Charcot-Marie-Tooth Neuropathien sind die häufigsten hereditären Erkrankungen des peripheren Nervensystems und dennoch bis heute nicht therapierbar. Die Lebensqualität der Patienten ist durch motorische und sensorische Defizite der Extremitäten häufig stark eingeschränkt. Ursache können unter anderem Mutationen in Schwann-Zellen sein, die zu dem typischen Bild von Demyelinisierung und axonalem Schaden führen. In den letzten Jahren konnte in Mausmodellen das Immunsystem als wichtiger Mediator in der Pathogenese der CMT 1 Subtypen A, B und X identifiziert werden. Insbesondere Makrophagen spielen eine tragende Rolle bei dem Verlust der axonalen Integrität, bei der Schädigung der Myelinscheiden, sowie bei der Dedifferenzierung von Schwann-Zellen. Entscheidender Faktor für Proliferation und Aktivierung der Makrophagen ist hierbei das Zytokin CSF-1, dessen korrespondierender Rezeptor auf Makrophagen exprimiert wird. Der CSF-1/CSF1R Signalweg bietet somit einen vielversprechenden Angriffspunkt. In der vorliegenden Arbeit wurden Mausmodelle der CMT 1 Subtypen A, B und X mit einem niedermolekularen CSF-1-Rezeptor Inhibitor behandelt. Anschließend erfolgte eine funktionelle und strukturelle Auswertung der peripheren Nerven. Das beste Ansprechen auf die Therapie zeigten Cx32def Mutanten. Strukturell fielen ein verringerter axonaler Schaden und eine verbesserte axonale Regenerationsfähigkeit sowie erhaltene neuromuskuläre Synapsen auf. Funktionell äußerte sich dies in verbesserten elektrophysiologischen Parametern und einem Krafterhalt, welcher als klinischer Parameter die größte Relevanz für betroffene Patienten hat und somit besonders hervorzuheben ist. Auch P0het Mutanten zeigten Verbesserungen nach der CSF1RI Behandlung. Anders als bei Cx32def Tieren zeigte sich hier jedoch vor allem ein Erhalt der Myelinintegrität. Weiterhin wirkte sich die Therapie positiv auf elektrophysiologische Parameter und Krafttests aus. Vor allem besonders stark betroffene Individuen schienen hierbei von der CSF1RI Behandlung zu profitieren. Bei PMP22tg Mutanten hingegen konnten keine positiven Effekte der CSF1RI Behandlung nachgewiesen werden. Strukturelle und funktionelle Parameter behandelter Tiere unterschieden sich nicht von unbehandelten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Relevanz der sekundären Entzündungsreaktion in CMT 1 Neuropathien als wichtigen Mediator in der Pathogenese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Intervention im CSF-1/CSF1R Signalweg einen vielversprechenden möglichen Ansatz für die Therapie der bisher nicht behandelbaren CMT 1 Subypen X und B darstellt. Unausweichlich ist hierbei ein möglichst früher Therapiestart vor Ausprägung der ersten molekularen und histologischen Veränderungen. Im Hinblick auf die nicht die Lebenserwartung reduzierende Erkrankung muss ferner eine Minimierung der Nebenwirkungen der Therapie gewährleistet sein. Besonders hervorzuheben ist hier die Verwendung eines Inhibitors, welcher nicht in das zentrale Nervensystem vordringen kann und somit die Funktion der Mikroglia nicht beeinträchtigt. / Charcot-Marie-Tooth neuropathies are the most abundant inherited disorders of the peripheral nervous system, caused by a various number of mutations in schwann cell proteins which lead to the typical outcome with demyelination and axonal damage. Affected Patients suffer from motor and sensory deficits of the upper and lower extremities. To this day there is no specific therapy available. Within the last years the immune system has been identified as a mediator in the pathogenesis oft the CMT 1 subtypes A, B and X. It was shown that macrophages play a crucial role in demyelination, loss of axonal integrity and schwann cell dedifferentiation. As main factor for macrophage proliferation and differentiation cytokine CSF-1 has been identified which corresponding receptor is expressed on the outer surface oft he macrophages. Hence the CSF-1/CSF1R signalling pathway represent a promising target for pharmacological approaches. In this study we treated mouse models of CMT 1 subtypes A, B and X with a small-molecule CSF-1-receptor inhibitor, followed by histological and functional evaluation of peripheral nerves and muscles. The