La transcription du gène lactoferrine conduit à deux isoformes : une sécrétée, la lactoferrine (Lf) et une intracellulaire, la delta lactoferrine (∆Lf). La Lf est dotée de nombreuses propriétés parmi lesquelles des activités immunomodulatrice et anticancéreuse. La ∆Lf possède une activité anticancéreuse via son activité transcriptionnelle. Ce sont des suppresseurs de tumeur potentiels dont l’expression est sous-régulée dans le cas de cancer. Elles sont considérées comme des marqueurs sains car leur expression est corrélée à un facteur de bon pronostic dans le cancer du sein. Au cours de la thèse, j’ai développé la PCR quantitative Taqman afin de distinguer les deux isoformes et étudié leur expression dans le cas de cancer et dans un contexte inflammatoire. Puis j’ai étudié le protéome de cellules HEK-293 exprimant la ∆Lf par électrophorèse 2-D et spectrométrie de masse. J’ai ainsi mis en évidence une nouvelle cible de l’activité transcriptionnelle de la ∆Lf, DcpS, enzyme clé de la maturation des ARNm. En parallèle, ces travaux ont montré une régulation de la stabilité et de l’activité transcriptionnelle de la ∆Lf par la O-GlcNAcylation. Enfin, j’ai étudié les effets différentiels des isoformes de la Lf dans les cellules de glande mammaire cancéreuse MDA-MB-231 via une approche protéomique basée sur le SILAC et la spectrométrie de masse, en collaboration avec l’équipe du Dr. Monsarrat (IPBS, Toulouse). 5030 protéines ont pu être identifiées et quantifiées. Ces travaux ont permis d’identifier le gène SelH en tant que cible de l’activité transcriptionnelle de la Lf et de la ∆Lf, suggérant que la Lf sécrétée possède également un rôle de facteur de transcription. / Transcription of the lactoferrin gene results in the production of two isoforms: a secreted lactoferrin (Lf) and intracellular delta-lactoferrin (ΔLf). Lf has numerous functions including immunomodulatory and antitumoral activities. We showed that ΔLf is a transcription factor, the only activity it shares with Lf being its anticancer activity. Lf and ΔLf are potential tumor suppressors whose expression is downregulated in the case of cancer. They may be considered as healthy markers, the expression of which is correlated with a good prognosis in breast cancer. During my PhD thesis, We developed quantitative Taqman PCR assay to evaluate the level of expression of the transcripts of the two Lf isoforms in case of cancer or in an inflammatory context. We then studied the proteome profile of ΔLf-expressing cells using 2-D electrophoresis and mass spectrometry analyses. Our data established that DcpS, a key enzyme in mRNA decay, is a new target of ΔLf transcriptional activity. In parallel, we demonstrated that Lf stability and transcriptional activity are regulated by O-GlcNAcylation. Finally, We compare the differential effects of the two antitumoral isoforms on the cancerous mammary gland MDA-MB-231 cell line. We used a high-throughput proteomic approach (Stable Isotope Labelling with Amino acids in Cell culture, SILAC) coupled to mass spectrometry to carry out highly accurate quantitative and systematic proteome profiling in collaboration with the team of Dr. Monsarrat (IPBS, Toulouse). Our study allowed the identification of SelH, a thioredoxin like protein, as a target of both Lf and ΔLf transcriptional activity and suggested that secreted Lf acts as a transcription factor.

Les isoprénoïdes, présents dans tous les organismes vivants, sont synthétisés selon deux processus: la voie du Mevalonate et la voie Méthylérythritol phosphate (MEP). Cette dernière, absente chez l’humain, est très étudiée car elle représente une cible pour le développement de nouveaux antimicrobiens. Le ME-N3, un analogue du méthylérythritol portant un azoture, a été synthétisé et exploité dans des expériences de marquage métabolique de la voie MEP en utilisant un couplage bioorthogonale suivi d’une analyse par LC/MS. De façon intéressante, nous avons découvert que le MEP-N3, un analogue du MEP, inhibe l'enzyme IspD d’ E. coli (3ème enzyme de la voie MEP). Les études cinétiques ont révélé que le MEP-N3 possède la meilleure activité inhibitrice sur IspD d’ E.coli en comparaison avec les inhibiteurs connus, et que le mécanisme d'inhibition est de type mixte. Une étude détaillée du mécanisme de la réaction catalysée par IspD a été réalisée pour la première fois, en utilisant une analyse cinétique à deux substrats. / Isoprenoids, present in all living organisms, are synthesised according to two routes: the Mevalonate and the Methylerythritol phosphate (MEP) pathways. The MEP pathway, absent in humans, is extensively investigated as it is a target for the development of new antimicrobials. ME-N3 an azide tagged analogue of methylerythritol was synthesised and utilised for metabolic labelling studies of the MEP pathway using bioorthogonal ligation followed by LC-MS analysis. Interestingly, we found that MEP-N3, an analogue of MEP, inhibits E.coli IspD (3rd enzyme of the MEP pathway). Further inhibition kinetic studies revealed that MEP-N3 possesses the highest inhibitory activity on E.coli ispD when compared to known inhibitors. In addition, the mechanism of inhibition of E.coli ispD by MEP-N3 was found to be best described using a mixed type model. Moreover, determination of the IspD reaction mechanism has been carried out for the first time, by virtue of a bisubstrate steady state kinetic analysis.

