Šio darbo tikslas buvo ištirti antimikrobinių medžiagų ir daugiavaisčio atsparumo siurblių slopiklių poveikį bakterijų sąveikai su TPP+ jonais. Šiam tikslui pasiekti reikėjo ištirti antimikrobinių peptidų įtaką bakterinių apvalkalėlių laidumui, įvertinti M. smegmatis bakterijų apvalkalėlio sąveiką su TPP+ jonais ir jų pasiskirstymą veikiant šias polikatijoniniais junginiais bei ištirti daugiavaisčio atsparumo siurblių slopiklių įtaką TPP+ jonų pasiskirstymui abipus M. smegmatis bakterijų apvalkalėlio. Šio darbo metu buvo parodyta, kad peptidų pVEC ir cys-pVEC sąveika su gramneigiamųjų E. coli bakterijų apvalkalėliu beveik nesiskiria: peptidai mažai laidina E. coli bakterijų išorinę membraną, bet depoliarizuoja jų plazminę membraną. Peptidas pVEC depoliarizuoja ir gramteigiamųjų B. subtilis bei mikobakterijų M. smegmatis plazminę membraną. Be to, buvo parodyta, kad TPP+ jonų srautų tyrimai gali padėti įvertinti mikobakterijų energetinę būseną. Polimiksinas B – antibiotikas prieš gramneigiamąsias bakterijas – nelaidina mikobakterijų M. smegmatis apvalkalėlio TPP+ jonams, bet depoliarizuoja jų plazminę membraną. Daugiavaisčio atsparumo siurblių slopiklis chlorpromazinas veikia mikobakterijų M. smegmatis plazminę membraną depoliarizuojančiai ir sumažina ampicilino koncentracijas, reikalingas mikobakterijų augimo slopinimui. Nauji potencialūs DVA siurblių slopikliai neturi įtakos M. smegmatis ląstelių jautrumui ampicilinui, bet keletas junginių sąveikauja su TPP+ išmetančiais... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this work was to estimate the effect of membrane permeabilizing compounds and multidrug resistance pump inhibitors on interaction of bacterial envelope with TPP+ ions. To achieve the aim we worked on antimicrobial peptides and their interaction with bacterial envelopes, on estimation of interaction of M. smegmatis envelope with TPP+ ions and equilibration of these ions across mycobacterial envelope. We have found that antimicrobial peptides pVEC and cys-pVEC have very similar effect on the envelope of gram-negative E. coli cells. They have little permeabilizing effect on the outer membrane but effectively depolarize the plasma membrane of E. coli. The peptide pVEC has depolarizing effect on both B. subtilis and M. smegmatis plasma membrane. We described interaction of M. smegmatis envelope with TPP+ ions. Polymyxin B has no permeabilizing effect on the mycobacterial cell wall, but it depolarizes the plasma membrane of M. smegmatis. Multidrug resistance pump inhibitor chlorpromazine increases the efficacy of ampicillin against M. smegmatis and has a depolarizing effect on mycobacterial plasma membrane. New potential multidrug resistance pump inhibitors have no effect on M. smegmatis sensitivity to ampicillin, however some of the compounds interacted with TPP+ efflux pumps.

