Helicobacter pylori ist ein humanpathogenes Bakterium, das den Magen kolonisiert und dadurch eine Immunantwort des Wirts induziert. Statt eine vollständige Eradikation von H. pylori durch die Immunreaktion zu erreichen, kommt es normalerweise zu einer lebenslangen Persistenz des Bakteriums und einer chronischen Infektion. Interessanterweise kommt es infolge einer Infektion zu einer Hochregulation der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), aber die zellulären Quellen und zugrundeliegenden Mechanismen von iNOS sind noch nicht vollständig verstanden. Der iNOS-abhängigen Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) können sowohl antimikrobielle als auch pathologische Eigenschaften zugeschrieben werden. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit iNOS-exprimierende Plasmazellen (PZ) aus der Magenmukosa H. pylori-infizierter Patienten isoliert und phänotypisch, vor allem mittels Durchflusszytometrie und molekularbiologisch hinsichtlich ihres Immunglobulin-Repertoires untersucht. Es wurde erstmals gezeigt, dass mukosale IgA-sezernierende PZ eine der wesentlichen iNOS+ Zelltypen während einer H. pylori-Infektion im Menschen darstellen und zusätzlich wurde ihre intrazelluläre NO-Produktion nachgewiesen. Da iNOS+ PZ in weiteren gastrointestinalen Infektionskrankheiten fehlten, scheint dies kein genereller Phänotyp von PZ der mukosalen Immunabwehr zu sein. Die Analyse der intrazellulären Zytokin-Expression der mukosalen B-Zellpopulationen in H. pylori-Patienten ergab eine Ko-Expression von IFN-γ und TNF-α in iNOS+ memory B-Zellen und eine TNF-α-Expression in iNOS+ PZ, aber nicht in den iNOS− Zellen. Die molekularbiologische Charakterisierung des Immunglobulin-Repertoires von iNOS+ und iNOS− PZ hinsichtlich der VHDJH-Regionen ergab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Isotyp-Verteilungen, der Nutzung der VH- und JH-Segmente, CDRH3-Längen sowie somatischen Mutationen und alle Antikörper zeigten typische Charakteristika einer T-zellabhängigen Affinitätsreifung. / Helicobacter pylori is a human-pathogenic bacterium that colonizes the stomach and thereby initiates host immune response. Instead of a complete eradication of H. pylori by the induced immune response, a lifelong bacterial persistence leads to chronic infections. Interestingly, up-regulation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been observed in gastric mucosal tissue during the course of H. pylori infection in humans, however the cellular sources and underlying mechanisms of iNOS induction are not fully understood. iNOS-dependent production of nitric oxide (NO) is one of the factors commonly linked to both, anti-microbial immunity and pathology. Therefore, in this thesis iNOS-expressing plasma cells (PCs) in the stomach mucosa of H. pylori-infected patients were isolated and phenotypically analyzed by flow cytometry, as well as screened using molecular techniques regarding their immunoglobuline (Ig) repertoires. For the first time, we identified mucosal IgA-producing PCs as a major iNOS+ cell population during H. pylori infection in humans, and additionally confirmed their intracellular nitric oxide production. Since iNOS+ PCs were not detectable in other gastrointestinal infectious diseases, this reaction does not seem to be a general feature of mucosal PCs under conditions of infection. Additionally, intracellular cytokine expression analyses of mucosal B-lineage cells isolated from H. pylori patients revealed a co-expression of IFN-γ and TNF-α in iNOS+ memory B cells and the expression of TNF-α in iNOS+ PCs, but not in iNOS− cells. Molecular analysis of the Ig repertoire of iNOS+ and iNOS− PCs of the VHDJH regions revealed no significant differences regarding the Ig isotype composition, VH and JH gene family usage, CDRH3 length, and frequency of somatic mutations and all antibodies were characterized by typical properties of T cell-dependent affinity maturation.

