O tratamento dos gliomas malignos cerebrais é um dos grandes desafios da medicina atualmente, pois, apesar do grande avanço no conhecimento destes tumores, o prognóstico de vida dos portadores desta doença é muito ruim. Foram estudados retrospectivamente 61 pacientes com diagnóstico de glioblastoma multiforme ou astrocitoma anaplásico, no período de 1998 a 2002, com o objetivo de avaliar o uso do Paclitaxel como potencializador do tratamento radioterápico destes tumores. Todos os pacientes foram tratados inicialmente com cirurgia para retirada ampla do volume tumoral (mínimo de 80%) seguido de tratamento com radioterapia fracionada e reforço com radiocirurgia estereotáxica. Em caso de crescimento tumoral, após o tratamento inicial dos pacientes com KPS > 70, novo tratamento cirúrgico e nova radiocirurgia foram indicados. Destes 61 pacientes, 32 receberam tratamento com Paclitaxel, na dose de 100mg/m2 e 29 pacientes não receberam nenhum tipo de quimioterápico. Os grupos foram comparados, em relação ao tipo histológico, faixa etária, sexo e localização tumoral, não havendo diferenças estatisticamente significantes entre os mesmos. Os pacientes de ambos os grupos tiveram acompanhamento laboratorial antes, durante e após o tratamento com paclitaxel e foram acompanhados até o óbito causado pela doença. Foram excluídos do estudo os portadores de tumor que foram a óbito por outras causas. A análise dos resultados mostrou que não houve diferenças estatísticas em relação à sobrevida média do grupo tratado com Paclitaxel e o grupo sem o tratamento (p=1,000). Da mesma forma, a comparação entre os pacientes com glioblastomas (p=0,8933) e com astrocitomas anaplásicos (p=0,5920) de ambos os grupos não mostrou diferença estatística em relação à sobrevida. O número de craniotomias( p=0,5268) e o número de radiocirurgias (p=0,3666) foram semelhantes estatisticamente. Os estudos laboratoriais realizados durante o tratamento no grupo que recebeu o paclitaxel, não mostraram alterações que levassem à suspensão do tratamento. A análise dos resultados deste estudo permitiu concluir que o uso do paclitaxel, concomitante ao tratamento radioterápico dos gliomas malignos cerebrais, não mostrou nenhum ganho adicional na sobrevida dos pacientes portadores destes tumores e, pela análise da necessidade de novo tratamento durante o curso da doença, não potencializou os efeitos da radioterapia. Palavras-chave: Paclitaxel, gliomas malignos, radioterapia / Nowadays, the treatment of the malignant cerebral gliomas is one of the greatest challenges for neurosurgons. Despite of the advance regarding these tumors? knowledge expectance of life for these patients is very bad. The main purpose of this study was to evaluate the use of paclitaxel to enhance the radiotherapy treatment in those tumors. Sixty-one patients with diagnosis for glioblastoma multiforme or anaplastic astrocytoma in the period of 1998 to 2002 were, retrospectively, studied. All patients were initially treated with surgery in order to remove a wide portion of the tumor?s volume (minimum of 80%). Then, the patients were treated with fractionated radiotherapy and reinforcement with stereotactic radiosurgery. If there was an increase in the tumor after the initial treatment, the patients with a KPS higher than 70 had new treatment with surgery as well as with radiosurgery. Among the 61 patients, 32 were treated with a 100 mg/m2 dose of paclitaxel, and 29 of then did not have any kind of chemotherapy treatment. Comparisons bettwen both regardhg to the histological type, age, gender and location of the tumor showed no differences . Patients of both groups had a laboratory follow-up before, during and after the treatment with paclitaxel. All of them were followed until their death, which was caused by the disease. Patients that died from other diseases were not included in the study. The analysis of the results indicated that there were no statistics differences regarding the mean survival time between the groups treated or nor treated with paclitaxel ( p=1,000). Likewise, a comparison between the glioblastomas (p=0,8933) and the anaplastic astrocytomas (p=0,5920) of both groups did not indicate any statistic difference regarding to the survival time. The was no statistic difference between the number of craniotomies (p=0,5268) as well as between the number of radiosurgeries. (p=0,3666). The laboratory studies held during the treatment of the group that received the paclitaxel did not show any changes which could lead to cease the treatment. Hence the results led to the conclusion that the treatment of malignant cerebral gliomas with paclitaxel and radiotherapy treatment at the same time did not give any additional gain in the patients?survival. Regarding to the demand for new treatment throughout the disease, there was no enhance of the radiotherapy effects with the Paclitaxel. Key words: Paclitaxel, malignant gliomas, radiotherapy.

