Das Pankreaskarzinom stellt aufgrund seiner hohen Letalität ein bisher ungelöstes Behandlungs¬problem dar. Da die Erkrankung meist erst in einem späten Stadium erkannt wird, sehr aggressiv verläuft und effektive systemische Therapien bisher fehlen, beträgt die 5-Jahresüberlebensrate nur etwa 1-4 %. Daher ist die Entwicklung neuer Therapie¬strategien dringend notwendig. Geeignet dafür sind neuartige Ansätze einer gezielten Krebstherapie, die sich speziell gegen die tumorbiologischen Veränderungen des Pankreas¬karzinoms richten. Ziel dieser Arbeit war es, die beiden Wirkstoffe Rapamycin und anti-VEGF-Antikörper allein und in Kombination auf ihre antitumorösen Eigenschaften gegenüber Panc02-Tumor¬zellen in drei aufeinander folgenden Versuchsansätzen an einem Metasta¬sierungs¬modell in vivo zu unter¬suchen. Beurteilt wurden dabei zunächst die Über¬lebens¬zeit der Tiere und die Tumor¬aus¬dehnung in der Leber. Anschließend wurden anhand einer quantitativen PCR und der Immun¬histo¬logie die Auswirkungen des Tumors auf verschiedene Zellmarker und Zytokine im Milz-, Leber- und Tumorgewebe bestimmt. Aus den erhobenen Ergebnissen geht hervor, dass mit der Kombinationsbehandlung aus Rapa¬mycin (1,5 mg/kg/d) und anti-VEGF-Antikörper das beste Tumor¬an¬sprechen mit einer der längsten Überlebens¬zeiten und einem sehr geringen Tumor¬befall zu erreichen war. Die Monotherapie mit Rapa¬mycin zeigte zwar ebenfalls im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen einen geringeren Tumorbefall, war aber mit einer kürzeren Überlebenszeit assoziiert. Ein Grund für ein einge¬schränktes Überleben der mit Rapamycin behandelten Tiere könnte das Neben¬wirkungs¬profil von Rapa¬mycin sein. Die Behandlung mit dem anti-VEGF-Antikörper erzielte weder hinsichtlich der Über¬lebens¬zeit noch bezüglich des Tumorbefalls überzeugende Ergebnisse. Der fehlende Antitumoreffekt der anti-VEGF-Antikörper¬therapie könnte in der kurzen Behandlungsdauer des Antikörpers begründet sein. Bei der Überprüfung der Dosierung von Rapamycin schnitt die Gruppe mit der niedrigsten Rapa¬mycindosis von 0,75 mg/kg/d am besten ab. Neben der längsten Überlebenszeit wies sie ver¬glichen mit den anderen Gruppen den geringsten Tumorbefall auf. Ein erneuter Versuchsansatz mit der Kombination aus der reduzierten Rapamycin¬dosis (0,75 mg/kg/d) und dem anti-VEGF-Antikörper konnte den zuvor erzielten Vorteil der Kombi¬nations¬behandlung nicht vollends bestätigen. Die Tumor¬aus¬breitung entsprach zwar dem Ergebnis der in der zweiten Versuchsreihe am besten abge¬schnittenen Gruppe, die Über¬lebenszeit lag aber deutlich unter der der Vergleichs¬gruppen. In der Real-Time PCR ergab sich hinsichtlich des lymphozytären Infiltra¬tions¬musters folgendes Bild: Im Milz-, Leber- und Tumorgewebe lag die Zahl der zyto¬toxischen T-Zellen über der der T-Helferzellen. Vor allem im Tumor¬gewebe war die Gen¬expression von CD8 deutlich erhöht und teilweise mit einem besseren Tumor¬ansprechen assoziiert. Dies könnte auf eine effiziente Tumorimmunantwort der zyto¬toxischen T-Zellen hindeuten. Die Expression von CD4 war dagegen in allen drei Geweben relativ gering. Ferner konnte in der Real-Time PCR und in der Immun¬histo¬logie eine Steigerung der CD25-Genexpression im Leber- und Tumorgewebe im Vergleich zum Milzgewebe nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine Ansammlung supprimierender regulatorischer T-Zellen im Tumor