Bakterielle Glykanantigene sind hoch-divers in ihrer Komposition und Verbindung. Antikörper gegen Glykanantigene können vor bakteriellen Infektionen schützen und sind wichtig um die Homöostase zwischen dem Wirt und seinem Mikrobiom aufrecht zu halten. Typischerweise lösen Glykanantigene jedoch Antikörperantworten aus, die sich durch ein vermindertes B Zell-Gedächtnis und niedrig-affine Antikörper mit geringer Spezifität auszeichnen. In dieser Arbeit konnten, mithilfe von biotinylierten Lipopolysaccharide O-Antigenen des opportunistisch-pathogenen Bakteriums Klebsiella pneumoniae (Kp), O-Antigen-spezifische B Zellen innerhalb peripherer Gedächtnis- und intestinaler Effektor-B Zellen identifiziert werden. Durch Einzel-Zell Immunoglobulin-Sequenzierung und Klonierung bzw. rekombinanter Expression von Antikörpern dieser Zellen wird gezeigt, dass, unter natürlichen Umständen, affinitätsgereifte Antikörper gegen definierte Kp Glykanantigene erzeugt werden. Diese Antikörper binden nicht nur Kp O-Serotyp-spezifisch sondern auch spezifisch an strukturell ähnliche Kp O-Antigene und taxonomisch unterschiedliche Mikroorganismen. Die Ergebnisse zeigen, dass Menschen, bei natürlicher Besiedlung, kreuz-spezifische Antikörper gegen Glykanantigene erzeugen und deuten auf einen Mechanismus hin, wie das humorale Immunsystem auf die Glykandiversität des Mikrobioms reagieren und sich anpassen kann. Weiterhin könnten die hier identifizierten Antikörper nützlich für die Behandlung von nosokomiellen Kp Infektionen sein. / Bacterial glycan antigens are highly diverse in composition and linkage. Antibodies against glycan antigens can protect against bacterial infection and are important in maintaining homeostasis between the host and its microbiome. However, glycan antigens typically elicit B cell responses that have impaired long-term memory formation and are comprised of low-affine antibodies with low specificity. In this work, the use of biotinylated Lipopolysaccharide O-antigens of the opportunistic pathogen Klebsiella pneumonia allowed to identify anti-O-antigen B cells in the peripheral memory and intestinal effector B cell pool in healthy humans. Single B cell Immunoglobulin gene sequencing, antibody cloning, and recombinant expression reveal that, under natural circumstances, humans acquire affinity-matured antibodies against defined Kp glycan antigens. Despite their O-serotype-specificity, the antibodies bind to other structurally similar Kp O-serotypes and taxonomically distinct non-Kp microbes. The findings show that humans, under natural exposure, acquire affinity-matured cross-specific anti-glycan antibodies and provide a mechanistic way how the humoral immune system could adapt to the large microbial glycan diversity present in nature. Further, the antibodies identified in this work might be beneficial in treatment of nosocomial Kp infections.

Vor zehn Jahren wurde der (Pro)Renin-Rezeptor [(P)RR] entdeckt und als neuer Bestandteil des Renin-Angiotensin-Systems beschrieben. Neuere Studien ergaben, dass der (P)RR mit der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase) assoziiert sein kann, weshalb er auch V-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2) genannt wird. In Osteoklasten befinden sich V-ATPase hauptsächlich an der zur Knochenoberfläche gerichteten Plasmamembran und transportieren Protonen in den extrazellulären Raum. Mäuse mit genetischer Deletion verschiedener V-ATPase-Untereinheiten charakterisiert durch einen Anstieg von Knochenmasse (Osteopetrose). In der vorliegenden Arbeit fanden wir heraus, dass (P)RR stark in reifen Osteoklasten in vitro und in vivo exprimiert wird. Mäuse mit genetischer Deletion des (P)RR in Osteoklasten wurden durch einen komplexen Knochen-Phänotyp mit reduzierter Knochendichte charakterisiert. (P)RR-defiziten Osteoklasten wiesen vermehrte Differenzierung und/oder Aktivität in vitro und in vivo auf. Wir postulieren deshalb, dass der (P)RR die in der Plasmamembran lokalisierten V-ATPase nicht direkt reguliert, sondern mit der physiologischen Aktivität der Osteoklasten durch andere Mechanismen interferiert. Macrophagen sind speziell auf die Immunabwehr ausgerichtete Fresszellen (Phagozyten). Phagozytose ist ein wesentlicher Zellprozess der die V-ATPase in Lysosomen braucht um die eingeschlossenen Pathogen zu zerstören. Wir generierten transgene Ratten mit konditionellen knockdown von (P)RR unter Nutzung eines Doxyzyclin-induzierten shRNA-Expressionssystems. Eine effiziente (P)RR-Depletion in Makrophagen wurde durch Behandlung mit Doxyzyclin in vivo im Trinkwasser und in vitro im Kulturmedium erreicht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Verschiebung des vesikulären pHs erst ziemlich spät nach (P)RR-Depletion auftritt. Wir fanden heraus, dass (P)RR-Depletion weder Phagozytose noch Endozytose beeinträchtigte, sondern für das Recycling des Transferrin-Rezeptors zur Plasmamembran wichtig ist. / A decade ago, the (pro)renin receptor [(P)RR] was discovered and depicted as a new component of the renin-angiotensin system. However, recent studies have put in evidence that the (P)RR associate with and regulate the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase), hence its other name vacuolar H+-ATPase associated protein 2 (ATP6ap2). In osteoclasts, V-ATPases are mainly located at the plasma membrane facing the bone surface and extrude protons into the extracellular space. Mice with genetic deletion of various V-ATPase subunits are characterized by an increase of bone mass (osteopetrosis). In this work, we found that the (P)RR is highly expressed in mature osteoclasts in vitro and in vivo. Mice with genetic deletion of the (P)RR in osteoclasts developed a complex bone phenotype characterized by a reduced bone density. Osteoclasts lacking (P)RR displayed increased differentiation and/or activity in vitro and in vivo. We therefore suggest that the (P)RR does not directly regulate V-ATPases located at the plasma membrane but rather interferes with osteoclast physiology through other mechanisms. Macrophages are professionalized phagocytes crucial for immune response. Phagocytosis is an essential cellular process, which requires lysosomal V-ATPases for degradation of engulfed pathogens. We generated transgenic rats with a conditional depletion of the (P)RR with the use of a doxycycline-induced shRNA expression system. Efficient (P)RR depletion in macrophages was accomplished by doxycycline treatment in vivo in drinking water and in vitro in culture medium. In this work, we found that the impairment of vesicular pH occurs lately after (P)RR deletion. Also, we found that (P)RR deletion did not impair neither phagocytosis nor endocytosis but rather perturbed the recycling of the transferrin receptor to the plasma membrane.