O tratamento dos gliomas malignos cerebrais é um dos grandes desafios da medicina atualmente, pois, apesar do grande avanço no conhecimento destes tumores, o prognóstico de vida dos portadores desta doença é muito ruim. Foram estudados retrospectivamente 61 pacientes com diagnóstico de glioblastoma multiforme ou astrocitoma anaplásico, no período de 1998 a 2002, com o objetivo de avaliar o uso do Paclitaxel como potencializador do tratamento radioterápico destes tumores. Todos os pacientes foram tratados inicialmente com cirurgia para retirada ampla do volume tumoral (mínimo de 80%) seguido de tratamento com radioterapia fracionada e reforço com radiocirurgia estereotáxica. Em caso de crescimento tumoral, após o tratamento inicial dos pacientes com KPS > 70, novo tratamento cirúrgico e nova radiocirurgia foram indicados. Destes 61 pacientes, 32 receberam tratamento com Paclitaxel, na dose de 100mg/m2 e 29 pacientes não receberam nenhum tipo de quimioterápico. Os grupos foram comparados, em relação ao tipo histológico, faixa etária, sexo e localização tumoral, não havendo diferenças estatisticamente significantes entre os mesmos. Os pacientes de ambos os grupos tiveram acompanhamento laboratorial antes, durante e após o tratamento com paclitaxel e foram acompanhados até o óbito causado pela doença. Foram excluídos do estudo os portadores de tumor que foram a óbito por outras causas. A análise dos resultados mostrou que não houve diferenças estatísticas em relação à sobrevida média do grupo tratado com Paclitaxel e o grupo sem o tratamento (p=1,000). Da mesma forma, a comparação entre os pacientes com glioblastomas (p=0,8933) e com astrocitomas anaplásicos (p=0,5920) de ambos os grupos não mostrou diferença estatística em relação à sobrevida. O número de craniotomias( p=0,5268) e o número de radiocirurgias (p=0,3666) foram semelhantes estatisticamente. Os estudos laboratoriais realizados durante o tratamento no grupo que recebeu o paclitaxel, não mostraram alterações que levassem à suspensão do tratamento. A análise dos resultados deste estudo permitiu concluir que o uso do paclitaxel, concomitante ao tratamento radioterápico dos gliomas malignos cerebrais, não mostrou nenhum ganho adicional na sobrevida dos pacientes portadores destes tumores e, pela análise da necessidade de novo tratamento durante o curso da doença, não potencializou os efeitos da radioterapia. Palavras-chave: Paclitaxel, gliomas malignos, radioterapia / Nowadays, the treatment of the malignant cerebral gliomas is one of the greatest challenges for neurosurgons. Despite of the advance regarding these tumors? knowledge expectance of life for these patients is very bad. The main purpose of this study was to evaluate the use of paclitaxel to enhance the radiotherapy treatment in those tumors. Sixty-one patients with diagnosis for glioblastoma multiforme or anaplastic astrocytoma in the period of 1998 to 2002 were, retrospectively, studied. All patients were initially treated with surgery in order to remove a wide portion of the tumor?s volume (minimum of 80%). Then, the patients were treated with fractionated radiotherapy and reinforcement with stereotactic radiosurgery. If there was an increase in the tumor after the initial treatment, the patients with a KPS higher than 70 had new treatment with surgery as well as with radiosurgery. Among the 61 patients, 32 were treated with a 100 mg/m2 dose of paclitaxel, and 29 of then did not have any kind of chemotherapy treatment. Comparisons bettwen both regardhg to the histological type, age, gender and location of the tumor showed no differences . Patients of both groups had a laboratory follow-up before, during and after the treatment with paclitaxel. All of them were followed until their death, which was caused by the disease. Patients that died from other diseases were not included in the study. The analysis of the results indicated that there were no statistics differences regarding the mean survival time between the groups treated or nor treated with paclitaxel ( p=1,000). Likewise, a comparison between the glioblastomas (p=0,8933) and the anaplastic astrocytomas (p=0,5920) of both groups did not indicate any statistic difference regarding to the survival time. The was no statistic difference between the number of craniotomies (p=0,5268) as well as between the number of radiosurgeries. (p=0,3666). The laboratory studies held during the treatment of the group that received the paclitaxel did not show any changes which could lead to cease the treatment. Hence the results led to the conclusion that the treatment of malignant cerebral gliomas with paclitaxel and radiotherapy treatment at the same time did not give any additional gain in the patients?survival. Regarding to the demand for new treatment throughout the disease, there was no enhance of the radiotherapy effects with the Paclitaxel. Key words: Paclitaxel, malignant gliomas, radiotherapy.