und damit eine ineffizientere Tumor¬immunantwort hindeuten. Häufig liegt in Tumoren ein Überwiegen der Th2-Zellen vor. In unserer Studie zeigten die Th1-Zytokine wie IL-2, IFN-gamma or TNF-alpha eine heterogene Expression, sodass eine definitive Aussage über einen Th1/Th2-Shift nicht getroffen werden kann. Des Weiteren wurden die Auswirkungen des Tumors auf B7-H1 und PD-L2 sowie auf PD-1, einen ihrer Rezeptoren, untersucht. Die Ergebnisse bestätigen die Theorie des Tumorimmunescape-Mechanismus. Die in dieser Arbeit erhobenen Ergebnisse sollten nun dazu verwendet werden, gezielt neue immuno¬logische und anti¬angio¬genetische Therapiestrategien für die Behandlung des Pankreas¬karzinoms in der Klinik zu entwickeln. Allerdings zeigt die vorliegende Arbeit auch Ansätze und Probleme auf, die zunächst in weiteren Studien zu lösen sind. So stellten beispielsweise die Neben¬wirkungen der Rapamycinbehandlung einen limitierenden Faktor in der Behandlung der Tiere dar. Auch sollte geklärt werden, ob der schwache Effekt der anti-VEGF-Anti¬körper¬behand¬lung in dieser Arbeit mit der kurzen Behandlungsdauer erklärt werden kann und möglicherweise eine längere Anwendung der VEGF-Antikörper bessere Resultate erzielt. / The overall 5-year survival of patients with pancreatic cancer remains under 5%. Novel therapeutic strategies are needed to improve the prognosis of these patients. Therefore, drugs are suitable that target signal transduction pathways involved in tumor cell proliferation, invasion or tumor angiogenesis like rapamycin and anti-VEGF-antibody. In this study we examined the effect of rapamycin and anti-VEGF-antibody, alone and in combination, on pancreatic cancer cells in a mouse model. Panc02-cells were injected intraportally in C57BL/6-mice after median laparotomy. We evaluate survival, tumor growth and liver metastasis of the mice for each treatment group. Spleen, liver and tumor tissue were additionally analyzed for cytokines and T-cell markers using immunohistochemistry and RT-PCR. Rapamycin, alone and in combination with anti-VEGF antibody, strongly inhibited tumor growth in mice. Furthermore, the combination therapy showed one of the best survival. Anti-VEGF antibody did not inhibit the tumor growth at all. This might be declared by the short treatment, because the antibody was given only five times. Relative to the T cell markers we found a high expression of cytotoxic T-cells and regulatory T-cells in the tumor. CD4+ T-cells expression was low in all types of tissue. Often in tumors there is a T helper Th2-dominant immunity. In our study the Th1-cytokines like IL-2, IFN-gamma or TNF-alpha showed a heterogeneous expression so that a definitive statement about a Th1/Th2-shift could not be given. Furthermore, we examined the markers B7-H1, PD-L2 and their receptor PD-1. The results confirm the theory of tumor immune escape mechanism. Taken together, this study proposes new therapeutic strategies to inhibit tumor growth. Rapamycin administered as a single drug as well as in combination with anti-VEGF-antibody inhibits pancreatic tumor growth. The combination therapy shows one of the best survival. Nevertheless, there are some problems which have to be solved in further studies, like the side effect of rapamycin and the weak effect of the monotherapy with anti-VEGF-antibody which probably could be declared by the short treatment of only five times.

Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis. / Stimulatorische oder superagonistische (SA) CD28-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) (CD28SA) haben sich in diversen Nagetiermodellen für Autoimmunerkrankungen sowie für inflammatorische Erkrankungen als effektive Behandlungsmöglichkeit erwiesen. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass CD28SA-Injektionen zu einer verstärkten Aktivierung regulatorischer T-Zellen in führen. Entgegen diesen Beobachtungen im Tiermodell reagierten die Teilnehmer einer ersten klinischen Studie auf die Administration des humanisierten CD28SA TGN1412 mit einer akut lebensbedrohlichen systemischen Zytokinausschüttung. Vorklinische Studien an humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMC) hatten keinen Hinweis auf eine mögliche plötzliche Zytokinausschüttungen als Reaktion auf TGN1412 gegeben. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht eine Erklärung zu finden, warum PBMC-basierte Tests, wie sie vorklinischen Studien als Standard eingesetzt werden, nicht auf den unerwarteten TGN1412-induzierten „Zytokinsturm“ der Probanden hinwiesen. CD28SA aktivieren T-Zellen ohne Ligation des T-Zell Rezeptors (TCR). Jedoch werden zur CD28SA-abhängigen Aktivierung von T-Zellen „tonische“ TCR Signale benötigt, die durch MHC Scanning der T-Zellen an der Oberfläche anderer Zellen erzeugt werden. PBMC, welche sich in der Zirkulation befinden, erhalten diese „tonischen“ TCR Signale nicht. Kurzzeitige Vorkultur humaner PBMC bei hoher Zelldichte (high-density culture, HDC) führte zu einer starken Zytokinantwort bei nachfolgender TGN1412 Stimulation. Diese wiedererlangte Reaktivität gegenüber TGN1412 ging mit Tyrosin-Phospholrylierung sowie der Polarisierung von TCR Molekülen einher, war abhängig von Zellkontakten und konnte durch HLA-spezifische mAbs geblockt werden. Während der HDC durchlaufen sowohl CD4 T-Gedächtniszellen, als auch Monozyten eine voneinander abhängige funktionelle Reifung. TGN1412-induzierte Zellproliferation beschränkt sich jedoch auf CD4 T-Gedächtniszellen, die auch die Hauptquelle der proinflammatorische Zytokine sind. Antworten auf weitere T-Zell aktivierende Agenzien waren ebenfalls erhöht, wenn PBMC zunächst auf gewebeartige Bedingungen zurückgesetzt wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt damit ein neuartiges in vitro Protokoll für humane PBMC, welches T-Zellen der Zirkulation in einen gewebeartigen funktionellen Status versetzt, in welchem sie auf TGN1412 antworten. Dieses Protokoll könnte auch einen verlässlicheren vorklinischen in vitro Test sowohl für aktivierende als auch für inhibierende immunmodulatorische Medikamente darstellen. Im letzten Teil der Arbeit wird die erstaunliche Beobachtung vorgestellt, dass TGN1112, ein IgG1 Antikörper mit gleicher Spezifität wie der IgG4 Antikörper Antikörper TGN1412, trotz seiner höheren Affinität für Fc-Rezeptoren eine viel geringere stimulatorische Aktivität zeigt. Sterische Hinderung konnte als eine mögliche Erklärung ausgeschlossen werden. Vielmehr scheint das Entfernen von TGN1112/CD28 Komplexen von der T-Zelloberfläche durch Trans-Endozytose eine mögliche Erklärung für die geringere Aktivität zu sein.

Malaria ist eine Krankheit, die durch den Protozoen Plasmodium verursacht und von Anopheles Moskitos durch infektiöse Stiche übertragen wird. Diese ̈Übertragung kann durch verschiedene Interventionsstrategien blockiert werden. Eine relativ neue Strategie, die bisher nur im Labor getestet wurde, ist der Einsatz genetisch veränderter Moskitos, die den Parasiten nicht auf einen neuen menschlichen Wirt übertragen können. Ein Ansatz ist die Entwicklung von Moskitos, die mit murinen Antikoepern ausgestattet sind, die gegen relevante Oberflächenproteine des Parasiten, dem Circumsporozoite Protein (CSP) gerichtet sind. Es ist jedoch nach wie vor unklar, welches Entwicklungsstadium angegriffen werden soll und welche Antikörper für diesen Ansatz effizient sind. Hier zeige ich, dass in Stechmücken, die mit einem humanen Anti-CSP-Antikörper ausgestattet sind, die Sporogonie der Oozysten in Abhängigkeit von der Parasiten-dichte blockiert wird und somit die Sporozoitenlast in den Mücken signifikant verringern. Insbesondere Antikörper, die sich an die ’Repeat Region’ des CSP binden, können die Sporozoitenlast in der Stechmücke verringern. Des Weitern, zeigen diese Stechmücken kaum Defekte in der Entwicklung und im Überleben. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor beschriebene Bedeutung von CSP während der Sporogonie und unterstreichen die Effizienz von humanen, ’Repeat Region’ bindenden Anti-CSP-Antikörpern bei der Beeinträchtigung der Parasitenentwicklung in dem Vektor. Darüber hinaus ist in Stechmücken, die mit humanen Anti-CSP Antikörpern ausgestattet sind, die Entwicklung von Sporozoiten teils limitiert und teils komplett verhindert. Dies macht sie zu einem vielversprechenden Instrument für Maßnahmen zum Malaria Kontrolle. In dieser Arbeit habe ich weitere Einblicke in den Mechanismus , durch den Anti-CSP-Antikörper die Parasitenentwicklung in der Mücke stören, und gezeigt, dass Oozysten ein effizientes Ziel für diesen Ansatz sind. / Malaria is a disease caused by the protozoan parasite Plasmodium and transmitted by Anopheles mosquitoes trough infectious bites, these transmission events can potentially be blocked by different intervention strategies. A relatively new strategy which has been only tested in the laboratory is the use of genetically modified mosquitoes unable to transmit the parasite to a new human host. In the past, murine derived antibodies directed against relevant parasite surface proteins were used with limited success. It remains unclear which developmental stage is targeted, and which antibodies are useful. Here, I show that in mosquitoes equipped with a human derived anti-CSP repeat binding antibody, oocyst sporogony is blocked in a parasite density dependent manner. Only repeat binding antibodies could decrease sporozoite loads in the mosquito. These results confirm the previously described importance of CSP during sporogony and highlight the efficiency of human derived repeat binding anti-CSP antibodies in interfering with parasite development even in a different host. Additionally, mosquitoes equipped with human derived anti-CSP antibodies show little (in high density infections) to no (in low density infections) sporogonic development, making them a promising tool for malaria transmission blocking interventions. I provided additional insights into the mechanism by which anti-CSP antibodies interfere with parasite development in the mosquito showing that oocysts are an efficient target for this approach. Therefore, the mosquitoes used here are potentially resistant in a more natural setting. Additionally, I provided a new tool allowing a faster screening of antibodies in a mosquito context by injection of single chain Fabs into the mosquito hemolymph. Taken together, this approach could one day give rise to alternative strategies in tackling malaria transmissions.

Bakterielle Glykanantigene sind hoch-divers in ihrer Komposition und Verbindung. Antikörper gegen Glykanantigene können vor bakteriellen Infektionen schützen und sind wichtig um die Homöostase zwischen dem Wirt und seinem Mikrobiom aufrecht zu halten. Typischerweise lösen Glykanantigene jedoch Antikörperantworten aus, die sich durch ein vermindertes B Zell-Gedächtnis und niedrig-affine Antikörper mit geringer Spezifität auszeichnen. In dieser Arbeit konnten, mithilfe von biotinylierten Lipopolysaccharide O-Antigenen des opportunistisch-pathogenen Bakteriums Klebsiella pneumoniae (Kp), O-Antigen-spezifische B Zellen innerhalb peripherer Gedächtnis- und intestinaler Effektor-B Zellen identifiziert werden. Durch Einzel-Zell Immunoglobulin-Sequenzierung und Klonierung bzw. rekombinanter Expression von Antikörpern dieser Zellen wird gezeigt, dass, unter natürlichen Umständen, affinitätsgereifte Antikörper gegen definierte Kp Glykanantigene erzeugt werden. Diese Antikörper binden nicht nur Kp O-Serotyp-spezifisch sondern auch spezifisch an strukturell ähnliche Kp O-Antigene und taxonomisch unterschiedliche Mikroorganismen. Die Ergebnisse zeigen, dass Menschen, bei natürlicher Besiedlung, kreuz-spezifische Antikörper gegen Glykanantigene erzeugen und deuten auf einen Mechanismus hin, wie das humorale Immunsystem auf die Glykandiversität des Mikrobioms reagieren und sich anpassen kann. Weiterhin könnten die hier identifizierten Antikörper nützlich für die Behandlung von nosokomiellen Kp Infektionen sein. / Bacterial glycan antigens are highly diverse in composition and linkage. Antibodies against glycan antigens can protect against bacterial infection and are important in maintaining homeostasis between the host and its microbiome. However, glycan antigens typically elicit B cell responses that have impaired long-term memory formation and are comprised of low-affine antibodies with low specificity. In this work, the use of biotinylated Lipopolysaccharide O-antigens of the opportunistic pathogen Klebsiella pneumonia allowed to identify anti-O-antigen B cells in the peripheral memory and intestinal effector B cell pool in healthy humans. Single B cell Immunoglobulin gene sequencing, antibody cloning, and recombinant expression reveal that, under natural circumstances, humans acquire affinity-matured antibodies against defined Kp glycan antigens. Despite their O-serotype-specificity, the antibodies bind to other structurally similar Kp O-serotypes and taxonomically distinct non-Kp microbes. The findings show that humans, under natural exposure, acquire affinity-matured cross-specific anti-glycan antibodies and provide a mechanistic way how the humoral immune system could adapt to the large microbial glycan diversity present in nature. Further, the antibodies identified in this work might be beneficial in treatment of nosocomial Kp infections.