A Glicoproteína P (Pgp), produto do gene MDR1 (ABCB1), é um transportador de efluxo que age sobre uma grande variedade de substratos e constitui um mecanismo de proteção do organismo contra xenobióticos. O gene MDR1 apresenta um grande número de polimorfismos e um número cada vez maior de estudos mostra que alguns destes podem afetar a expressão e atividade da Pgp, além de apresentarem implicações no desenvolvimento e susceptibilidade a algumas doenças e também na resposta a tratamento farmacológico. No entanto, ainda existem controvérsias. A Pgp tem sido estudada em algumas doenças autoimunes, como lupus eritematoso sistêmico (SLE), onde foi detectado aumento de atividade deste transportador. Neste trabalho, os polimorfismos C1236T, G2677T/A e C3435T foram analisados em uma amostra de Brasileiros de origem Européia e em uma amostra de pacientes com SLE. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significantes entre as duas amostras quanto às distribuições alélicas e genotípicas destes polimorfismos. Foi observada uma maior freqüência do alelo 3435C em pacientes afrodescendentes em relação aos eurodescendentes. A análise de características clínicas mostrou que (1) pacientes com eritema malar apresentaram menor freqüência do alelo 2677A em comparação com pacientes sem eritema malar; e (2) pacientes com pleurite apresentam maior freqüência do alelo 2677A e do genótipo 2677TA em comparação com aqueles sem pleurite. Estes dados indicam um possível envolvimento destes polimorfismos na resposta imunológica, especialmente do alelo 2677A, uma vez que eritema malar e pleurite envolvem respostas imunológicas contrastantes, respectivamente, tipos Th2 e Th1. / P-glycoprotein (Pgp), the MDR1 (ABCB1) gene product, is an efflux pump that transports a huge variety of substrates and is a mechanism of xenobiotic protection. MDR1 gene presents a great number of polymorphisms and an increasing number of studies show that some of those may affect Pgp expression and activity, besides affecting the development and susceptibility of diseases and pharmacological response. However, there are still controversies. Pgp has been studied in some autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), where high activity of this transporter was detected. In the present work, C1236T, G2677T/A, and C3435T polymorphisms were analyzed in a sample of Brazilian individuals with European ancestry and in a sample of SLE patients. No statistically significant differences were detected between these samples concerning allelic or genotypic frequencies of these polymorphisms. It was observed a higher frequency of the 3435T allele in patients with African ancestry than in patients with European ancestry. Clinical characteristics analysis showed that (1) patients developing malar rash presented lower frequency of the 2677A allele than patients without malar rash; and (2) patients with pleuritis presented higher frequency of the 2677A allele and 2677TA genotype in comparison with those without pleuritis. These data indicate possible involvement of these polymorphisms in immunological response, specially the 2677A allele, as rash malar and pleuritis are consequence of contrasting immune responses, respectively, Th2 and Th1 types.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ivan_junior_ipec_dout_2013.pdf: 1028310 bytes, checksum: dff45af1d04ca95b16081c45df029842 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O regime de tratamento com múltiplas drogas é correspondente a uma interação de drogas que pode causar efeitos adversos e falha no tratamento. Essa interação pode gerar modificações funcionais dos transportadores de membrana e por consequência a biodisponibilidade das drogas durante o tratamento. Dentre os transportadores de drogas transmembranares está a glicoproteína-P (P-gp), uma proteína de 170KD, produto do gene MDR1, caracterizada como uma \201CATP Binding cassete\201D (ABC). Seu papel está muito bem definido nas células neoplásicas multirresistentes a drogas, assim como sua relação com as drogas para o tratamento da infecção pelo HIV. Entretanto, pouco tem sido estudado sobre esta bomba de efluxo na tuberculose multirresistente (TBMR). Neste estudo analisamos por citometria de fluxo sua expressão e atividade de efluxo nos monócitos, principal célula relacionada com a tuberculose e também em linfócitos e granulócitos do sangue periférico por meio da citometria de fluxo. A taxa de efluxo foi medida através do uso da Rodamina 123 (Rho123) e a expressão da P-gp através do anticorpo monoclonal anti-CD243 (clone