best response to the treatment was observed in Cx32def mutants. The treatment resulted in reduced axonal damage, improved axonal regeneration and preserved neuromuscular junctions. In addition we found improved functional parameters in grip strength testing and in electrophysiological studies. In contrast to Cx32def mutants, the characteristic feature observed in P0het mutants after CSF-1-receptor inhibitor treatment was preserved myelin integrity. Especially strongly affected individuals seemed to benefit from the treatment. PMP22tg mutants did not respond to CSF-1-receptor inhibitor treatment. The results of this study emphaize the importance of low-grade secondary inflammation as a desease amplifier in CMT 1 neuropathies. Furthermore we could show that targeting the CSF-1/CSF1RI signalling pathway might represent a promising treatment approach for CMT 1 subtypes X and B. It should be started preferably in early childhood before the developement of the typical histopathological alterations.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) Neuropathien stellen als häufigste erblich bedingte neurologische Erkrankungen eine Gruppe genetisch heterogener, chronisch progredienter peripherer Polyneuropathien dar. Die Lebensqualität der Patienten ist bei fehlender kurativer Therapieoption vor allem durch motorische und sensorische Defizite deutlich eingeschränkt. In verschiedenen Studien konnte die pathophysiologische Relevanz einer sekundären Entzündungsreaktion, insbesondere durch Makrophagen und Lymphozyten vermittelt, in Mausmodellen dreier CMT1 Subtypen (CMT1A, CMT1B, CMT1X) aufgezeigt werden. Auch in Folge einer Läsion peripherer Nerven ist eine akute Entzündungsreaktion von entscheidender Bedeutung, wobei sich bereits Gemeinsamkeiten zwischen der postläsionalen Waller´schen Degeneration (WD) und CMT1 Neuropathien identifizieren ließen. Während die aktive Beteiligung der Autophagie Schwann´scher Zellen (hier kurz SZ Autophagie genannt) an der Myelindegradation im Falle einer WD jedoch vielfach beschrieben wurde, ist Ähnliches in CMT1 Neuropathien bisher nur unzureichend untersucht. Da in einer Studie in Cx32def Mausmodellen der CMT1X Erkrankung auch nach Reduktion endoneuraler Makrophagen anhaltende Demyelinisierung beobachtet werden konnte, sollte das Vorkommen von SZ Autophagie sowie deren mögliche Beeinflussung durch Makrophagen in diesen Myelinmutanten untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Wildtyp (Wt) Mäuse in ex vivo und in vivo Modellen einer WD als auch Cx32def Myelinmutanten zweier Altersstufen (4 und 12 Monate) mit einem niedermolekularen CSF1-Rezeptor-Inhibitor (CSF1RI) zur Reduktion endoneuraler Makrophagen behandelt, wobei sich vergleichende histochemische bzw. immunhistochemische Analysen peripherer Nerven behandelter und unbehandelter Tiere anschlossen. Im Rahmen der Etablierung immunhistochemischer Methodik zeigte sich hierbei unter den kontrollierten Bedingungen einer ex vivo Ischiasnervenkultur eine vermehrte Aktivierung der SZ Autophagie in behandelten Wt Mäusen. Auch 4 Monate alte behandelte Cx32def Tiere wiesen, verglichen mit unbehandelten Myelinmutanten bzw. Wt Mäusen derselben Altersstufe, eine vermehrte autophagische Aktivität in SZ auf. Diese scheint sich jedoch im weiteren Verlauf der Erkrankung zu reduzieren, da im Falle der 12 Monate alten Cx32def Modelltiere weniger autophagisch aktive SZ Profile bzw. kaum Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Tieren beobachtet werden konnten. Die Ergebnisse lassen somit eine mögliche aktive Beteiligung von SZ Autophagie insbesondere in der Pathophysiologie der frühen Phase einer CMT1X Erkrankung sowie deren Beeinflussung durch endoneurale Makrophagen vermuten. Dies sollte vornehmlich in der Entwicklung von Therapiestrategien der CMT1X bedacht werden, da sich eine frühe Reduktion pathophysiologisch relevanter endoneuraler Makrophagen somit auch nachteilig auf die Myelinintegrität auswirken könnte. / Charcot-Marie-Tooth (CMT) neuropathies are the most common hereditary neurological diseases and represent a group of genetically heterogeneous, chronically progressive peripheral polyneuropathies. In the absence of curative treatment options, patients' quality