No description available.

BACKGROUND: Malignant and paramalignant pleural effusions are important complications of many malignancies. The two main management options debated in the literature are: 1) insertion of an indwelling pleural catheter (IPC) to achieve chronic drainage of the effusion, or 2) hospitalization with tube thoracostomy and subsequent chemical pleurodesis (CP) with talc or doxycycline to prevent fluid reaccumulation. We aimed to describe a large series of patients with malignant pleural effusions managed with an IPC, identify and validate factors identified in the literature as predictors of spontaneous pleurodesis in the IPC group and compare the group managed with IPC to patients managed with CP. METHODS: We designed a retrospective cohort study comparing patients with malignant and paramalignant pleural effusions managed either with CP between March 1, 2003 and February 28, 2006 or IPC insertion between May 1, 2006 and April 1, 2009. The CP group was identified through the prescription of talc or doxycycline and the IPC group from the IPC clinic database. Data were collected from paper and electronic records and from the Government of Ontario. RESULTS: We identified 193 consecutive patients with an ECOG performance status of less than 4 (ECOG less than 4 means that the patient is not completely disabled and confined to bed or chair) having undergone IPC insertion and 168 who were managed with CP. None of the variables we tested were significant predictors of spontaneous pleurodesis in the IPC group. Pleural effusion control rates at 6 months were higher in the IPC group than in the CP group (52.7% vs 34.0%, p<0.01) but the rate of freedom from pleural effusion at 180 days and catheter removal at 90 days was not significantly different (25.8% in the IPC group and 34.0% in the CP group p=0.14). Patients in the IPC group had a significantly longer median survival (148 days measured from the date of catheter insertion vs 133 days in the CP group, log-rank p<0.05). CONCLUSION: We found an intriguing possible survival benefit favouring management of malignant or paramalignant effusions with an IPC. Given possible biases due to the design of this study and uncertain explanatory mechanism, this needs to be confirmed in a randomized controlled trial. Quality of life, an important measure of success for these palliative procedures, should also be measured.

Syfte: Att belysa sjuksköterskors och patienters upplevelser av vården vid långvarig icke-malign smärta. Metod: Den föreliggande uppsatsen har gjorts som en litteraturstudie där tolv vetenskapliga artiklar har analyserats. Resultat: Sjuksköterskor upplevde smärtbedömningen som en utmaning och ansåg att när de inte trodde på patientens smärtbeskrivning, var det ett hinder för en bra bedömning. Patienterna upplevde att de ofta blev misstrodda av vårdpersonalen och betonade vikten av att bli trodd. Det var viktigt för patienterna att få en diagnos och att hänsyn togs till deras önskan om vad behandlingen skulle resultera i. Patienterna upplevde att deras mål och vårdpersonalens mål med behandlingen inte alltid stämde överens. Sjuksköterskorna upplevde att utbildningen inte förberedde dem för att ta hand om patienter med långvarig smärta och att kunskapen om icke-farmakologiska behandlingsmetoder var bristfällig. Behandling med opioider var en komplex fråga. Sjuksköterskorna kände sig ofta obekväma i att använda opioider, medan patienterna inte ville begränsa möjligheten till adekvat smärtlindring. Slutsats: Det finns ett behov av fördjupad kunskap hos sjuksköterskorna om vården vid långvarig smärta. / Aim: To elucidate nurses and patients experiences of the care of chronic non-malignant pain. Method: This thesis was a literature review. Twelve articles have been analyzed. Results: Nurses experienced pain assessment as a challenge. Nurses felt that a barrier to pain assessment was when nurses did not believe in patients’ description of their pain. Patients experienced that they often were mistrusted by healthcare providers and emphasized the importance of believing in them. It was important for patients to receive diagnosis and that their desire regarding the results of the treatment was considered. Patients sometimes experienced a discrepancy between their own goals with the treatment and that of the healthcare providers. Nurses thought that their education did not prepare them properly in how to take care of patients with chronic pain and they had poor knowledge about non- pharmacological treatments. Treatments with opioids were a complex issue. Nurses often felt uncomfortable in using opioids, while patients wanted no restrictions in their strive for adequate pain relief. Conclusion: There is a need for deeper knowledge among nurses about how to care for patients with chronic non-malignant pain.