Das humorale Immungedächtnis wird von reifen Plasmazellen des Knochenmarks vermittelt, welche bei Immunreaktionen aus aktivierten B-Lymphozyten gebildet werden. Dabei sind im Blut Plasmablasten als unmittelbare Vorläufer der Plasmazellen nachweisbar, die von dort aus in das Knochenmark einwandern. Anhand der durchflusszytometrischen Detektion spezifischer Plasmablasten gelang es hier, das simultane Auftauchen von Wellen neu generierter, migratorischer Plasmablasten und reifer, nicht-migratorischer Plasmazellen im Blut eine Woche nach einer Tetanusimpfung nachzuweisen. Plasmablasten und Plasmazellen lagen stets im Gleichgewicht vor, wodurch auf die stöchiometrische Mobilisierung reifer Plasmazellen des Knochenmarks durch systemisch induzierte Plasmablasten geschlossen wurde. Ein solcher Verdrängungsmechanismus wird hier erstmalig als Anpassungsmechanismus des humoralen Immungedächtnisses dargestellt, der die Aufnahme neuer Spezifitäten in das Gedächtnis unter Wahrung der Stabilität präexistierender Spezifitäten erlaubt. Anders als systemisch induzierte Plasmablasten, weisen Plasmablasten, die im immunologischen Ruhephase zirkulieren, Kennzeichen mukosaler Immunreaktionen auf: sie exprimieren IgA sowie die mukosalen Zellmigrationsrezeptoren alpha4beta7-Integrin und CCR10. Wahrscheinlich wandern sie in mukosale Plasmazelldepots ein und interferieren nicht mit den Plasmazellen des Knochenmarks, sodass die Stabilität des humoralen Gedächtnisses in der Ruhephase gewahrt bleibt. Eine Anpassung des humoralen Gedächtnisses findet somit nur im Rahmen systemischer Immunreaktionen statt. Bei splenektomierten Patienten und unter der B-Zell-Depletionstherapie bei Rheumapatienten bleiben mukosale Plasmablasten im Blut nachweisbar. Dies belegt deren autonome Bildung aus mukosalen, therapie-refraktären B-Zellen. Insgesamt wird hier eine bisher unbeachtete Komplexität menschlicher peripherer Plasmablasten und Plasmazellen und ihren Beziehungen zum humoralen Immungedächtnis dargestellt. / Humoral memory, i.e. persistence of specific antibody titers, is provided by plasma cells in the bone marrow, which are generated from activated B cells during immune responses. At this, immediate plasma cell precursors, the plasmablasts, migrate via the blood to the bone marrow. Using cytometric detection of antigen-specific plasmablasts, synchronous circulation of waves of recently generated, migratory plasmablasts and non migratory plasma cells with a mature phenotype was demonstrated one week after tetanus vaccination. Circulating plasmablast and plasma cell numbers were always in homeostasis, so that the stoichiometric mobilization of old bone marrow plasma cells by recently generated plasmablasts was hypothesized. This plasma cell replacement mechanism is herein described for the first time as an adaption mechanism of the humoral memory that allows incorporation of new antibody specificities while maintaining pre-existing ones. In immunological steady state, very low numbers of plasmablasts are detectable in any donor. These express IgA and receptors for mucosal homing, alpha4beta7 integrin and CCR10, and therefore most likely migrate into mucosal plasma cell depots and do not interfere with plasma cells of the bone marrow, preserving the stability of humoral memory during steady state. Hence, adaption of humoral memory is only possible during systemic immune reactions. Circulating mucosal plasmablasts produced during steady state remain detectable in patients with rheumatoid arthritis during B cell depletion therapy as well as in asplenic patients. Hence, this type of plasmablasts is self-sufficiently generated from mucosal B cells that are refractory to B cell depletion therapy. This work demonstrates a hitherto disregarded complexity of peripheral plasmablast and plasma cell subsets in healthy humans, with implications for the regulation of induction and maintenance of humoral memory.