen Faktoren wie bFGF vermittelt. Der Verlust des Effektes von BDNF auf die Bipolarzellschwellung in ischämischen Netzhäuten könnte darauf zurückzuführen sein, dass gliotische Müllerzellen keine glialen Faktoren mehr in Reaktion auf BDNF freisetzen. Der Verlust des glialen Einflusses auf die Bipolarzellvolumenhomöostase könnte zur Neurodegeneration in der ischämischen Netzhaut beitragen.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109 / Introduction: Tissue edema is a major blinding complication of ischemic-hypoxic and inflammatory retinal diseases. In addition to the hyperpemeability of the blood-retinal barrier, water accumulation in retinal cells resulting in cellular swelling may contribute to the development of retinal edema. Müller glial cells regulate the retinal ion and water homeostasis by allowing transcellular ion and water fluxes. During neuronal activity Müller cells control the extracellular space volume by autocrine inhibition of cellular swelling caused by the reduction of extracellular osmolarity. However, under pathological conditions, Müller cells are not capable to regulate their volume so that they swell rapidly under hypoosmolarity. The osmotic swelling of Müller glial cells and the glutamate induced swelling of retinal neurons contribute to the development of cytotoxic retinal edema. Various neuroprotective factors including brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulate the survival of retinal neurons and thus delay the retinal degeneration. Objective: The objective of the study is to determine whether BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells of the rat retina. Material and Methods: Retinal slices and freshly isolated Müller and bipolar cells of 55 adult Long-Evans rats (in average 8-15 cells per trial) were used. Osmotic swelling of Müller and bipolar cells was induced by superfusion of retinal slices or isolated cells with a 60% hypoosmotic extracellular solution in the absence or presence of barium chloride. The maximal cross-sectional area of Müller and bipolar cell somata was recorded before and after a four minute-long superfusion by using a laser scanning microscope. To determine the extent of cell soma swelling, the cross-sectional area of the cell body extent after superfusion was related to the former averaged cross-sectional area. Results were given as means with standard error as percent values. Statistical analysis was made with Prism (Graphpad) and the significance was determined by the One-way ANOVA test followed by Bonferroni\''s multiple comparison test and the Mann-Whitney U test, respectively. Results: We found that BDNF inhibits dose-depending the osmotic swelling of Müller cells in retinal slices and of isolated cells. BDNF also inhibited dose-depending the osmotic swelling of bipolar cells in retinal slices; however, it did not inhibit the osmotic swelling in isolated bipolar cells. In slices of postischemic retinas, BDNF inhibited the swelling of Müller cells but not the swelling of bipolar cells. The BDNF induced signal transduction cascade was examined by simultaneous administration of blocking agents with the receptor agonists in the hypoosmotic solution. The BDNF-induced inhibition of the osmotic Müller cell swelling was mediated by activation of TrkB. Activation of TrkB in Müller cells results in transactivation of FGF receptors and in an activation of a glutamatergic-purinergic signal transduction cascade which is known to inhibit the osmotic swelling of the cells. Since bFGF also inhibits the osmotic swelling of Müller cells, it can be assumed that the transactivation of FGF receptors is mediated by a BDNF-induced release of bFGF from Müller cells. The results suggest that the effect of BDNF on bipolar cells is indirect by inducing a subsequent release of glial factor from Müller cells such as bFGF. Conclusion: The results show that BDNF inhibits the osmotic swelling of Müller and bipolar cells. The inhibition of cytotoxic cell swelling may contribute to the neuroprotective action of BDNF in the retina. While BDNF acts directly in Müller cells, the BDNF-induced inhibition of the bipolar cell swelling is indirect and mediated by the release of glial factors such as bFGF from Müller cells. The abrogation of the BDNF-induced inhibition of the osmotic bipolar cell swelling in the postischemic retina could be explained with the impairment of the release of glial factors by Müller cells. The abrogation of the Müller cell-mediated regulation of the bipolar cell volume could contribute to the neuronal degeneration in the ischemic retina.