<p>The investigation of genetic alterations in cancer-relatedgenes is useful for research, prognostic and therapeuticpurposes. However, the genetic heterogeneity that often occursduring tumour progression can make correct analysischallenging. The objective of this work has been to develop,evaluate and apply techniques that are sufficiently sensitiveand specific to detect and analyse genetic alterations in skintumours as well as in normal skin.</p><p>Initially, a method based on laser-assisted microdissectionin combination with conventional dideoxy sequencing wasdeveloped and evaluated for the analysis of the p53 tumoursuppressor gene in small tissue samples. This method was shownto facilitate the analysis of single somatic cells fromhistologic tissue sections. In two subsequent studies themethod was used to analyse single cells to investigate theeffects of ultraviolet (UV) light on normal skin. Single p53immunoreactive and nonimmunoreactive cells from differentlayers of sunexposed skin, as well as skin protected fromexposure, were analysed for mutations in the p53 gene. Theresults revealed the structure of a clandestine p53 clone andprovided new insight into the possible events involved innormal differentiation by suggesting a role for allele dropout.The mutational effect of physiological doses of ultravioletlight A (UVA) on normal skin was then investigated by analysingthe p53 gene status in single immunoreactive cells at differenttime-points. Strong indications were found that UVA (even atlow doses) is indeed a mutagen and that its role should not bedisregarded in skin carcinogenesis.</p><p>After slight modifications, the p53 mutation analysisstrategy was thenused to complement an x-chromosomeinactivation assay for investigation of basal cell cancer (BCC)clonality. The conclusion was that although the majority ofBCC’s are of monoclonal origin, an occasional tumour withapparently polyclonal origin exists. Finally, apyrosequencing-based mutation detection method was developedand evaluated for detection of hot-spot mutations in the N-rasgene of malignant melanoma. More than 80 melanoma metastasissamples were analysed by the standard approach of single strandconformation polymorphism analysis (SSCP)/DNA sequencing and bythis pyrosequencing strategy. Pyrosequencing was found to be agood alternative to SSCP/DNA sequencing and showed equivalentreproducibility and sensitivity in addition to being a simpleand rapid technique.</p><p><b>Keywords:</b>single cell, DNA sequencing, p53, mutation,UV, BCC, pyrosequencing, malignant melanoma, N-ras</p>

No description available.

Abstract Although the critical role of the small GTPases Ras and Ral in oncogenesis has been well documented, much remains to be investigated about the molecular mechanism by which these GTPases regulate malignant transformation. The work under this thesis made two major contributions to this field. The first is the discovery that K-Ras, RalA and/or RalB are required for the maintenance of the high levels of the anti-apoptotic protein survivin in some human cancer cells, and the second is the demonstration that down regulation of K-Ras, RalA and/or RalB, but not Raf-1 or Akt1/2, stabilizes the tumor suppressor p53 and reactivates it to inhibit malignant transformation in human cancer cells with mutant K-Ras and wild type p53. Here we found that depletion of K-Ras leads to decreased survivin levels in human cancer cells that harbor mutant K-Ras but not those with wild type Ras. The mechanism by which this occurs involves ubiquitination and subsequent proteasome-mediated degradation of survivin. The presence of mutant K-Ras alone was not sufficient to predict the effects of RalA/B depletion on survivin levels. Indeed, depletion of RalA and/or RalB reduces survivin levels in human cancer cells with wild type p53 and mutant K-Ras, but not in those with mutant p53 and/or wild type K-Ras. The functional relevance of these findings to malignant transformation was further supported by the demonstration that compromising the expression of survivin by siRNA leads to reduction of mutant K-Ras-driven invasion and anchorage-independent growth. Furthermore, in this thesis, we have discovered that down regulation of K-Ras, RalA and/or RalB using siRNA leads to increased levels of functional p53 that is capable of regulating its target genes. The mechanism by which depleting K-Ras, RalA and RalB increases the levels of p53 involves an increase in the half-life of the p53 protein concurrent with an increase in the phosphorylation of serine-15 of p53, a marker of p53 stability. Finally, we demonstrated that depletion of K-Ras, RalA and/or RalB interferes with cell cycle progression, anchorage-independent growth and invasion in a p53-dependent manner. In summary, the studies suggest that mutant K-Ras contributes to the maintenance of the aberrantly-high survivin levels by regulating its stability, and that the ability of mutant K-Ras to induce malignant transformation is, at least in part, dependent of these high levels of survivin. The work of this thesis also suggests that the expression of K-Ras, RalA and/or RalB proteins is critical to maintain low levels of p53, and that down regulation of these GTPases reactivates p53 by significantly enhancing its stability, and this contributes to suppression of malignant transformation.