of life is significantly impaired, primarily due to motor and sensory deficits. Various studies have demonstrated the pathophysiological relevance of a secondary inflammatory reaction, in particular mediated by macrophages and lymphocytes, in mouse models of three CMT1 subtypes (CMT1A, CMT1B, CMT1X). An acute inflammatory reaction is also of crucial importance following a lesion of peripheral nerves, whereby similarities between postlesional Wallerian degeneration (WD) and CMT1 neuropathies have already been identified. However, while the active involvement of Schwann cell autophagy (here referred to as SC autophagy) in myelin degradation in WD has been widely described, a similar involvement in CMT1 neuropathies has been insufficiently studied. Since in a study in Cx32def mouse models of CMT1X disease persistent demyelination could be observed even after reduction of endoneural macrophages, the occurrence of SC autophagy and its possible influence by macrophages in these myelin mutants should be investigated. In the present study, both wild-type (Wt) mice in ex vivo and in vivo models of WD and Cx32def myelin mutants of two ages (4 and 12 months) were treated with a small molecule CSF1 receptor inhibitor (CSF1RI) to reduce endoneural macrophages, followed by comparative histochemical and immunohistochemical analyses of peripheral nerves of treated and untreated animals, respectively. During the establishment of immunohistochemical methods, an increased activation of SC autophagy was shown in treated Wt mice under the controlled conditions of ex vivo sciatic nerve culture. Even 4-month-old treated Cx32def animals showed increased autophagic activity in SC compared to untreated myelin mutants or Wt mice of the same age. However, this appears to be reduced as the disease progresses, since in the case of the 12-month-old Cx32def model animals fewer autophagically active SC profiles or hardly any differences between treated and untreated animals could be observed. The results thus suggest a possible active involvement of SC autophagy, particularly in the pathophysiology of the early phase of CMT1X disease and its influence by endoneural macrophages. This should primarily be considered in the development of therapeutic strategies for CMT1X, as an early reduction of pathophysiologically relevant endoneural macrophages could therefore also have a detrimental effect on myelin integrity.

Makrophagen sind professionelle phagozytische Zellen, welche körpereigene gealterte oder toten Zellen und in den Körper eingedrungene Krankheitserreger aufnehmen. Die phagozytierten Partikel werden von lysosomalen Hydrolasen abgebaut und daraus hervorgehende Antigene an Zellen des spezifischen Immunsystems präsentiert. Aufgabe der lysosomalen Phospholipase A1 (PLA1) ist der Abbau von Phospholipiden. Sie spielt damit nicht nur eine elementare Rolle bei dem Abbau von Phospholipidmembranen nach Phago- und Autophagozytose, sondern kann auch an der Generation von Lipidantigenen beteiligt sein. Die vorliegende Arbeit bietet zum ersten Mal Hinweise auf die Sequenz der lysosomalen PLA1. Mittels proteinbiochemischer Reinigung und nachfolgender massenspektrometrischer Sequenzanalyse wurden zwei Proteinkandidaten identifiziert, welche der lysosomalen PLA1-Aktivität zugrunde liegen können. Des Weiteren werden ausführliche Untersuchungen zu den Katalyseeigenschaften des Enzyms an Liposomen präsentiert. Die Lipidzusammensetzung der Membran beeinflusst maßgeblich die Aktivität der lysosomalen PLA1. So haben in die Membran integrierte anionische Phospholipide eine stark enzymaktivierende Wirkung. Eine Erhöhung der Ionenstärke oder des pH-Wertes vermindern die Bindungsfähigkeit der lysosomalen PLA1 an die Membran und damit deren Aktivität. Dies lässt vermuten, dass elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle bei der Membranbindung spielen. Das Enzym besitzt pIs / Macrophages are professional phagocytes which engulf and degrade senescent and dead cells as well as pathogens. Phagocytosed particles are subsequently degraded by lysosomal enzymes. The lysosomal phospholipase A1 (PLA1) degrades phospholipids, the major components of biological membranes and, hence, plays a mandatory