Les glycosaminoglycanes (GAG) forment une famille de polysaccharides linéaires retrouvés dans tous les tissus, au niveau des matrices extracellulaires et des surfaces cellulaires. Les héparanes sulfates (HS) sont des membres importants de cette famille et sont liés à une protéine dite cœur pour former ensemble le protéoglycane (PG). Selon le tissu et la nature de la protéine cœur, les HS, composés d'unités disaccharidiques de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d'acide glucuronique (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] vont subir de nombreuses modifications. En effet, les HS sont modifiés par différentes sulfatations au niveau des deux oses et une épimérisation de l'acide glucuronique en acide iduronique (IdoA). Les différentes structures saccharidiques élaborées vont pouvoir être alors interagir avec une très grande quantité de protéines et jouer des rôles divers dans l'inflammation, la prolifération cellulaire, l'angiogenèse, la réponse immunitaire, l'attachement viral…L'étude de la structure des HS, du fait de la nature flexible et hétérogène de ces molécules, a été principalement focalisée sur des analyses fragmentaires du polysaccharide au niveau des séquences d'interaction avec les protéines. Lors de ces dépolymérisations, des informations sur le polysaccharide, notamment l'épimérisation, sont perdues.Dans ce travail, nous avons développé une approche basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) bidimensionnelle 1H-13C pour l'étude de la composition saccharidique des HS réalisée directement à partir des HS isolés de cellules marquées au 13C. Pour cela, un protocole efficace de marquage et de purification des polysaccharides a été mis en place. En intégrant le volume des pics à différents déplacements chimiques par RMN, cette analyse non-destructive permet de déterminer à la fois le profil de sulfatation et d'épimérisation des HS. Cette analyse est appliquée efficacement à différents types cellulaires et est de grand intérêt pour mieux comprendre les changements dans les structures d'HS qui ont lieu lors de régulations physiologiques ou lors de développement pathologiques.Ces résultats ont permis d'ouvrir la voie à l'analyse des HS directement au niveau des cellules par RMN du solide. Les études dans ce contexte représentent un enjeu majeur pour la compréhension des différents rôles des HS et leur capacité à interagir avec une myriade de protéines in vivo. / Glycosaminoglycans (GAGs) belong to a linear polysaccharide family which are found within all tissues, at the extracellular matrix and cell surfaces levels. Heparan Sulfates (HS) are one of the major members of this family, they are bound to a core protein to form altogether the so-called proteoglycan (PG). Depending on the localization and on the core protein, the HS – composed of a N-acetylglucosamine (GlcNAc) and a glucuronic acid (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] building block – undergo various modifications. Indeed, HS can be sulfated at different positions on both monosaccharide and the GlcA can be epimerized into an iduronic acid (IdoA). The fine structures of the polysaccharide will be able to interact with a large range of proteins and play a plethora of roles such as in inflammation processes, cell proliferation, angiogenesis, immune responses, viral attachment…The HS structural studies, due to the flexibility and heterogeneity of the polysaccharide, have so far been restricted to HS fragments able to bind proteins. The depolymerization techniques induce valuable information losses such as epimerization.In this work, we have successfully developed a nuclear magnetic resonance (NMR)-based approach to study HS features from 13C metabolically enriched cells. For this, an effective protocol to label and purify HS has been set up. By integrating peaks' volumes at well-resolved 1H-13C chemical shifts by NMR, the sulfation, epimerization and disaccharide profile can be determined from full-length HS. This method has been used to study HS from various cell types and is of important interest to better understand changes in HS structures that occur through physiologic and pathologic events.The results obtained open the way to analyze HS directly at the cell surface via solid state NMR techniques. In this context, these studies are a major challenge to decipher the different roles of HS and their ability to interact with so many partners in vivo.