UIC2). A utilização direta do sangue total para a determinação da atividade de efluxo por citometria de fluxo caracterizou a implantação de uma nova ferramenta de análise para a pesquisa A análise contemplou 52% do total de pacientes em tratamento de TBMR no ambulatório do Laboratório de Pesquisa em Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Para as análises foram levadas em consideração a idade, cor da pele, o tempo de tratamento e a quantidade de drogas administradas. O estudo revelou que há correlação entre a expressão da P-gp nos monócitos e a idade dos pacientes (P<0,01). Diferenças entre pacientes brancos e não brancos também foram observadas. Em linfócitos a expressão de P-gp quando aumentada foi diretamente proporcional à atividade de efluxo observada nos monócitos (P< 0,05). Além disso, pacientes submetidos ao tratamento para TBMR por até seis meses apresentaram uma maior expressão de P-gp e, linfócitos quando comparados àqueles que receberam o tratamento por mais de seis meses (P<0,01) / When two or more drugs are administrated, such interactions can cause additive, synergistic or antagonistic effects. The drug transporters may undergo treatments effects and therefore change the dr ugs bioavailability during the treatment and can cause treatment failure. Among the know n drug transporters there is transmembrane P - glycoprotein (P - gp). It is a 170 KDa transmem brane protein w h ich is a product of multidrug resistance MDR1 gene. This protein is a well - characterized ABC transporter ( ATP Binding Cassette ) and is responsible for efflux of the chemotherapeutic agents from resistant cancer cells. There are few studies about this protein in multidrug - resistant tuberculosis (MDR - TB) . In this study, P - gp expression and activity were detect by flow cytometry in monocytes, the main cell related with the M.tuberculosis infection , as well as in lymphocytes and granulocytes from whole peripheral blood . P - gp mediated efflux was determined indirectly by measuring the retention of a fluorescent P - gp substrate, rhodamine 123 ( Rho123) . P - gp expression was assessed using anti - P - gp monoclonal antibody UIC2 (CD243 ). The efflux activ ity with whole blood using flow cytometry technique as a new tool to pharmacogenetic research was developed in this study. We analyzed 52 % of outpatient in MDR - TB treatment from Laboratory Research Mycobacteriosis Institute Evandro Chagas Clinical Researc h (IPEC). We considered variables as age, race, treatment time, amount of drug administered at the time of blood collection and their correlation with P - gp expression and activity. The result revealed a correlation between the P - gp expression in monocytes and ag e ( P < 0 .01). In addition, difference between white and nonwhite patients was observed . Lymphocyte P - gp expression was statistically significant greater in patients w ith increased monocytes efflux activity evidenced by P - gp inhibition with CSA ( P < 0 .0 5 ). P atients undergoing MDR - TB treatment for six months had a higher P - gp expression in lymphocytes compared to those who received the treatment for more than six months ( P < 0 .01).

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 3 mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf.txt: 155225 bytes, checksum: a4a9286f9502f99361f8f66b55758259 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) mariana_santos_ioc_mest_2015.pdf: 2485159 bytes, checksum: 4635cdb126d5d6a4d6de189df627fe73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Teresina, PI, Brasil / Nas infecções causadas pelo gênero Mycobacterium identificar a espécie é importante para distinguir entre as cepas e agrupá-las por critérios de interesse para microbiologistas e clínicos, influenciando inclusive no esquema de tratamento a ser aplicado. Segundo a World Health Organization, em 2014 a tuberculose atingiu o mesmo patamar que a infecção por HIV (Human Immunodeficiency Virus) em relação à mortalidade. Por outro lado, as micobacterioses por micobactérias não tuberculosas (MNT) vêm aumentando, mas como não é de notificação compulsória, pouco se sabe da diversidade de espécies que acometem os pacientes no estado do Piauí. Assim, o presente estudo teve como objetivo, estimar a frequência de infecção por Complexo Mycobacterium tuberculosis e MNT, correlacionar os métodos microbiológios e moleculares utilizados na sua identificação e descrever o perfil de sensibilidade a tuberculostáticos nas amostras de M. tuberculosis, isoladas de pacientes referenciados ao Laboratório Central de Saúde