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS XI TABELLENVERZEICHNIS XIV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Sehorgan - Das Auge 3 2.2 Retina beim Mensch und Tier – Aufbau und Funktionalitäten 4 2.2.1 Bildprozessor der Tierwelt – Die Retina 10 2.2.2 Die Sehbahn – Visuelle Verarbeitung 10 2.2.3 Die Müllerzelle – Vorkommen und Funktion 13 2.2.4 Tierartlicher Vergleich der Müllerzelle 14 2.2.5 Netzhaut als Modellgewebe 16 2.3 Ödembildung: Netzhautödem – Hirnödem 17 2.3.1 Allgemein: Die Pathogenese des Ödems 17 2.3.2 Das Gehirnödem – Ursachen und Folge 17 2.3.3 Das Netzhautödem – Ursachen und Folge 18 2.3.4 Volumen- und Osmohomöostase der Retina 19 2.3.5 Osmotische Schwellung und Osmoregulation der Müllerzelle 19 2.4 Neuroprotektion durch Neurotrophine und Wachstumsfaktoren 21 2.4.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 21 2.4.2 Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 22 2.4.3 Neuroprotektive Effekte von BDNF und bFGF in der Retina 23 2.5 Zielstellung 24 2.6 Veterinärmedizinische Relevanz 25 2.6.1 Augenerkrankungen in der Klein- und Großtiermedizin 25 2.6.2 Schlussfolgerung für die Tiermedizin 31 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 Versuchstiere 32 3.2 Material 32 3.2.1 Chemikalien und Reagenzien 32 3.2.2 Lösungen 33 3.2.3 Testsubstanzen 33 3.2.4 Pharmakologische Blocker 33 3.2.5 Antikörper 35 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 36 3.4 Versuchsaufbau und Durchführung von Schwellungsversuchen 37 3.4.1 Gewebspräparation: Retina 37 3.4.2 Zellschwellungsversuche 39 3.4.3 Aufnahmetechnik 40 3.4.4 Superfusion von Retinaschnitten 40 3.4.5 Superfusion von isolierten retinalen Zellen 41 3.4.6 Das Physiologie-Modell: Isoosmolarität – Hypoosmolarität 42 3.4.7 Das Pathologie-Modell mit Barium 42 3.4.8 Tiermodell der retinalen Ischämie – Reperfusion 43 3.5 Auswertungsverfahren 43 3.5.1 Morphometrie der Somata 44 3.5.2 Statistische Analyse 44 3.6 Immunozytochemische Färbungen 45 4 ERGEBNISSE 46 4.1 Zellidentifikation in Retinaschnitten 46 4.1.1 Färbemethodik – MitoTracker Orange 47 4.1.2 Morphologie der Müllerzelle 47 4.1.3 Morphologie der Bipolarzelle 48 4.1.4 Identifikation von Müller- und Bipolarzellen 48 4.1.5 Morphologie isolierter Müller – und Bipolarzellen 49 4.2 Kontrollversuche 50 4.3 Untersuchung des Schwellungsverhaltens mit Testsubstanzen 51 4.4 Untersuchung des Schwellungsverhalten unter BDNF 52 4.4.1 Morphologie der Müllerzellen in Retinaschnitte unter BDNF 52 4.4.2 Wirkung von BDNF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 53 4.4.3 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Müllerzellen 57 4.4.4 Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 58 4.4.5 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von BDNF auf die osmotische Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 59 4.4.6 Wirkung von BDNF auf die Schwellung von isolierten Bipolarzellen 61 4.4.7 Wirkung von BDNF auf die osmotische Müller- und Bipolarzellschwellung in der postischämischen Retina 62 4.5 Untersuchung der osmotischen Schwellung von retinalen Zellen unter bFGF 63 4.5.1 Wirkung von bFGF auf Müllerzellen in Retinaschnitten 63 4.5.2 bFGF-induzierte Transaktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren in Müllerzellen 65 4.5.3 Wirkung von bFGF auf die Schwellung von Bipolarzellen in Retinaschnitten 65 4.6 Immunozytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in Müller- und Bipolarzellen 66 4.6.1 Kontrollaufnahmen 66 4.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Müllerzellen 67 4.6.3 Immunzytochemischer Nachweis von BDNF und TrkB in isolierten Bipolarzellen 69 5 DISKUSSION 71 5.1 Osmotische Volumenregulation bei Müller- und Bipolarzellen 71 5.2 Immunozytochemische Lokalisation von BDNF und TrkB 73 5.3 Inhibition der osmotischen Schwellung von Müller- und Bipolarzellen durch BDNF 75 5.4 TrkB-Aktivierung in Müllerzellen durch BDNF 77 5.5 Abhängigkeit des BDNF-Effekts von einer Transaktivierung von FGF-Rezeptoren 78 5.6 Indirekte Wirkung von BDNF auf die Bipolarzellschwellung durch gliale Faktoren 79 5.7 Abhängigkeit der BDNF-Wirkung von der Transaktivierung weiterer Rezeptoren 80 5.8 BDNF-induzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Müllerzellen 81 5.9 BDNF-induzierte Signalkaskade der Inhibition der retinalen Zellschwellung 82 5.10 Neuroprotektive Wirkung von BDNF 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 SUMMARY 88 8 BILDQUELLENVERZEICHNIS 90 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 DANKSAGUNG 109

