Orientador: Eduardo Alves de Almeida / Banca: Luis Octavio Regasini / Banca: Camilo Dias Seabra Pereira / Resumo: Dentre os efeitos negativos da exposição a poluentes nos animais aquáticos podemos destacar o estresse oxidativo, uma produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio, consequentemente, uma cascata de eventos bioquímicos denominados peroxidação lipídica (PL) ocorrem tendo como principal produto o malondialdeído (MDA). Assim, ainda que o aumento dos níveis de MDA esteja relacionado a intoxicação por poluentes, alguns trabalhos têm mostrado uma diminuição do MDA frente a essa exposição, mesmo com alterações em enzimas antioxidantes. Deste modo, este trabalho teve por objetivo avaliar se possíveis decréscimos nos níveis de MDA em peixes Astyanax altiparanae expostos a contaminantes ambientais pode ter relação com aumentos na atividade de defesas antioxidantes, aumentos na atividade da ALDH ou excreção do MDA na água. Assim, os lambaris foram expostos a misturas de metais (cádmio e cobre) nas concentrações 40 e 100 μg/L e a biodiesel B5 nas concentrações de 0,001, 0,01 e 0,1 mL/L para verificar a relação entre MDA e as enzimas antioxidantes, em amostras de brânquia e fígado. Um segundo experimento, injetando MDA nos espécimes foi realizado, nestes organismos, foram injetados intraperitonealmente doses de 10 mg/kg e 100 mg/kg de MDA com coleta do material biológico após 5 dias para avaliar o efeito do MDA no fígado e na brânquia do lambari. Um terceiro experimento foi realizado para avaliar a metabolização do MDA em brânquia e fígado e sangue com coleta de material biológico e água nos tempos zero (logo após receber a dose), 1 e 12 horas. Nestes experimentos a metabolização do MDA foi observada pela atividade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) e as enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glicose - 6- fosfatodesidrogenase (G6PDH) e a de biotransformação glutationa S-transferase (GST), peróxidos... / Abstract: Among the adverse effects of exposure to pollutants in aquatic animals, we can highlight oxidative stress, which can be caused due to an exacerbated production of reactive oxygen species along with a cascade of biochemical events. During this cascade, one of oxidative consequences we can observe is called lipid peroxidation (LPO) with its main product malondialdehyde (MDA). Thus, although the increase in MDA levels is related to intoxication by pollutants, some studies have shown a decrease in MDA levels in aquatic organisms exposed to pollutants, even with significant improvment in antioxidant enzymes. Thus, this study aimed to assess the relationship among the reduced MDA levels in Astyanax altiparanae fish exposed to environmental contaminants, and increased antioxidant defenses and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, or excretion of MDA in the water. In this way, the fishes were exposed to mixtures of metals (cadmium or copper) at concentrations of 40 g/L and 100 g/L and to B5 biodiesel in concentrations of 0.001 mL/L, 0.01 mL/L and 0.1 mL/L in order to verify the relation between MDA and antioxidant enzymes in the liver, and gill samples. We performed a second experiment by injecting MDA in the fish specimens. We intraperitoneally injected doses of 10 mg/kg and 100 mg/kg of MDA. After 5 days, we collected the liver and gill in order to evaluate the effect of MDA in the fishes. A third experiment was conducted to investigate MDA metabolization in blood, gill and liver samples, through collection of biological material and water at zero time (shortly after receiving the same intraperitoneal injections as in the second experiment), 1 and 12 hours after the injections. In these experiments, the MDA metabolization was monitored by the activity of ALDH and by the antioxidant enzymes such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glucose-6-phosphate dehydrogenase ... / Mestre

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Gravina.pdf: 2149838 bytes, checksum: e6a1a4c198175fce83c0ce2c98c81a23 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Microorganisms are essential components in the maintenance of biogeochemical cycles and ecosystems. In agricultural environments, continuous use of herbicides to minimize the loss in productivity could damage growth inibition of micro-organisms. One cause of this inhibition is increased production of ROS (reactive oxygen species), such as superoxide radicals (O2 -) and hydroxyl (OH-) and hydrogen peroxide (H2O2), causing oxidative stress. The magnitude of this stress can be conditioned by the chemical group and mode of action of the herbicide. The cell responses against ROS involve an increase in the expression of enzymes such as superoxide dismutase and catalase, responsible for the dismutation of O2- and H2O2, respectively. The objective of this study was to evaluate the relationship between the effect of herbicides with different modes of action and answers of superoxide dismutase (SOD) isoenzymes in the bacterium Escherichia coli K-12 bacteria. For this, 2,4-D, paraquat and atrazine herbicides were used, and knockout strains of E. coli K-12 strains carrying mutations in the gene encoding Mn-SOD (sodA) and Fe-SOD (sodB). Herbicides were shown to be capable of promoting the imbalance of redox