Pública do Piauí (LACEN-PI) no período de janeiro 2014 a março de 2015. Para tal, foi realizado estudo descritivo transversal em 142 espécimes clínicos de pacientes, correspondendo a 20,1% dos casos suspeitos enviados ao LACEN-PI. Na maioria dos casos a espécie M. tuberculosis foi identificada (69,7%; 99/142) e em 9,9% (14/142) foram isoladas MNT. O restante dos casos (20,4%; 29/142) não foi possível fazer o diagnóstico definitivo. As espécies de micobactérias não tuberculosas identificadas foram M. abscessus (3,5%); M. avium (1,4%), M. intracelullare (1,4%), M. asiaticum (0,7%), M.szulgai (0,7%) e M. kansasii (0,7%), e maioria dos casos era do sexo masculino (63,4%; 9/14) e apenas 1/64 (1,6%) era HIV positivo Comparando os métodos laboratoriais utilizados na identificação de M. tuberculosis foi evidenciado 100% de concordância entre a plataforma automatizada geneXpert (Xpert MTB/ RIF) e o cultivo microbiológico in vitro, em 56 espécimes de pacientes com pneumopatia pulmonar. A frequência de amostras resistentes às drogas testadas foi de 7,8% (5/64), das quais, três eram multidroga resistente e uma extensivamente resistente. Conclui-se que, as infecções por M. tuberculosis foram mais frequentes que as causadas por micobactérias não tuberculosas e a resistência às drogas apresentou-se mais elevada que a taxa mundial (3,3%). As espécies MNT identificadas são potencialmente patogênicas e é importante notar que por questões metodológicas não foi possível confirmar os 20,4% dos suspeitos, portanto, maior atenção deve ser dada na correta coleta dos espécimes clínicos. A utilização da metodologia Xpert na rotina laboratorial, comparada a metodologias microbiológicas, demonstrou alta sensiblidade e especificidade na detecção de resistência à rifampicina e rapidez na produção do resultado / Abstract: In infections caused by Mycobacterium genus identify the species is important to distinguish between strains and group them by criteria of interest to microbiologists and clinicians, including influencing the treatment regimen to be applied. According to the World Health Organization, in 2014 TB reaches an equal footing that of the HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection on mortality. On the other hand, mycobacteriosis by nontuberculous mycobacteria (NTM) has increased, however as it is not of mandatory notification and little is known about the diversity of species that affect patients in the state of Piaui. The present study aimed to estimate the frequency of Mycobacterium tuberculosis and NTM infections, correlate the microbiological and molecular methods used to identify them and describe the sensibility profile of the TB drugs in M. tuberculosis samples isolated from patients referred to t the Piaui State Public Health Central Laboratory (LACEN-PI), from January 2014 to March 2015. To this end, a cross-sectional descriptive study was performed on 142 clinical specimens of patients, corresponding to 20.1% of suspected cases submitted to LACEN-PI. In most cases the species M. tuberculosis was identified (69.7%, 99/142) and 9.9% (14/142) were isolated NTM. In the remaining cases (20.4%; 29/142) it was not possible to make a conclusive diagnosis. The nontuberculous mycobacteria species identified were M. abscessus (3.5%); M. avium (1.4%), M. intracelullare (1.4%), M. asiaticum (0.7%), M. szulgai (0.7%) and M. kansasii (0.7%) in most of the cases the subjects were male (63.4%; 9/14) and only 1/64 (1.6%) were HIV positive. Comparing the laboratory methods used in the identification of M. tuberculosis 100% agreement was evidenced between the automated platform GeneXpert (Xpert MTB/RIF) and the microbiological culture in vitro, in 56 specimens of patients with pulmonary pneumonitis The frequency of strains resistant to the tested drugs was 7.8% (5/64), of which three were multidrug-resistant and one was extensively drug-resistant. In conclusion, the M. tuberculosis infections were more frequent than those caused by nontuberculous mycobacteria and drug resistance was found to be higher than the global rate (3.3%). The identified NTM species are potentially pathogenic and it is important to note that for methodological issues 20.4% of the suspects could not be confirmed, therefore, greater attention should be paid to the correct collection of clinical specimens. The use of the Xpert method in laboratory routine compared to microbiological methods showed high sensibility and specificity to the detection of rifampicin resistance and speed in the result production