Die bakterielle Meningitis verursacht oft motorische Ausfälle, Anfälle, Hörverlust und kognitive Störungen trotz adäquater Antibiose. Streptococcus pneumoniae ist der häufigste Auslöser einer bakteriellen Meningitis des Erwachsenen und verursacht neuronale Apoptose im Hippocampus. Die Apoptose der Hippocampusneurone bei der experimentellen Pneumokokkenmeningitis war zum Teil durch Caspase-3 vermittelt und hing von der Entzündungsreaktion im Liquor ab. Sowohl Caspase-Inhibition als auch Hemmung der intrathekalen Entzündung reduzierten den neuronalen Zelltod. Jedoch konnte durch beide Therapiestrategien neuronaler Zelltod nicht komplett verhindert werden, was auf Caspase- und Entzündungs-unabhängige Zelltodmechanismen hinweist. Bakterielle Faktoren spielten eine wichtige Rolle für die neuronale Apoptose sowohl in vitro als auch in vivo. Pneumokokken induzierten neuronale Apoptose in vitro bei Abwesenheit von Entzündungszellen ohne jegliche Caspasenaktivierung. Vielmehr kam es dabei zu einem raschen intrazellulären Anstieg von Kalzium und reaktiven Sauerstoffradikalen sowie zu einer frühen Mitochondrienschädigung. Geschädigte Mitochondrien setzten den Apoptose-induzierenden Faktor AIF frei, welcher nach nukleärer Translokation zur Apoptose führte. Intrazytoplasmatische Injektion von anti-AIF Antikörpern blockierte die Apoptose. Diese Resultate belegen eine essentielle Rolle der Mitochondrienschädigung und AIF-Freisetzung bei der Pneumokokken-induzierten Apoptose. Als Haupttrigger neuronaler Apoptose konnten zwei Schlüsseltoxine sowohl in vitro als auch in vivo identifiziert werden: Pneumolysin und H2O2. Pneumolysin verursachte einen raschen Anstieg von intrazellulärem Kalzium, eine rasche Zerstörung von Mitochondrien und eine damit einhergehende Freisetzung von AIF. Kalzium-Chelation blockierte AIF-Freisetzung und Zelltod. In der experimentellen Pneumokokkenmeningitis verursachten Bakterien, in denen beide Toxine inaktiviert wurden, eine deutlich geringere neuronale Schädigung. Neue adjunktive Therapien für die Klinik könnten resultieren aus: Caspase-Inhibition, Blockade der Entzündung, anti-oxidative Strategien und Inaktivierung bakterieller Toxine. / Bacterial meningitis often causes motor deficits, seizures, hearing loss or cognitive impairment, despite adequate bacterial killing by antibiotics. Streptococcus pneumoniae is the most common cause of adult bacterial meningitis damaging the hippocampus by inducing neuronal apoptosis. Neuronal hippocampal apoptosis in experimental pneumococcal meningitis was mediated in part by caspase-3 and derived from the inflammatory response in the cerebrospinal fluid. Caspase inhibition and blocking of intrathecal inflammation significantly reduced hippocampal neuronal cell death. However, both strategies did not prevent completely neuronal death indicating caspase- and inflammation-independent mechanisms. Bacterial factors play an essential role in neuronal apoptosis both in vivo and in vitro. Exposure of neurons to live pneumococci in vitro in the absence of inflammation induced rapid apoptosis, which was not associated with the activation of caspases. Rather, apoptosis was attributed to rapid increase of intracellular calcium and reactive oxygen species and early damage to mitochondria. This was followed by the release of apoptosis-inducing factor (AIF) from the mitochondria, its nuclear translocation and apoptosis. Furthermore, intracytoplasmatic microinjection of AIF-specific antiserum markedly impaired pneumococcus-induced apoptosis. These findings indicate that mitochondrial damage and AIF play a central role in brain cell apoptosis and bacterial pathogenesis. Two key toxins of Streptococcus pneumoniae inducing apoptosis were identified in in vitro and in vivo experiments: pneumolysin and hydrogen peroxide. Pneumolysin induced increases of intracellular calcium, damage of mitochondria and release of AIF. Chelating calcium effectively blocked AIF release and cell death. Infection with pneumococci unable to produce pneumolysin and hydrogen peroxide significantly reduced damage in experimental pneumococcal meningitis. New adjunctive therapeutic strategies in clinics may result from caspase-inhibition, blocking of inflammation, anti-oxidative strategies and inactivation of bacterial toxins.