role in decomposition of phagocytosed and autophagocytosed membranes. Furthermore the enzyme might play a role in the processing of lipid antigens for immune presentation. Nevertheless, the gene encoding this important enzyme activity is as yet unknown. Here, we used proteinbiochemical methods to isolate the lysosomal PLA1 activity from RAW B cells and identified resulting sequences by tandem mass spectrometry. This analysis revealed for the first time two putative protein candidates responsible for lysosomal PLA1 activity. Using native enzyme fractions and liposome-embedded substrate, we show that PLA1 activity depends on the presence of anionic phospholipids, low pH and low ionic strength. Lysosomal PLA1 only attaches to membranes with anionic but not zwitterionic charges. High ionic strength impairs binding demonstrating that electrostatic attraction is responsible for membrane partitioning. Upon binding the enzyme remains on membranes for numerous catalytic cycles. The enzyme’s pIs at

Die Polarisierung von Makrophagen resultiert in einer Vielzahl von Subtypen, z.B. M1 oder M2. In dieser Studie lege ich die Makrophagen-Polarisierung im allergischen Asthma mit Fokus auf microRNA (miRNA) dar. Nach Etablierung von Subtyp–charakteristischen mRNA und miRNA Expressionsprofilen in vitro polarisierter, humaner blutstämmiger Makrophagen wurden diese Profile genutzt, um den Polarisierungsstatus isolierter Lungenmakrophagen in einem Mausmodell des Asthmas zu ermitteln. Es wurden humane blutstämmige Makrophagen in vitro durch IFNg/LPS (M1) bzw. IL4/IL13 (M2) polarisiert. M1-assoziierte Gene waren TNFa, IL6 und IL1b, während in M2 Makrophagen eine Induktion von CD209 und PPARg beobachtet wurde. Herauf-regulierte miRNAs waren z.B. hsa-miR-187-3p, hsa-miR-155-5p und hsa-miR-146a-5p (M1) bzw. hsa-miR-193b-3p und hsa-miR-511-5p (M2). Eine in silico Vorhersage von mRNA/miRNA Interaktionspartnern wurde in einem Luciferase Reportermodell überprüft, das u.a. hsa-miR-187-3p als Regulator von SH2B2 und hsa-miR-187-3p sowie hsa-miR-155-5p als kooperative Regulatoren von LAMP2 bestätigte. Unter physiologischen Bedingungen regulierte hsa-miR-187-3p die SH2B2 mRNA herunter, aber es lag kein Einfluß von hsa-miR-187-3p oder hsa-miR-155-5p auf LAMP2 mRNA oder Protein vor. Weiterhin wurden die miRNA Profile von murinen Makrophagen erhoben, die aus der bronchoalveolären Lavage und aus Lungengewebe gewonnen wurden. Diese Profile wurden in einer vergleichenden Analyse von gesunden Mäusen und Mäusen mit akuter Ovalbumin-induzierter eosinophiler Atemwegsentzündung eingesetzt. In Reaktion auf Ovalbumin regulierte miRNAs waren z.B. mmu-miR-21a-5p und mmu-miR-155-5p (heraufreguliert), sowie mmu-miR-126-3p und mmu-miR-146a-5p (herunterreguliert). Sowohl M1 als auch M2 assoziierte Muster zeigten sich vor allem in der reziproken Regulation von mmu-miR-155-5p (heraufreguliert) und mmu-miR-146a-5p (herunterreguliert). / Macrophage polarization gives rise to a plethora of macrophage subtypes, e.g. M1 or M2. In this thesis, I aim to point out some features of macrophage polarization in allergic asthma with a focus on microRNA (miRNA). The chosen approach started with the establishment of subtype-characteristic mRNA and miRNA profiles of in vitro polarized human macrophages. In a second step, the miRNA patterns were used to interpret the polarization status of isolated lung macrophages from a murine model of asthma. In vitro polarization of human blood-derived macrophages was performed by IFNgLPS (M1) and IL4/IL13 (M2), and global mRNA and miRNA profiling ensued. M1-induced genes included TNFa, IL6 and IL1b, whereas in M2 macrophages, CD209 and PPARg were induced. M1-associated miRNAs were hsa-miR-187-3p, hsa-miR-155-5p and hsa-miR-146a-5p, while hsa-miR-193b-3p and hsa-miR-511-5p were induced in M2 macrophages. In silico prediction of mRNA/miRNA interaction partners was experimentally validated in a luciferase-based reporter assay that confirmed hsa-miR-187-3p as a regulator of SH2B2 and the pair of hsa-miR-187-3p and hsa-miR-155-5p as cooperative regulators of LAMP2. Under physiologic conditions, hsa-miR-187-3p was able to down-regulate SH2B2 transcript, but there was no impact of either hsa-miR-187-3p