A Glicoproteína P (Pgp), produto do gene MDR1 (ABCB1), é um transportador de efluxo que age sobre uma grande variedade de substratos e constitui um mecanismo de proteção do organismo contra xenobióticos. O gene MDR1 apresenta um grande número de polimorfismos e um número cada vez maior de estudos mostra que alguns destes podem afetar a expressão e atividade da Pgp, além de apresentarem implicações no desenvolvimento e susceptibilidade a algumas doenças e também na resposta a tratamento farmacológico. No entanto, ainda existem controvérsias. A Pgp tem sido estudada em algumas doenças autoimunes, como lupus eritematoso sistêmico (SLE), onde foi detectado aumento de atividade deste transportador. Neste trabalho, os polimorfismos C1236T, G2677T/A e C3435T foram analisados em uma amostra de Brasileiros de origem Européia e em uma amostra de pacientes com SLE. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significantes entre as duas amostras quanto às distribuições alélicas e genotípicas destes polimorfismos. Foi observada uma maior freqüência do alelo 3435C em pacientes afrodescendentes em relação aos eurodescendentes. A análise de características clínicas mostrou que (1) pacientes com eritema malar apresentaram menor freqüência do alelo 2677A em comparação com pacientes sem eritema malar; e (2) pacientes com pleurite apresentam maior freqüência do alelo 2677A e do genótipo 2677TA em comparação com aqueles sem pleurite. Estes dados indicam um possível envolvimento destes polimorfismos na resposta imunológica, especialmente do alelo 2677A, uma vez que eritema malar e pleurite envolvem respostas imunológicas contrastantes, respectivamente, tipos Th2 e Th1. / P-glycoprotein (Pgp), the MDR1 (ABCB1) gene product, is an efflux pump that transports a huge variety of substrates and is a mechanism of xenobiotic protection. MDR1 gene presents a great number of polymorphisms and an increasing number of studies show that some of those may affect Pgp expression and activity, besides affecting the development and susceptibility of diseases and pharmacological response. However, there are still controversies. Pgp has been studied in some autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), where high activity of this transporter was detected. In the present work, C1236T, G2677T/A, and C3435T polymorphisms were analyzed in a sample of Brazilian individuals with European ancestry and in a sample of SLE patients. No statistically significant differences were detected between these samples concerning allelic or genotypic frequencies of these polymorphisms. It was observed a higher frequency of the 3435T allele in patients with African ancestry than in patients with European ancestry. Clinical characteristics analysis showed that (1) patients developing malar rash presented lower frequency of the 2677A allele than patients without malar rash; and (2) patients with pleuritis presented higher frequency of the 2677A allele and 2677TA genotype in comparison with those without pleuritis. These data indicate possible involvement of these polymorphisms in immunological response, specially the 2677A allele, as rash malar and pleuritis are consequence of contrasting immune responses, respectively, Th2 and Th1 types.

A Glicoproteína P (Pgp), produto do gene MDR1 (ABCB1), é um transportador de efluxo que age sobre uma grande variedade de substratos e constitui um mecanismo de proteção do organismo contra xenobióticos. O gene MDR1 apresenta um grande número de polimorfismos e um número cada vez maior de estudos mostra que alguns destes podem afetar a expressão e atividade da Pgp, além de apresentarem implicações no desenvolvimento e susceptibilidade a algumas doenças e também na resposta a tratamento farmacológico. No entanto, ainda existem controvérsias. A Pgp tem sido estudada em algumas doenças autoimunes, como lupus eritematoso sistêmico (SLE), onde foi detectado aumento de atividade deste transportador. Neste trabalho, os polimorfismos C1236T, G2677T/A e C3435T foram analisados em uma amostra de Brasileiros de origem Européia e em uma amostra de pacientes com SLE. Não foram detectadas diferenças estatisticamente significantes entre as duas amostras quanto às distribuições alélicas e genotípicas destes polimorfismos. Foi observada uma maior freqüência do alelo 3435C em pacientes afrodescendentes em relação aos eurodescendentes. A análise de características clínicas mostrou que (1) pacientes com eritema malar apresentaram menor freqüência do alelo 2677A em comparação com pacientes sem eritema malar; e (2) pacientes com pleurite apresentam maior