potential, increasing the production of H2O2 and malondialdehyde (MDA) above the rates observed in controls and differently between strains. Exposed to paraquat, which indices in vivo redox cycling, strains of E. coli wt and ΔsodB showed increased production of H2O2, and increase in the Mn-SOD activity, probably as a result from activation of the SoxR, which promotes the transcription of the gene sodA. In ΔsodA, the toxicity rates with paraquat were not higher than the control, indicating a possible regulation of the Fe-SOD expression by OxyR transcriptional factor. Our results indicated that deletion of genes encoding SOD enzymes originated patterns of antioxidative responses, according to the tested periods of time, regardless the herbicides. To ΔsodB, the damage was minor in time 9pm; but in ΔsodA, the damage was minor in time 5pm, demonstrating the important role of these genes in the defense against oxidative stress in different stages of growth. Cellular responses demonstrated despite the observed toxicity indices, the strains were able to grow at rates close to those verified in control, including an increase in the fitness value in ΔsodA, which indicates a wide plasticity of responses, and a potential for a quick fitting of E. coli K-12. Extending this hypothesis, considering an environment containing a toxic molecule, such as an herbicide, and a bacterium having a polymorphic system for SOD, if a mutation appears in a gene coding for isoforms, it may show an increase in cell viability and still maintain a functional antioxidative enzyme. We suggest that E. coli K-12, a strain created in a laboratory, and with probably low survivability in a natural environment, developed mechanisms of in vitro herbicide tolerance, even without previous selection. This phenotypic plasticity model might be found in other bacteria of agricultural land, with high turnover of cultures and intense use of herbicides, which could cause a considerable impact on the diversity and functionality of soil microbiota. / Microrganismos representam componentes essenciais na manutenção dos ciclos biogeoquímicos e de ecossistemas. Em ambientes agrícolas, o uso contínuo de herbicidas para minimizar a perda na produtividade pode acarretar danos inibindo o crescimento em microrganismos. Uma das causas desta inibição é o aumento da produção de ERO (espécies reativas de oxigênio), como os radicais superóxido (O2-) e hidroxila (OH-), e o peróxido de hidrogênio (H2O2), causando estresse oxidativo. A magnitude deste estresse pode ser condicionada pelo grupo químico e pelo modo de ação do herbicida. As respostas celulares contra ERO envolvem o aumento na expressão de enzimas como superóxido dismutase e catalase, responsáveis pela dismutação de O2- e H2O2, respectivamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre o efeito de herbicidas com diferentes modos de ação e as respostas das isoenzimas de superóxido dismutase (SOD) na bactéria Escherichia coli K-12. Assim, foram utilizados os herbicidas 2,4-D, atrazina e paraquat, e linhagens mutantes de E. coli K-12 nocauteadas para os genes codificantes das enzimas Mn-SOD (sodA) e Fe-SOD (sodB). Os herbicidas mostraram-se capazes de promover o desequilíbrio do potencial redox, aumentando a produção de H2O2 e malondialdeido (MDA), acima das taxas observadas nos controles e de forma distinta entre as linhagens. Expostas ao paraquat, o qual origina ciclismo redox in vivo, as linhagens de E. coli wt e ΔsodB apresentaram aumento na produção de H2O2, além de aumento na atividade de Mn-SOD, provavelmente como consequência da ativação do SoxR, o qual promove a transcrição do gene sodA. Em ΔsodA, os índices de toxicidade com o paraquat não foram maiores que o controle, indicando uma possível regulação da expressão da enzima Fe-SOD pelo fator transcricional OxyR. Nossos resultados indicaram que a deleção dos genes codificantes para SOD provocaram padrões nas respostas antioxidativas, de acordo com os tempos testados, independentemente dos herbicidas. Para ΔsodB, os danos foram menores no tempo de 9h; já em ΔsodA, os danos foram menores no tempo de 5h, demonstrando a importância do papel destes genes na defesa contra o estresse oxidativo em diferentes fases de crescimento. As respostas celulares demonstraram que, apesar dos índices de toxicidade observados, as linhagens foram capazes de crescer em taxas próximas às verificadas no controle, incluindo ainda um aumento do valor adaptativo em ΔsodA, o que indica uma plasticidade ampla de respostas e um potencial de adaptação rápida. Ampliando esta hipótese, considerando um ambiente contendo uma molécula tóxica, e uma bactéria que possua um sistema polimórfico para SOD, caso ocorra uma mutação no gene para uma de suas isoformas, ela poderá aumentar a viabilidade celular e ainda manter uma enzima antioxidativa funcional. Sugere-se que E. coli K-12, uma linhagem desenvolvida em laboratório e provavelmente com baixa capacidade de sobrevivência em ambiente natural, apresenta mecanismos de tolerância in vitro a herbicidas, mesmo sem seleção prévia. Tal modelo de plasticidade fenotípica poderia ser encontrado em outras bactérias de solo agrícola com alta rotatividade de culturas e intenso uso de herbicidas, podendo causar um impacto considerável na diversidade e funcionalidade desta microbiota.