or hsa-miR-155-5p on LAMP2 mRNA or protein. Furthermore, the miRNA profiles of murine macrophages from the bronchoalveolar lavage fluid and from lung tissue were established and compared between healthy mice and mice with acute Ovalbumin-induced eosinophilic airway inflammation. Individual miRNAs responding to Ovalbumin were e.g. mmu-miR-21a-5p and mmu-miR-155-5p (up-regulated), and mmu-miR-126-3p and mmu-miR-146a-5p (down-regulated). Characteristics of both M1- and M2-associated miRNA patterns were most evident in the concomitant reciprocal expression of mmu-miR-155-5p (up-regulated) and mmu-miR-146a-5p (down-regulated).

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Die hier vorgestellte Studie untersucht systematisch die angeborene Immunabwehr gegen L. pneumophila auf Ebene des gesamten Wirtsorganismus, sowie auf molekularer Ebene in Alveolar- und Knochenmarksmakrophagen. Mittels in vivo Transkriptomanalysen werden Typ I und II Interferone (IFN) als Hauptregulatoren der frühen pulmonalen Genexpression in der L. pneumophila-Infektion identifiziert. Infektionsexperimente in Wildtyp- und IFN-Rezeptor-defizienten Tieren offenbaren, dass Typ I und II IFNe maßgeblich die antibakterielle Abwehr gegen L. pneumophila vermitteln. Für die Bekämpfung der Infektion in der Lunge werden CD11c+ Zellen als wichtigste Empfänger der IFN-Signale identifiziert. Des Weiteren wird durch Behandlung von CD11c+ Alveolarmakrophagen mit IFNen ex vivo das intrazelluläre bakterielle Wachstum inhibiert. Mittels subzellulärer quantitativer Massenspektrometrie wird gezeigt, dass die Proteinkomposition der Legionellen-enthaltenden Vakuole substanziell durch beide IFNe modifiziert wird. In einer vergleichenden Netzwerkanalyse werden diese Proteomdaten mit eigenen und öffentlich zugänglichen Transkriptomdaten verglichen. Hierdurch können klar abgegrenzte Untergruppen von einerseits transkriptionell durch IFN-regulierten Proteinen sowie andererseits ausschließlich räumlich IFN-regulierten Proteinen unterschieden werden. Unter den durch IFN an der Vakuole angereicherten Proteinen wird Immunoresponsive gene 1 (IRG1) als zentraler Effektor identifiziert, welcher das Wachstum von L. pneumophila durch die Produktion des antibakteriellen Metaboliten Itaconsäure inhibiert. Zusammenfassend stellt diese Studie eine umfassende Ressource von IFN-vermittelten Effekten auf die Genexpression sowie auf das Proteom der bakteriellen Vakuole dar und deckt einen zellautonomen Abwehrmechanismus gegen L. pneumophila auf, welcher durch die IRG1-abhängige Produktion von Itaconsäure vermittelt wird. / The study presented here systemically examines the innate immune response against L. pneumophila on whole organism level as well as on a molecular level within macrophages, L. pneumophilas’ host cell. In vivo transcriptome analyses identify type I and II interferons (IFNs) as master regulators of the early pulmonary gene expression during L. pneumophila infection. Infection experiments in wild-type mice and mice lacking type I and/or II IFN signaling reveal a severe defect of antibacterial defense when IFN signaling is absent. CD11c+ cells were found to be the main targets of IFNs to restrict infection in the lung, and IFNs inhibited bacterial growth in CD11c+ alveolar macrophages ex vivo. Subcellular quantitative mass spectrometry shows that both IFNs substantially modify the protein composition of Legionella-containing vacuoles. Comparative network analysis, combining these proteome data with transcriptome data as well as public database data reveals distinct subsets of transcriptionally regulated IFN-stimulated genes (ISGs) on the one hand, but interestingly also exclusively spatially IFN-regulated vacuolar proteins. Among IFN-regulated vacuolar proteins, Immunoresponsive gene 1 (IRG1) was identified as a central effector that restricts growth of L. pneumophila through production of the antibacterial metabolite itaconic acid in macrophages. Collectively, this study provides a comprehensive resource of IFN-mediated effects on gene expression and the bacterial vacuolar proteome, and uncovers a cell-autonomous defense pathway against L. pneumophila, which is mediated by IFNs, IRG1 and itaconic acid.