freqüência do alelo 2677A e do genótipo 2677TA em comparação com aqueles sem pleurite. Estes dados indicam um possível envolvimento destes polimorfismos na resposta imunológica, especialmente do alelo 2677A, uma vez que eritema malar e pleurite envolvem respostas imunológicas contrastantes, respectivamente, tipos Th2 e Th1. / P-glycoprotein (Pgp), the MDR1 (ABCB1) gene product, is an efflux pump that transports a huge variety of substrates and is a mechanism of xenobiotic protection. MDR1 gene presents a great number of polymorphisms and an increasing number of studies show that some of those may affect Pgp expression and activity, besides affecting the development and susceptibility of diseases and pharmacological response. However, there are still controversies. Pgp has been studied in some autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), where high activity of this transporter was detected. In the present work, C1236T, G2677T/A, and C3435T polymorphisms were analyzed in a sample of Brazilian individuals with European ancestry and in a sample of SLE patients. No statistically significant differences were detected between these samples concerning allelic or genotypic frequencies of these polymorphisms. It was observed a higher frequency of the 3435T allele in patients with African ancestry than in patients with European ancestry. Clinical characteristics analysis showed that (1) patients developing malar rash presented lower frequency of the 2677A allele than patients without malar rash; and (2) patients with pleuritis presented higher frequency of the 2677A allele and 2677TA genotype in comparison with those without pleuritis. These data indicate possible involvement of these polymorphisms in immunological response, specially the 2677A allele, as rash malar and pleuritis are consequence of contrasting immune responses, respectively, Th2 and Th1 types.

Após o surgimento e disseminação das &#946;-lactamases de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenemeertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha devido à estabilidade apresentada contra estas enzimas. A desvantagem destes antibióticos é a sua capacidade de induzir resistência aos &#946;-lactâmicos e a outros antibióticos quimicamente não relacionados. O imipenem tem favorecido a indução de cefalosporinases cromossômicas (AmpC) e também tem sido relacionado, in vivo, com a seleção de mecanismos intrínsecos de resistência, contribuindo com o perfil multi -droga resistente (MDR). Esse perfil é freqüentemente associado à diminuição da permeabilidade por alteração na síntese de porinas em conjunto com um aumento da atividade de bombas de efluxo, as quais não permitem o estabelecimento de uma concentração ativa do antibiótico no interior da célula bacteriana. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o estabelecimento do perfil MDR em enterobactérias provenientes de isolados clínicos em função da exposição a diferentes concentrações de imipenemin vitro. A seleção do grupo das amostras estudadas foi feito por meio da determinação do perfil de sensibilidade dos isolados, tipagem molecular e ensaio de hidrólise de Imipenem. Nos isolados selecionados para a indução foi realizada numa etapa inicial (etapa basal) a análise de porinas de membrana externa por SDS-PAGE e o estudo de genes codificadores de &#946;-lactamases pela técnica de PCR. O estudo do estabelecimento do perfil MDR foi feito por meio de passagens sucessivas das amostras em meio contendo concentrações sub-inibitórias de imipenem seguido de análise fenotípica (CIM e acúmulo do antibiótico intracelular e SDS-PAGE), e a análise da expressão gênica de genes associados a permeabilidade de membrana (ompC, ompF eAcrA) e genes reguladores(marA e ompR). Após a indução com o imipenem, 77% dos isolados induzidos aumentaram a CIM para os carbapenêmicos, mudando assim o perfil de resistência observado na etapa basal Também foi afetado o perfil de resistência para outros antibióticos não relacionados a &#946;-lactámicos, porém numa percentagem menor. Com relação à alteração da permeabilidade, a perda de porina foi observada apenas para um isolado, no entanto a diminuição na expressão gênica de Omp36 foi significativa desde o começo da indução. A expressão da bomba de efluxoAcrAB foi afetada pela indução com imipenem, aumentando significativamente a expressão de AcrA, enquanto os reguladores estudados, MarA e OmpR tiveram a sua expressão induzida pelo imipenem. Foi possível observar também associação do nível de expressão gênica do regulador MarA com a