Cette thèse porte sur la méthode de marquage métabolique de glycanes. Elle consiste à utiliser des monosaccharides modifiés pouvant être métaboliquement introduits sur la membrane externe des cellules. Deux cibles ont été choisies, les bactéries Legionella pneumophila, et des cellules eucaryotes (lignée cellulaire du cancer de la prostate, PC3).Différents analogues saccharidiques ont été synthétisés pour les deux cibles portant différents rapporteurs chimiques, notamment des fonctions azoture, alcyne terminal, alcène terminal, cyclopropène et cétone. Une voie de synthèse commune a été développée mettant en jeu des dérivés d’esters de N-hydrosuccinimide et des dérivés saccharidiques amino, tels que la D-mannosamine, la D-galactosamine et le L-fucose pour les cellules eucaryotes et des analogues d’un précurseur de l’acide légionaminique pour les bactéries Legionella pneumophila.Des essais de marquages métaboliques de glycanes ont été effectués sur Legionella pneumophila. Pour cela, différents dérivés saccharidiques ont été incorporés par les bactéries, puis la révélation des rapporteurs chimiques avec des groupements complémentaires a été évaluée (azoture-cyclooctyne, alcène-tétrazine, cétone-hydrazide/alkoxyamine). La détection a été réalisée soit directement (fluorophore sur le partenaire), soit indirectement (reconnaissance d’un groupement biotine par une streptavidine portant un fluorophore). Les bactéries ont été ensuite observées par microscopie photonique et les observations ont mis en évidence un marquage membranaire.Pour les cellules eucaryotes (PC3), des essais de marquage métabolique ont été effectués afin de vérifier l’incorporation des monosaccharides modifiés via une détection par fluorescence. Une série d’outils portant les fonctions complémentaires aux rapporteurs chimiques, notamment un dérivé de cyclooctyne (TMDIBO) et un dérivé de tétrazine ont été synthétisés. Ils ont été couplés à des dérivés de biotine afin d’obtenir des outils pour la microscopie photonique et à des ARMs (Antibody Recruiting Molecules), tel que le 2,4-dinitrophényle et le rhamnose, en vue d’une potentielle approche thérapeutique. Celle-ci consiste à combiner l’incorporation de monosaccharides modifiés et leur réaction avec un partenaire portant des ARMs, afin de recouvrir la surface des cellules par ces motifs. Les ARMs en présence de sérum humain vont ensuite activer le complément conduisant à la lyse des cellules marquées. Des tests de marquage métabolique ont été réalisés avec les outils couplés aux ARMs et une détection par fluorescence a permis de vérifier la présence des ARMs à la surface des cellules. Des premiers essais ont été effectués avec du sérum humain et des optimisations sont à réaliser.Le marquage métabolique de glycanes est une méthode efficace afin de détecter par fluorescence les bactéries Legionella pneumophila à l’aide d’analogues d’un précurseur de l’acide légionaminique et les cellules eucaryotes PC3 via des dérivés d’autres monosaccharidiques. Le marquage obtenu dans les deux cas est membranaire. Cette méthode permet éventuellement de combiner des aspects d’imagerie ou de diagnostic, avec différentes approches thérapeutiques. / This PhD work focuses on glycans metabolic labeling. This method uses a modified monosaccharides bearing a chemical reporter. The unnatural monosaccharide is metabolically incorporated into glycans. Two targets were selected, Legionella pneumophila bacteria and prostate cancer cells (PC3).Various saccharidic analogs were synthesized carrying several chemical reporters, like azide, terminal alkyne, terminal alkene, cyclopropene and ketone functions. A common synthetic strategy was developed using N-hydrosuccinimide ester derivatives and amino monosaccharides, such as D-mannosamine, D-galactosamine and L-fucose for eukaryotic cells and analogs of a legionaminic acid precursor for Legionella pneumophila bacteria.Differents metabolic labeling of glycans were carried out on Legionella pneumophila. Various sugar derivatives were incorporated by bacteria, then the reporter group was reacted selectively and covalently with a complementary function (azide-cyclooctyne, alkene-tetrazine, ketone-hydrazide/alkoxyamine). Bacteria were visualized with an imaging probes by light microscopy (directly: partner bearing a fluorophore, indirectly: recognition of a biotin group by a fluorescent streptavidin). The results highlighted outer membrane labeling.For eukaryotic cells (PC3), metabolic oligosaccharides engineering has been accomplished to check chemical reporter analogs incorporation via detection with fluorescent probes. A series of tools carrying functions complementary to the chemical reporters was synthesized, such as cyclooctyne derivatives (TMDIBO) and tetrazine derivatives. These derivatives were combined with biotin groups for detecting tools or with Antibody Recruiting Molecules (ARMs), such as 2,4-dinitrophenyl and L-rhamnose, for potential therapeutic approaches. The concept focuses on the combination of metabolic glycan labeling and the activation of human serum complement by ARMs to kill selectively labeled cells. First, ARMs labeled cells was checked by recognition of fluorescent anti-ARMs antibodies. Then, metabolic glycan labeling and human serum complement activation has been evaluated but the complement activation protocols still need to be optimized.Metabolic labeling of glycans is an effective method to detect, by fluorescence, Legionella pneumophila bacteria using analogs of a legionaminic acid precursor and eukaryotic cells (PC3) with monosaccharide derivatives. The labeling was observed on the membrane of the two targets. This method can potentially combine imaging or diagnostic aspects with various therapeutic approaches.