Das Glioblastom ist der häufigste hirneigene Tumor des Erwachsenen und mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5 % eine der aggressivsten Hirntumorerkrankungen (Batash et al., 2017). Verbunden mit einer schlechten Prognose und geringen Remissionsraten ergibt sich die Notwendigkeit, bestehende Therapieoptionen zu optimieren und zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das vor einigen Jahren entwickelte und aktuell in klinischen Studien angewandte Konzept der Therapie von Malignomen mit elektrischen Wechselfeldern, den sog. Tumor Treating Fields (TTFields), aufgegriffen. Basis der anti-tumoralen Wirkung der im Rahmen von Glioblastom-Studien applizierten TTFields bildet eine Tumor-spezifische Frequenz von 200 kHz sowie geringe Intensitäten, die einen nebenwirkungsarmen anti-mitotischen Effekt erzielen (Kirson et al., 2004; Kirson et al., 2007; Clark et al., 2017; Porat et al., 2017). Dieser resultiert sowohl aus alternierenden elektrischen Feldern, die während der Metaphase über eine Irritation des Dipolmoments von Tubulin-Untereinheiten die Assemblierung des Spindelapparates inhibieren, als auch aus inhomogenen elektrischen Feldern, die während der Telophase die Trennung der Tochterzellen behindern. Mit dieser Behandlungsoption konnten schon einige gute Ergebnisse für die Behandlung von Glioblastomen in klinischen Studien erreicht werden (Stupp et al., 2017). Eine weitere anti-mitotische Therapieoption stellt die Inhibierung der Aurora B Kinase mittels AZD1152 dar. Die Aurora B Kinase ist Teil des Chromosomal Passenger Complex (CPC), der bei Inhibierung der Kinase seine Kontrollfunktionen während der Mitose und Zytokinese nicht wahrnehmen kann. Diese fehlende Kontrolle führt zu Polyploidie, die einen Zelltod verursachen kann (Wiedemuth et al., 2016). Aufgrund dieses ähnlichen biologischen Hintergrundes wurde zu Beginn dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass eine kombinierte Therapie mittels TTFields und AZD1152 einen additiven zytotoxischen Effekt im Vergleich zur Monotherapie mit TTFields erzielen kann. Es konnte zunächst für die etablierte Zelllinie U87-MG ein signifikanter additiver Effekt in der Kombinationstherapie der TTFields mit AZD1152 im Vergleich zur alleinigen Therapie mittels TTFields nachgewiesen werden. Die mediane Tumorzellzahl konnte hierbei in der Kombinationstherapie um 60 % reduziert werden. Dieser additive Effekt konnte ebenfalls an zwei Primärkulturen reproduziert werden. Hierbei konnte die relative mediane Tumorzellzahl der Primärkultur HT18584 ebenfalls um 60 % in der Kombinationstherapie gesenkt werden. Diese tetraploide Zellreihe zeigte außerdem einen außergewöhnlich großen zytotoxischen Effekt bei der Behandlung mit AZD1152. Signifikant zeigte ebenso die Primärkultur HT12347 einen medianen Verlust von 56 % der Tumorzellen nach einer kombinierten Behandlung. Qualitativ und zellmorphologisch konnte mittels konfokaler Laser-Scanning- sowie Lichtmikroskopie die Akkumulation von mitotischen Defekten detektiert werden, die auch in den Monotherapien aber vor allem in der Kombinationstherapie zu finden waren. Die in der quantitativen Analyse gezeigte additive Zytotoxizität der Kombinationstherapie konnte hier nochmals visualisiert und bestätigt werden. Für eine klinische Phase I-Studie zur Überprüfung der Effektivität sollten zunächst weitere zellkulturtechnische Daten erfasst werden, um die Universalität der kombinierten Behandlung zu überprüfen. Weiterhin wäre die Entwicklung einer selektiven/lokalen Therapie mittels AZD1152 wünschenswert, um die Nebenwirkungen des Medikamentes abzumildern. Es sollte außerdem das im Rahmen dieser Arbeit detektierte sensitivere Ansprechen der tetraploiden Zelllinie HT18584 genauer untersucht werden, um eine potentiell prognostisch günstige Verbindung zwischen der Behandlung mit AZD1152 und tetraploiden Zellen herstellen zu können.