expressão de AcrA,porém não foi possível observar uma associação estatisticamente significativa deste regulador com o perfil de expressão de OMPs. A indução de OmpR foi associado com um aumento da expressão de RNAm de Omp35, já para Omp36 foi possível observar apenas uma tendência na repressão deste gene. O estudo da resposta destes genes reguladores e determinantes de resistência, em resposta à exposição ao com o imipenem in vitro, permitiu reportar o comportamento molecular da bactéria numa resposta adaptativa no estagio inicial do estabelecimento do fenótipo MDR. A utilização de isolados clínicos com diversos determinantes de resistência permitiu observar a variabilidade nas respostas adaptativas das enterobacterias, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de adaptação da bactéria e sua contribuição na falha terapêutica. / After emergence and broad dissemination of extended spectrum &#946;-lactamases into the Enterobacteriaceae family, the carbapenemic antibiotics (imipenem, meropenem and ertapenem) have been considered the chosen therapy in the treatment of nosocomial infections by the stability that these antibiotics show to these enzymes. The disadvantage of carbapenems is theirs capacity to induce resistance against &#946;-lactamics and to other chemically unrelated antibiotics. The imipenem has been shown to induce chromosomal cephalosporinases (AmpC) and it was also related, in vivo, with the selection of intrinsic mechanism leading to multi-drug resistance profile (MDR). This profile is usually associated with membrane impermeability due to reduced outer membrane porin synthesis with an incremented activity of efflux pumps, which results in a reduced concentration of antibiotics inside the bacteria. This study aimed to evaluate the establishment of the MDR profile in Enterobacteriaceae from clinical isolates by exposure to different concentrations of imipenem in vitro. The selection of the study group was performed by determination of antibiotic susceptibility profile,molecular typing and hydrolysis assay of imipenem. In the selected isolates submitted to induction, in an initial step (baseline), was performed the outer membrane porin analysis by SDS-PAGE and the gene-specific amplification of B-lactamase enzymes by PCR. The study of the establishment of MDR was performed by progressive passages with subclinical concentrations of imipenem, followed each one by the evaluation of phenotypic profile (MIC, accumulation antibiotic in celland SDS-PAGE) and gene expression analysisof genes related to membrane permeability (ompC, ompF and acrA) and regulatory genes(MarA and ompR). After induction with imipenem, 77 % of the isolates increased the MIC for the carbapenems, changing the resistance profile at the baseline. In a lesser percentage, the resistance profile to other &#946;-lactams-unrelated antibiotics was also affected. Loss of porin was observed only for an isolated, however a significantly decreased Omp36 mRNA expression was observed from the start of induction. The expression of the efflux pump AcrAB ,was also affected by the imipenem induction, significantly increasing the AcrA gene expression, whereas the studied regulatory genes,MarA and OmpR,were induced by the imipenem. It was also possible to observe an association between the expression of the regulator MarA and the expression of AcrA, nevertheless no association was observed between this regulator and OMPs . OmpR induction was associated with an increased Omp35mRNA expression, however only a trend for the repression of Omp36was observed. The study of the response of these regulatory genes and genetic determinants of resistance, in response to the imipenem exposure in vitro, allowed to report the molecular behavior of the bacteria in an adaptive response in the initial stage of the establishment of a MDR phenotype. The use of clinical isolates with diverse resistance determinants allowed observing the variability in adaptive responses in enterobacteria, which is important to understand the adaptive mechanisms of bacteria to this antibiotic, the involvement in the emergence of the MDR profile and its contribution to the treatment failure.