Les glycanes sont des biomolécules constituées d’un enchainement de monosaccharides liés entre eux par des liaisons glycosidiques. La nature et l’abondance des monosaccharides constituant la chaine glycanique ainsi que l’agencement des motifs de glycosylation diffèrent fortement en fonction de l’organisme d’origine. La biosynthèse et la dégradation de ces architectures polysaccharidiques sont finement régulées par des systèmes enzymatiques spécifiques et sont organisées au sein des divers compartiments cellulaires. Les glycanes interviennent dans divers processus biologiques : réserves énergétiques, repliement et stabilité protéique, reconnaissance cellulaire et adhésion à la matrice extracellulaire.Cette thèse porte sur la synthèse et l’utilisation de composés permettant le marquage métabolique des glycanes de cellules eucaryotes (lignée cellulaire du cancer de la prostate, PC-3) ou de bactéries didermes à mycomembranes (Corynebacterium glutamicum).Les composés synthétisés ou utilisés dans cette thèse sont des saccharides fonctionnalisés par un groupement bio-orthogonal (groupements azido, alcyne ou méthylcyclopropène) ou des outils de marquage porteurs simultanément d’un groupement bio-orthogonal complémentaire (groupements cyclooctyne ou tétrazine) et d’une étiquette pouvant être détectée par une macromolécule fonctionnalisée par des fluorophores (D-biotine/stréptavidine ou 2,4-DiNitroPhénol/ anticorps anti-DNP). La solubilité, en milieu aqueux, des outils de marquage est un facteur limitant leur utilisation. Une partie des travaux de cette thèse a consisté à développer des outils de marquage plus solubles en milieu aqueux, par l’ajout d’un motif -sulfo--alanine. Ce motif porte une fonction acide sulfonique qui est déprotonée, à pH physiologique, favorisant ainsi la solubilité en milieu aqueux.L’incorporation métabolique des saccharides fonctionnalisés ainsi que la capacité des outils à marquer les cellules (après incorporation métabolique) est évaluée, sur l’un ou l’autre des modèles biologiques, par analyse en cytométrie en flux ou par microscopie confocale. / Glycans are biomolecules made up of a chain of monosaccharides bound together by glycosidic bonds. The nature and abundance ofmonosaccharides forming the glycanic chain and the arrangement of glycosylation patterns differ greatly depending on the organism of origin. The biosynthesis and degradation of these polysaccharide architectures are finely regulated by specific enzymatic systems and are organized within the various cell compartments. Glycans are used in various biological processes: energy reserves, protein folding and stability, cell recognition and adhesion to the extracellular matrix.This thesis focuses on the synthesis and use of compounds allowing the metabolic labeling of glycans of eukaryotic cells (cell line of prostate cancer, PC-3) or of diderm bacteria with mycomembranes (Corynebacterium glutamicum).The compounds synthesized or used in this thesis are saccharides functionalized by a bio-orthogonal groups (azido, alkyne or methylcyclopropene groups) or labeling tools simultaneously carrying a bio-orthogonal complementary function (cyclooctyne or tetrazine groups) and a label that can be detected by a macromolecule functionalized by fluorophores (D-biotin/streptavidine or 2,4-DiNitroPhenol/ anti-DNP antibodies). The solubility of labeling tools in aqueous media is a limiting factor. Part of the work of this thesis has been to develop more water-soluble labeling tools by adding a -sulfo--alanine pattern. This pattern has a sulfonic acid function, which is deprotonated at physiological pH, thus promoting aqueous solubility.The metabolic uptake of functionalized saccharides and the ability of tools to label cells (after metabolic uptake) are evaluated in either biological model, by flow cytometry analysis or confocal microscopy.