Epigenetic dysfunction is a known contributor in carcinogenesis, and is emerging as a mechanism involved in toxicant-induced malignant transformation for environmental carcinogens such as arsenicals. In addition to aberrant DNA methylation of single genes, another manifestation of epigenetic dysfunction in cancer is agglomerative DNA methylation, which can participate in long-range epigenetic silencing that targets many neighboring genes and has been shown to occur in several types of clinical cancers. Using in vitro model systems of toxicant-induced malignant transformation, we found hundreds of aberrant DNA methylation events that emerge during malignant transformation, some of which occur in an agglomerative fashion. In an arsenite-transformed prostate epithelial cell line, the protocadherin (PCDH), HOXC and HOXD gene family clusters are targeted for agglomerative DNA methylation. Aberrant DNA methylation in general occurred more often within H3K27me3 stem cell domains. We found a striking association between enrichment of H3K9me3 stem cell domains and toxicant-induced agglomerative DNA methylation. Global gene expression profiling of the arsenite-transformed prostate epithelial cells showed that gene expression changes and DNA methylation changes were negatively correlated, but less than 10% of the hypermethylated genes were down-regulated. These studies confirm that a majority of the DNA hypermethylation events occur at transcriptionally repressed, H3K27me3 marked genes. In contrast to aberrant DNA methylation targeting H3K27me3 pre-marked silent genes, we found that actively expressed ZNF genes marked with H3K9me3 on their 3' ends, are preferred targets of DNA methylation linked gene silencing. H3K9me3 mediated gene silencing of ZNF genes was widespread, occurring at individual ZNF genes on multiple chromosomes and across ZNF gene family clusters. At ZNF gene promoters, H3K9me3 and DNA hypermethylation replaced H3K4me3, resulting in a widespread down-regulation of ZNF gene expression which accounted for 8% of all the down-regulated genes in the arsenical-transformed cells. In summary, these studies associate arsenical exposure with agglomerative DNA methylation of gene family clusters and widespread silencing of ZNF genes by DNA hypermethylation-linked H3K9me3 spreading, further implicating epigenetic dysfunction as a driver of arsenical-induced carcinogenesis.