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Inflammatory processes mark all stages of atherogenesis. One of the key regulators of inflammation is the transcription factor nuclear factor kappa B (Nf-kb). Nf-kb is the general name for a whole family of dimeric transcription factors. One can distinguish between a classical and an alternative pathway with Rela/p50 (Nf-kb1) and Relb/p52 (Nf-kb2) representing the terminal transcription factors, respectively. Classical Nf-kb1 signaling has been associated with atherosclerotic lesion development many times, mainly because of its regulation of many pro-inflammatory proteins with an established role in atherogenesis. Recent studies provided evidence of crosstalk between classical Nf-kb1 and alternative Nf-kb2 signaling, implicating a potential role for Nf-kb2 in atherogenesis. The aim of the present study was to investigate the influence of Nf-kb2 on atherosclerotic lesion development in a knockout mouse model. Nfkb2 knockout (Nfkb2-/-) mice were generated on two different atherosclerosis sensible backgrounds, the Apoe- and Ldlr- deficient background. Quantification of atherosclerotic lesion development showed, that Nfkb2-/- mice developed significantly more atherosclerosis at the brachiocephalic artery than wild type controls, indicating a protective effect of Nf-kb2 on atherogenesis. Further expression analyses in bone marrow-derived macrophages (BMDM) revealed highly significant upregulation of matrix metalloproteinase 9 (Mmp9) in Nfkb2-/- mice. Overexpression of Mmp9 was associated with enhanced macrophage migration across extracellular matrix in vitro and an inflammatory plaque phenotype with advanced, macrophage-rich lesions. Accordingly, increased Mmp9 expression in Nfkb2-/- macrophages might have contributed to enhanced lesion development in these mice.

Vor zehn Jahren wurde der (Pro)Renin-Rezeptor [(P)RR] entdeckt und als neuer Bestandteil des Renin-Angiotensin-Systems beschrieben. Neuere Studien ergaben, dass der (P)RR mit der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase) assoziiert sein kann, weshalb er auch V-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2) genannt wird. In Osteoklasten befinden sich V-ATPase hauptsächlich an der zur Knochenoberfläche gerichteten Plasmamembran und transportieren Protonen in den extrazellulären Raum. Mäuse mit genetischer Deletion verschiedener V-ATPase-Untereinheiten charakterisiert durch einen Anstieg von Knochenmasse (Osteopetrose). In der vorliegenden Arbeit fanden wir heraus, dass (P)RR stark in reifen Osteoklasten in vitro und in vivo exprimiert wird. Mäuse mit genetischer Deletion des (P)RR in Osteoklasten wurden durch einen komplexen Knochen-Phänotyp mit reduzierter Knochendichte charakterisiert. (P)RR-defiziten Osteoklasten wiesen vermehrte Differenzierung und/oder Aktivität in vitro und in vivo auf. Wir postulieren deshalb, dass der (P)RR die in der Plasmamembran lokalisierten V-ATPase nicht direkt reguliert, sondern mit der physiologischen Aktivität der Osteoklasten durch andere Mechanismen interferiert. Macrophagen sind speziell auf die Immunabwehr ausgerichtete Fresszellen (Phagozyten). Phagozytose ist ein wesentlicher Zellprozess der die V-ATPase in Lysosomen braucht um die eingeschlossenen Pathogen zu zerstören. Wir generierten transgene Ratten mit konditionellen knockdown von (P)RR unter Nutzung eines Doxyzyclin-induzierten shRNA-Expressionssystems. Eine effiziente (P)RR-Depletion in Makrophagen wurde durch Behandlung mit Doxyzyclin in vivo im Trinkwasser und in vitro im Kulturmedium