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Forensic DNA phenotyping is an up and coming area in forensic DNA analyses that enables the prediction of physical appearance of an individual from DNA left at a crime scene. At present, there has been substantial work performed in understanding what genes/markers are required to produce a reliable prediction of categorical eye and hair color from the DNA of an individual of interest. These pigmentation markers (variants from HERC2, OCA2, TYR, SLC24A4, SLC45A2, IRF4 to name a few) are at the core of several prediction systems for eye and hair color such as IrisPlex, HIrisPlex, and the Snipper 2.5 suite. The contribution of these markers towards prediction in most cases however, only factors in an independent effect and do not take into account potential interactions or epistasis in the production of the final phenotypic color. Epistasis is a phenomenon that occurs when a gene’s effect relies on the presence of ‘modifier genes’, and can display different effects (enhance/repress a particular color) in genotype combinations rather than individually. In an effort to detect such epistatic interactions and their influence on hair color prediction models, for this current study, 872 individuals were genotyped at 61 associative and predictive pigmentation markers from several diverse population subsets. Individuals were phenotypically evaluated for eye and hair color by three separate independent assessments. Several analyses were performed using statistical approaches such as multifactor dimensionality reduction (MDR) for example, in an effort to detect if there are any SNP- SNP epistatic interactions present that could potentially enhance eye and hair color prediction model performances. The ultimate goal of this study was to assess what SNP-SNP combinations amongst these known pigmentation genes should be included as an additional variable in future prediction models and how much they can potentially enhance overall pigmentation prediction model performance. The second part of the project involved the analyses of several differentially expressed candidate genes between different hair color follicles of the same individual using quantitative Real Time PCR. We looked at 26 different genes identified through a concurrent non-human primate study being performed in the laboratory. The purpose of this study was to gain more insight on the level of differentially expressed mRNA between different hair color follicles within the same human individual. Data generated from this part of the project will act as a pilot study or ‘proof of principle’ on the mRNA expression of several pigmentation associated genes on individual beard hair of varying phenotypic colors. This analysis gives a first glimpse at expression levels that remain constant or differentiate between hairs of the same individual, therefore limiting the contribution of individual variation.

Yes / Objectives: Resistance-associated variants (RAVs) in Rv0678, a regulator of the MmpS5-MmpL5 efflux pump, have been shown to lead to increased MICs of bedaquiline (2- to 8- fold) and clofazimine (2- to 4-fold). The prevalence of these Rv0678 RAVs in clinical isolates and their impact on treatment outcomes are important factors to take into account in bedaquiline treatment guidelines. Methods: Baseline isolates from two bedaquiline MDR-TB clinical trials were sequenced for Rv0678 RAVs and corresponding bedaquiline MICs were determined on 7H11 agar. Rv0678 RAVs were also investigated in non-MDRTB sequences of a population-based cohort. Results: Rv0678 RAVs were identified in 23/347 (6.3%) of MDR-TB baseline isolates. Surprisingly, bedaquiline MICs for these isolates were high (>0.24 mg/L, n¼8), normal (0.03 0.24 mg/L, n¼11) or low(<0.03 mg/L, n¼4). A variant at position 11 in the intergenic region mmpS5–Rv0678 was identified in 39 isolates (11.3%) and appeared to increase the susceptibility to bedaquiline. In non-MDR-TB isolates, the frequency of Rv0678 RAVs was lower (6/ 852 or 0.7%). Competition experiments suggested that rifampicin was not the drug selecting for Rv0678 RAVs. Conclusions: RAVs in Rv0678 occur more frequently in MDR-TB patients than previously anticipated, are not associated with prior use of bedaquiline or clofazimine, and in the majority of cases do not lead to bedaquiline MICs above the provisional breakpoint (0.24mg/L). Their origin remains unknown. Given the variety of RAVs in Rv0678 and their variable effects on the MIC, only phenotypic drug-susceptibility methods can currently be used to assess bedaquiline susceptibility. / This work was supported by Janssen Pharmaceutica. N. C. was supported by a Baekeland PhD scholarship from the Flemish Institute for Scientific Technology (IWT 130308, Belgium). C. J. M., L. R. and B. d. J. were supported by a European Research Council Starting Grant INTERRUPTB (311725).

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