Η κακοήθης υπεζωκοτική συλλογή (ΚΥΣ), προκαλούμενη από μεταστατικά αδενοκαρκινώματα είτε από πρωτοπαθή μεσοθηλιώματα, αποτελεί μείζον κλινικό πρόβλημα καθώς σηματοδοτεί συστηματική νεοπλασματική διασπορά και χαμηλό προσδόκιμο επιβίωσης. Η τρέχουσα αντιμετώπισή της είναι μη αιτιολογική και συχνά αναποτελεσματική. Ενώ τα νεοπλάσματα που προκαλούν ΚΥΣ φέρουν καλά χαρακτηρισμένες μεταλλάξεις και ο υπεζωκότας θεωρείται προνομιακή ανατομική θέση γονιδιακής θεραπείας, οι μέχρι τώρα μελέτες της αποτελεσματικότητας της υπεζωκοτικής διαγονιδιακής μεταφοράς υπήρξαν αποσπασματικές. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο χαρακτηρισμός της έκτασης, της αποτελεσματικότητας και της λειτουργικότητας της διαγονιδιακής μεταφοράς τόσο στο φυσιολογικό υπεζωκοτικό μεσοθήλιο, όσο και και στον πάσχοντα υπεζωκότα με πρωτοπαθείς ή μεταστατικούς όγκους. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Υγιείς ποντικοί φυσικού τύπου C57BL/6 και διαγονιδιακοί ποντικοί-ιχνηλάτες mT.mG έλαβαν ενδοϋπεζωκοτικές εγχύσεις 5 x 108 μολυσματικών μονάδων αδενοϊών τύπου 5 (Ad) που κωδικοποιούν τα γονίδια της λουσιφεράσης (Luc), της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και της Cre ρεκομπινάσης. Η αποτελεσματικότητα της διαγονιδιακής μεταφοράς μελετήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας/βιοφθορισμού, καθώς και με φθορίζουσα μικροσκοπία. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν σε ποντικούς με ΚΥΣ, οι οποίες προκλήθηκαν μέσω υπεζωκοτικής έγχυσης 150.000 κυττάρων συγγενικού μεσοθηλιώματος υπεζωκότα (ΑΕ17) και αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (LLC). Προκειμένου να μελετηθεί αν οι αδενοϊοί σε ποιο βαθμό μπορούν να διαμολύνουν κύτταρα in vitro , ανθρώπινες και ποντικίσιες κυτταρικές σειρές , φυσιολογικές και καρκινικές , διαμολύνθηκαν με 10ng/μl Ad-luc και Ad-GFP. AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η θωρακική φωτεινή εκπομπή ποντικών C57BL/6 κορυφώθηκε την πρώτη και υποχώρησε τη δεύτερη εβδομάδα μετά ενδοϋπεζωκοτική έγχυση Ad-Luc . Δύο εβδομάδες μετά από ενδοϋπεζωκοτική χορήγηση Ad-Cre σε ποντικούς mT.mG παρατηρήθηκε διάχυτη εξάλειψη του ερυθρού και εμφάνιση πράσινου φθορίζοντος σήματος σε όλες τις υπεζωκοτικές επιφάνειες, το οποίο εντοπιζόταν κατ’ αποκλειστικότητα στο μεσοθήλιο. Δύο εβδομάδες μετά από έγχυση Ad-Cre σε ποντικούς mT.mG που είχαν αναπτύξει όγκους παρατηρήθηκε πράσινος φθορισμός μαζί με τον κόκκκινο μέσα στους όγκους. Στατιστικώς σημαντική διαμόλυνση παρατηρήθηκε in vitro στα κύτταρα φυσιολογικού μεσοθηλίου, μεσοθηλιώματος ανθρώπου και ποντικού , αδενοκαρκινώματος πνεύμονα και παγκρέατος ποντικού. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η ενδοϋπεζωκοτική έγχυση ανασυνδυασμένων αδενοιών αποτελεί αποτελεσματική μέθοδο διαγονιδιακής μεταφοράς στο φυσιολογικό και παθολογικό υπεζωκοτικό μεσοθήλιο. Ο βαθμός της διαγονιδιακής μεταφοράς επιβεβαιώνεται με τη διαμόλυνση φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών in vitro. / --

Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος είναι το αποτέλεσμα της κακοήθους εξαλλαγής των μελανοκυττάρων της επιδερμίδας και χαρακτηρίζεται απο συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η αξιοσημείωτη δε ανθεκτικότητα που επιδεικνύει το προχωρημένο μεταστατικό μελάνωμα στα χημειοθεραπευτικά σχήματα και στην ακτινοθεραπεία κάνει επιτακτική την ανάγκη για νέους, πιο αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αυξανόμενος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη παρουσία και ενεργό συμμετοχή καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells, CSCs) στην ανάπτυξη και μετάσταση του μελανώματος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες EZH2, SOX2 και Oct4 αποτελούν μόρια – κλειδιά στον έλεγχο του ρυθμιστικού δικτύου του stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων (ESCs). Είναι πλέον γνωστό ότι η χρωματίνη στα ESCs περιλαμβάνει περιοχές με «αντιμαχόμενες» τροποποιήσεις ιστονών (bivalent domain), οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε με ενεργή (Η3Κ4me3) ή με ανενεργή κατάσταση της χρωματίνης (H3K27me3), ενώ η απορρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών ελέγχου σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους έχει συσχετισθεί με τη καρκινογένεση στον άνθρωπο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των bivalent domain φαίνεται να έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Polycomb, και ιδιαίτερα ο EZH2 που δρα σαν μεθυλοτρανσφεράση στην επιγενετική τροποποίηση H3K27. Πρόσφατα, μια σειρά από μελέτες έδειξαν ότι CScs στη διηθητική παρυφή του όγκου ενδέχεται να συμμετέχουν ενεργά στη καρκινογένεση. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι η βιολογική διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) οδηγεί υποπληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου να αποκτήσουν ιδιότητες stem κυττάρων, φαίνεται να αποτελεί τον σύνδεσμο μεταξύ μετάστασης και κατάστασης πολυδυναμίας (stemness). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεώρηση αυτή, είναι πιθανό τα CSCs να εντοπίζονται κυρίως στη διηθητική παρυφή ενός όγκου, ενώ επιπλέον οι ιδιότητες stem κυττάρων που έχουν αποκτήσει είναι το αποτέλεσμα κυρίως της ΕΜΤ. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει επομένως εξαιρετικό ενδιαφέρον η προσεκτική και στοχευμένη εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα στην διηθητική παρυφή του μελανώματος, και αυτός ήταν ένας από τους στόχους της παρούσας διαδακτορικής διατριβής. Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, Oct4, SOX2 όπως επίσης και την παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 (bivalent domain) στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανότητα αναγνώρισης και στοχοποίησης καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, με ιδιαίτερη έμφαση στη διηθητική παρυφή του όγκου. Υλικό και μέθοδος. Το ποσοστό κυττάρων με ανοσοθετικότητα για τα αντισώματα έναντι των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, SOX2 και Oct4 όπως επίσης και των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 εκτιμήθηκε σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα 250 του δέρματος, εφαρμόζοντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Από αυτό το σύνολο των 89 δειγμάτων τα 70 αφορούν πρωτοπαθές μελάνωμα δέρματος, ενώ τα υπόλοιπα 19 προέρχονται από υλικό που εξαιρέθηκε κατά τη χειρουργική εκτομή του μεταστατικού μελανώματος. Επιπλέον 14 δείγματα περιείχαν εκτός από καρκινικά κύτταρα μελανώματος και κύτταρα σπίλων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) και H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA). Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI). Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε για τα αντισώματα έναντι των EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ αντίθετα βρέθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση για τους παράγοντες SOX2 και Oct4. Παρατηρήθηκε ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας στα κύτταρα μελανώματος με σημαντικά αυξημένο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με θετική ανοσοχρώση H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή του όγκου. Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο μεταγραφικός παράγοντας EZH2, χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντικά, ενώ παρατηρήθηκε και σε ορισμένες μεμονωμένες περιπτώσεις με τον SOX2. Όσον αφορά τον ΕΖΗ2, βρέθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του παράγοντα στα κύτταρα μελανώματος σε σχεση με τα σπιλοκύτταρα (p=0.02). H πυρηνική έκφραση SOX2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της βασική στιβάδας (p=0.02), όπως επίσης και στα σπιλοκύτταρα συγκριτικά με τα κερατινοκύτταρα της βασικής (p=0.0016) και της υπερβασικής στιβάδας (p=0.027). Η συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης με διάφορες παραμέτρους των ασθενών έδεξε υψηλότερα επίπεδα SOX2 στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045), στα κύτταρα μελανώματος με πάχος όγκου κατά Breslow <1mm (p=0.023), χωρίς εξέλκωση (p=0.009) και με αριθμό μιτώσεων ≤6 μιτ/mm2 (p=0.016). Τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης Oct4 βρέθηκαν υψηλότερα στα σπιλοκύτταρα σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα (p<0.001) αλλά και με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.004). Η μελέτη ωστόσο της κυτταροπλασματικής ανοσοθετικότητας έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων Oct στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της υπερβασικής στιβάδας (p<0.001), όπως επίσης στα μεταστατικά σε σχέση με τα πρωτοπαθή μελανώματα (p=0.025). Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι το προφίλ έκφρασης του Oct4 βρέθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις να αυξάνεται τοπικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός των μελανωμάτων. Τα μελανώματα με υψηλό επίπεδο διήθησης κατά Clark (IV-V) (p=0.038) ή μεγάλο 251 πάχος όγκου κατά Breslow (>1mm) (p<0.001) εμφάνισαν χαμηλότερο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με ανοσοθετικότητα για το αντίσωμα H3K4me2 σε σχέση με τους όγκους με μικρότερο βαθμό διήθησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεταστατικοί όγκοι είχαν χαμηλότερα ποσοστά θετικής ανοσοχρώσης και για τις δύο επιγενετικές τροποποιήσεις, H3K4me2 και H3K27me3, συγκριτικά με τους πρωτοπαθείς όγκους (p=0.0065 και p=0.027 αντίστοιχα). Τέλος, η ανάλυση της παράλληλης ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα μελανώματος έδειξε θετική συσχέτιση των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων (p<0.01), όπως επίσης και μεταξύ του EZH2 και της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 (p=0.03). Ισχυρή συσχέτιση βρέθηκε παρομοίως μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Oct4 και SOX2, τόσο για την πυρηνική όσο και την κυτταροπλασματική εντόπιση (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). Συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργική σημασία των τριών υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων και του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών στην καρκινογένεση, τα ευρήματα μας εισηγούνται ότι οι ΕΖΗ2, SOX2, Oct4 όπως επίσης και οι επιγενετικές τροποποιήσεις Η3Κ4me3 και H3K27me3 αποτελούν εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα, και ιδιαίτερα στη διηθητική παρυφή του όγκου. Η υπόθεση αυτή πρέπει να διεριευνηθεί περαιτέρω, καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει, σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες, ένα μικρό βήμα προς τη κατεύθυνση της στοχευμένης αντικαρκινικής θεραπείας του μελανώματος στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος. / Cutaneous malignant melanoma originates from melanocytes and is characterized by constantly growing incidence and mortality rates world-wide. The substantial unresponsiveness of advanced metastatic melanomas to most forms of chemotherapy and radiation indicates an urgent need for more effective agents to overcome chemoresistance. Accumulating evidence strongly suggests the presence and involvement of cancer cells with properties of stem cells (CSCs) in the initiation, progression and metastasis of malignant melanoma. EZH2, SOX2 and Oct4 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Genome-wide analyses of chromatin states of embryonic stem and progenitor cells suggest a ‘bivalent’ colocalization of the activating H3K4 methylation and the repressive H3K27me3 in development-associated genes, while the misregulation of histone modifications on specific residues actively contributes to human cancer. PcG proteins and mainly EZH2 are responsible for maintaining the balance of the bivalent chromatin domain through the methylation of H3K27. Recently a number of studies have shown that cancer cells with properties of stem cells at the tumor invasion front might be involved in the development of metastasis. The discovery that the epithelial to mesenchymal transition (EMT) generates cells with properties of stem cells and a more invasive and metastatic phenotype, brings a connection between metastasis and stem-cell state. According to this model, cells with stem cell properties are located predominantly at the invasion front of the tumor and can derive through the acquisition of transient EMT phenotype. In this context, a comparative analysis of the expression profile of putative CSC markers between the invasion front and the inner tumor mass could test this hypothesis in the case of cutaneous melanoma as well. Purpose. Taking these data into account, we performed the current study in order to evaluate the immunohistochemical expression of EZH2, SOX2 and Oct4 