erreicht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Verschiebung des vesikulären pHs erst ziemlich spät nach (P)RR-Depletion auftritt. Wir fanden heraus, dass (P)RR-Depletion weder Phagozytose noch Endozytose beeinträchtigte, sondern für das Recycling des Transferrin-Rezeptors zur Plasmamembran wichtig ist. / A decade ago, the (pro)renin receptor [(P)RR] was discovered and depicted as a new component of the renin-angiotensin system. However, recent studies have put in evidence that the (P)RR associate with and regulate the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase), hence its other name vacuolar H+-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2). In osteoclasts, V-ATPases are mainly located at the plasma membrane facing the bone surface and extrude protons into the extracellular space. Mice with genetic deletion of various V-ATPase subunits are characterized by an increase of bone mass (osteopetrosis). In this work, we found that the (P)RR is highly expressed in mature osteoclasts in vitro and in vivo. Mice with genetic deletion of the (P)RR in osteoclasts developed a complex bone phenotype characterized by a reduced bone density. Osteoclasts lacking (P)RR displayed increased differentiation and/or activity in vitro and in vivo. We therefore suggest that the (P)RR does not directly regulate V-ATPases located at the plasma membrane but rather interferes with osteoclast physiology through other mechanisms. Macrophages are professionalized phagocytes crucial for immune response. Phagocytosis is an essential cellular process, which requires lysosomal V-ATPases for degradation of engulfed pathogens. We generated transgenic rats with a conditional depletion of the (P)RR with the use of a doxycycline-induced shRNA expression system. Efficient (P)RR depletion in macrophages was accomplished by doxycycline treatment in vivo in drinking water and in vitro in culture medium. In this work, we found that the impairment of vesicular pH occurs lately after (P)RR deletion. Also, we found that (P)RR deletion did not impair neither phagocytosis nor endocytosis but rather perturbed the recycling of the transferrin receptor to the plasma membrane.

Ziel dieser Dissertationsschrift war es, die Effekte des oxidativen Stresses in Form von oxLDL auf die Expression der atherogenen Scavenger-Rezeptoren CD36, SR-BI, des Transkriptionsfaktors PPARγ und pro-inflammatorischer Zytokine zu untersuchen. Die durchgeführten Untersuchungen beruhen auf der Annahme, dass modifizierte LDL durch Induktion der genannten Scavenger-Rezeptoren und nachfolgende unregulierte Aufnahme in Makrophagen mit Bildung von Schaumzellen entscheidend zur Entwicklung einer Atherosklerose beitragen. Dabei scheint vor allem die im Rahmen des oxidativen Stresses auftretende oxidative Modifizierung der LDL eine Rolle zu spielen. Oxidativem Stress wird in der Pathogenese vieler Krankheiten eine Bedeutung zugesprochen, deren pathobiochemische Grundlagen jedoch noch nicht vollständig geklärt sind und zu deren Erforschung diese Dissertation beitragen sollte. Im ersten Versuchsteil wurden deshalb in vitro – Versuche zu Expressionsraten oben genannter Rezeptoren durchgeführt. Dabei wurden Hypochlorit-oxidierte LDL genutzt, denen im Gegensatz zu den in vielen Versuchen verwendeten Kupfer-oxidierten LDL auch in vivo eine pathophysiologische Relevanz zukommt. Desweiteren ist bekannt, dass Diabetiker neben einem hohen Risiko an Atherosklerose zu erkranken, auch laborchemisch erhöhte Marker des oxidativen Stresses zeigen, inklusive einer gesteigerten Menge an zirkulierenden oxLDL. Im zweiten