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Glioblastoma multiforme – Definition, Inzidenz und Ätiologie 1 1.1.1 Symptomatik und Diagnostik des Glioblastoms 2 1.2 Molekulare Klassifizierung 3 1.2.1 Primäre und sekundäre Glioblastome und einige allgemeine Marker 3 1.2.2 Der MGMT-Status 5 1.3 Der eukaryotische Zellzyklus und sequentielle Kontrollpunkte 6 1.3.1 Der Chromosomal Passenger Complex (CPC) 8 1.3.2 Die Familie der Aurorakinasen 9 1.4 Therapie maligner Gliome 10 1.4.1 Standardtherapie eines Glioblastoms 10 1.4.2 Tumor Treating Fields (TTFields) – Biologischer Effekt und Studienlage 11 1.4.3 Aurora Kinase-Inhibitoren 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 15 2 METHODEN UND MATERIALIEN 17 2.1 Methoden 17 2.1.1 Zellkultivierung allgemein 17 2.1.2 Passagieren adhärenter Zellen 17 2.1.3 Kultivierung von primärem Patientenmaterial 18 2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung eukaryotischer Zelllinien 18 2.1.5 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Neubauer-Zählkammer 19 2.1.6 Durchflusszytometrische Analyse 19 2.1.7 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Propidiumiodid (PI) 20 2.1.8 Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von Glioblastomzellen 20 2.1.9 In vitro-Applikation der Tumor Treating Fields (TTFields) 21 2.1.10 Titration der effektiven Aurora B Kinase-Inhibitorkonzentrationen mittels PI 22 2.1.11 Titration inhibitorischer Temozolomidkonzen-trationen mittels AlamarBlue-Assay 23 2.1.12 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 23 2.2. Materialien 25 2.2.1 Geräte 25 2.2.2 Chemikalien und Reagenzien 25 2.2.3 Lösungen 26 2.2.4 Medien 27 2.2.5 Kommerzielle Kits 28 2.2.6 Antikörper 28 2.2.7 Software 28 2.2.8 Statistik 29 2.2.9 Zelllinien 29 3 ERGEBNISSE 30 3.1 Wahl des Designs der Kontrollgruppen 30 3.2 Typisierung der verwendeten Primärkulturen 32 3.2.1 Befunde der Pathologie des Universitätsklinikums Dresden 33 3.2.2 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT18584 34 3.2.3 Immunphänotypisierung der Primärkultur HT12347 35 3.3 Titrationen mit AZD1152 36 3.3.1 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT18584 36 3.3.2 Titration mit AZD1152 für die Primärkultur HT12347 37 3.4 Kombinationstherapie mittels AZD1152 und TTFields 38 3.4.1 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an U87-MG 39 3.4.2 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT18584 40 3.4.3 Quantitativer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 41 3.4.4 Qualitativer Effekt der Kombinationstherapien 42 3.4.4.1 Die Kombinationstherapie mit U87-MG 43 3.4.4.2 Die Kombinationstherapie mit HT18584 44 3.4.5 Zytotoxischer Effekt der Kombinationstherapie an HT12347 45 3.5 Titrationen mit Temozolomid 47 3.5.1 Therapie mit Temozolomid an U87-MG 48 3.5.2 Therapie mit Temozolomid an Primärkulturen 48 4 DISKUSSION 52 4.1 Vorversuche 52 4.1.1 Wachstumsanalyse der Kontrollgruppen 52 4.1.2 Charakterisierung der Primärkulturen 53 4.2 Die neuen Behandlungsoptionen 54 4.2.1 Applikation der TTFields 54 4.2.2 Die Behandlung mit AZD1152 55 4.2.3 Die Kombinationstherapie 57 4.3. Die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) 59 5 ZUSAMMENFASSUNG 62 LITERATURVERZEICHNIS 64 TABELLENVERZEICHNIS 73 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 74 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 75 ANHANG 77 Anhang 1: Einverständniserklärung der Patienten 77 Anhang 2: Erlaubnis zur Nutzung der Patientendaten der Pathologie 78 Anhang 3: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 79 Anhang 4: Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Vorgaben 81