as well as H3K4me2 and H3K27me3, which constitute stem cell-like "bivalent"domains, in cutaneous malignant melanoma, investigating besides the potential identification of cancer cells with stem cells properties at the invasion front of the tumor. Materials and methods. Expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 was evaluated in 89 malignant melanoma (MM) lesions, deriving from 79 patients, using immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. The analyzed cases were accessioned over the time interval 2001-2010 and retrieved from an electronic database maintained by the Department of Pathology of the University General Hospital of Patras (Rion, Greece). The sample consists of 70 primary and 19 metastatic specimens. 14 specimens contained both melanoma cells and nevus cells. Analysis and comparative studies were carried out on the expression of the proteins tested in nevus cells (where existed), melanoma cells, melanoma cells at the invasion front, basal and suprabasal 253 keratinocytes as well. Polymer based technique (Envision, Dako, USA) or MACH4 Universal HRPPolymer Detection (Biocare Medical, USA) and primary antibodies against EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) and H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 19.0). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. The three markers studied, EZH2, H3K4me2 and H3K27me3, were identified in the cell nuclei of melanoma cells, nevus cells and normal epidermal keratinocytes, while SOX2 και Oct4 showed nuclear as well as cytoplastik expression. A specific distribution pattern of H3K4me2 and H3K27me3 was found, as stronger levels were localized at the invasion front of the tumor (p=0.034 and p<0.01 respectively). A similar trend was also observed for EZH2, whithout achieving however statistical significance (p=0.08), and similarly for SOX2 in a few sporadic cases. Significantly increased EZH2 immunohistochemical expression was observed in melanoma cells with respect to nevus cells (p=0.02). Nuclear SOX2 levels were also higher in melanoma cells than basal keratinocytes (p=0.02) and in nevus cells than basal keratinocytes (p=0.0016) and suprabasal keratinocytes (p=0.027). Furthermore LIs in melanoma cells presented significantly higher values in primary with respect to metastatic malignant melanoma lesions (p=0.045) as well as in melanoma cells with low Breslow’s depth (≤1mm) (p=0.023), under the absence of ulceration (p=0.009) and with low (≤6/mm2) mitotic rate (p=0.016). As well as nuclear expression of Oct4 is concerned, it was found increased in nevus cells with compared to keratinocytes (p<0.001) and melanoma cells (p=0.004). Cytoplastic expression of Oct4 followed an opposite trend, with decreasing levels in melanoma cells with respekt to suprabasal keratinocytes (p<0.001) and in metastic compared to to primary melanoma cases (p=0.025). Remarkably occasionally increased Oct4 expression in endothelial cells of the tumor microvasculature in melanoma tissues was observed. Furthermore, H3K4me2 and H3K27me3 levels were lower in metastatic with respect to primary melanoma cases (p=0.0065 and p=0.027 respectively). Advanced melanoma demonstrated significantly lower H3K4 immunohistochemical expression than cases of lowest Clark’s level (I) (p=0.038) or low Breslow’s depth (≤1 mm) (p<0.001). Moreover, EZH2 expression in melanoma cells was higher compared to nevus cells (p=0.02). Finally statistical analysis further revealed a positive correlation in melanoma cells betwenn EZH2 and H3K27me3 (p=0.03), H3K4me2 and H3K27me3 (p<0.01), as well as between Oct4 and SOX2 for both nuclear and cytoplastik expression (p<0.001 and p<0.001 respektively). Conclusions. Our results suggest the possibility that combined immunohistochemical expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 might identify cancer cells with potential stem cell properties, particularly at the invasion front of this malignancy. This hypothesis should be further investigated, as many of the epigenetic changes are reversible via pharmacologic manipulations and new CSC-directed therapies, overpassing the resistance of advanced melanoma, may be developed.

No description available.