Versuchsteil wurde deshalb ex vivo untersucht, inwiefern LDL, gewonnen von Patienten im prädiabetischen Stadium der gestörten Glukosetoleranz, ähnliche Auswirkungen auf die Expression von Scavenger-Rezeptoren zeigen, wie in den mit Hypochlorit-oxidierten LDL durchgeführten in vitro - Untersuchungen beobachtet werden konnte. Es zeigte sich, dass CD36, der für die Aufnahme von oxidativ modifizierten LDL als der bedeutendste Rezeptor gilt, durch Hypochlorit-oxidierte LDL stark induziert wird. Zusammengenommen mit der ebenfalls beobachteten Heraufregulation des Transkriptionsfaktors PPARγ, sowie der signifikanten Korrelation beider Gene kann damit für Hypochlorit-oxidierte LDL eine atherogene Wirkung nachgewiesen werden. Die Ergebnisse bestätigen zudem die von Nagy und Tontonoz zuerst beschriebene Feed-Forward-Schleife, bei der oxidative LDL über Induktion und Aktivierung von PPARγ die Expression von CD36 erhöhen, mit nachfolgender unregulierter Aufnahme von Cholesterolestern in Makrophagen und subsequenter Bildung von Schaumzellen. Die Versuche zeigen zudem, dass der Scavenger-Rezeptor SR-BI, obwohl strukturell stark mit CD36 verwandt, eine differentielle Regulation aufweist und durch oxidativ modifizierte LDL signifikant supprimiert wird. Eine Induktion durch PPARγ, wie sie eindrucksvoll bei CD36 beobachtet werden kann, ist für SR-BI in den in vitro - Versuchen nicht vorhanden. Mit der in vielen Studien SR-BI, jedoch nicht CD36 zugesprochenen Funktion als Vermittler des HDL-Membranstransports gehen damit auch unterschiedliche Regulationsmechanismen einher. Die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine in murinen Makrophagen wurde durch Hypochlorit-oxidierte LDL im Vergleich mit nativen LDL signifikant vermindert, eine Assoziation mit dem Transkriptionsfaktor PPARγ konnte nicht gefunden werden. Die für die ex vivo - Versuche untersuchten Gruppen der insgesamt 40 Probanden mit gestörter und normaler Glukosetoleranz wiesen, mit Ausnahme eines pathologischen Glukosetoleranztests für IGT-Patienten, in der klinischen Untersuchung, beim Vergleich der Laborparameter, ebenso wie in der Zusammensetzung der LDL keine signifikanten Unterschiede auf. Dennoch fand sich eine signifikante Erhöhung der CD36-Expression in Makrophagen schon nach einstündiger Inkubation mit LDL aus IGT-Patienten im Vergleich zu LDL von Probanden mit normaler Glukosetoleranz. Für die Expressionsraten von SR-BI, PPARγ und die Zytokinausschüttung konnten nur marginale Unterschiede zwischen den Probandengruppen erfasst werden. Auch in den ex vivo – Untersuchungen wiesen eine insignifikante PPARγ - Erhöhung und eine positive Korrelation zwischen PPARγ und CD36 auf die Existenz und Aktivierung der beschriebenen atherogenen Feed-Forward-Schleife auch in IGT-Patienten hin. Zusammenfassend unterstreicht diese Dissertationsschrift die Bedeutung des oxidativen Stresses in der Entwicklung der Atherosklerose, indem erstmals auch für das pathophysiologisch relevante Hypochlorit-oxidierte LDL eine deutliche Expressionssteigerung des Scavenger-Rezeptors CD36 und des Transkriptionsfaktor PPARγ nachgewiesen werden konnte. Zudem zeigen die Experimente, dass bereits bei Patienten im Vorstadium des Diabetes mellitus Typ 2 funktionelle Veränderungen der LDL eingetreten sind, die zu einer verstärkten Atherosklerose führen können und die denen gleichen, die durch künstlich oxidierte LDL ausgelöst werden. Die Versuche liefern damit eine mögliche Erklärung für den bereits epidemiologisch nachgewiesenen Zusammenhang zwischen oxidativem Stress, Atherosklerose und Diabetes mellitus.