?rea de concentra??o: Ci?ncias farmac?uticas. / Incluir como ag?ncias financiadoras: Grupo Coimbra das Universidades Brasileiras (GCUB) e Organiza??o dos Estados Americanos (OEA). / Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2018-01-03T17:55:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) Previous issue date: 2017 / O Cerrado mineiro possui muitas esp?cies vegetais utilizadas na medicina popular, dentre elas est?o a Pseudobrickellia brasilensis , a Miconia ferruginata e Ageratum fastigiatum, plantas popularmente usadas como analg?sico, cicatrizante e anti-inflamat?rio. Estudos realizados no Laborat?rio de Imunologia da UFVJM indicaram que extratos destas plantas possuem efeito inibit?rio sobre a ativa??o de linf?citos humanos in vitro. Em virtude disso, e com base em relatos populares sobre uma poss?vel a??o antitumoral, o objetivo principal deste trabalho foi pesquisar se estes extratos apresentariam ou n?o efeito citot?xico sobre a linhagem tumoral Jurkat, utilizando-se concentra??es n?o t?xicas, j? avaliadas sobre c?lulas mononucleares do sangue perif?rico humano (PBMC). Uma vez que os extratos vegetais foram dilu?dos no solvente Dimetilsulf?xido (DMSO), inicialmente investigou-se a concentra??o m?xima de DMSO que n?o alteraria a viabilidade das c?lulas Jurkat ap?s 24, 48 e 72 horas de cultura. O efeito citot?xico dos extratos foi avaliado sobre linf?citos tumorais (Jurkat) e sobre linf?citos humanos de volunt?rios h?gidos pelo m?todo de exclus?o com azul de tripan, com exce??o das culturas tratadas com P.brasilensis, onde a viabilidade foi avaliada por citometria de fluxo. Tamb?m foram calculados os ?ndices de seletividade e percentuais de efic?cia dos extratos com rela??o ao f?rmaco antineopl?sico Paclitaxel. Foi avaliada tamb?m a interfer?ncia desses extratos sobre as fases do ciclo celular das c?lulas Jurkat, bem como os mecanismos de morte envolvidos na a??o citot?xica dos extratos. De acordo com os resultados obtidos, o DMSO n?o apresentou efeito t?xico sobre as c?lulas Jurkat na concentra??o de 1%v/v nos tr?s tempos de incuba??o, sendo esta a concentra??o de solvente utilizada em todos os ensaios realizados. Extratos etan?licos das folhas da P. brasilensis (PBf) a 200?g/mL, das partes a?reas da A. fastigiatum (Afpa) a 50?g/mL e extratos etan?licos e aquosos da M. ferruginata (Mfet, Mfaq) a 125?g/mL mostraram maior toxicidade sobre as c?lulas Jurkat principalmente ap?s 72h de tratamento. O tratamento, por 24h, com extrato Afpa 50 ?g/mL mostrou ser o mais seletivo e eficaz com rela??o aos outros extratos. Foi evidenciado em todos os extratos, que nas maiores concentra??es, ap?s de 24 horas de tratamento, houve uma inibi??o na progress?o da fase G2M do ciclo celular. O extrato das partes a?reas de Ageratum fastigiatum tamb?m produziu uma reten??o dessas c?lulas na fase G0-G1. Todos os extratos induziram a apoptose as c?lulas Jurkat, onde o n?mero de c?lulas em apoptose tardio foi predominante em rela??o aos processos necr?ticos. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / The Cerrado Mineiro has many vegetable species used in folk medicine. Plants like Pseudobrickellia Brasilensis, Miconia ferruginata and Ageratum fastigiatum are widely used as analgesic, healing or anti-inflammatory. Studies carried on the Immunology Laboratory (UFVJM) shown that extracts from these plants has inhibitory effects in the activation of in-vitro-cultured human lymphocytes. In this way, and based on folk stories related with their anti-tumor action, the main objective of this work was research about the cytotoxic effect of this plants on Jurkat tumor line-cell cultures, using as first experiment non-toxic extract concentrations previously proved on peripheral blood mononuclear cells (PBCM). Once the vegetable extracts were diluted in dimetilsulfoxide (DMSO), previously, the maximum DMSO concentration not-altering cell viability was determined after 24, 48 and 72 hours. Cytotoxic effect was studied using the exclusion method with tripam blue on tumor lymphocytes (Jukart) and human lymphocytes, donated by healthy volunteers, except for P.brasilensis treated line cells, for which cell viability was studied by flux cytometer. The selectivity index and extracts efficiency percentage were calculated and related with the antineoplastic Paclitaxel drug. The extracts interference on the Jukart cell cycle phases and the cell death mechanisms related with the cytotoxic activity were evaluated. According to the obtained results, DMSO does not show cytotoxic effects on Jukart cells in 1% (v/v) concentration at the three incubation times, being this the solvent concentration used in all the experiments. Ethanol extracts of P. brasilensis leaves (PBf) at 200?g / mL, aerial parts of A. fastigiatum (Afpa) at 50?g / mL and M. ferruginata aqueous and ethanolic extracts (Mfet, Mfaq) at 125?g / mL showed higher Toxicity on Jurkat cells mainly after 72h of treatment. The 24 h treatment with Afpa at 50 ?g/mL was the most selective and effective in comparison with the other tested extracts. It was evidenced in all extracts, that at the highest concentrations, after 24 hours of treatment, there was an inhibition in the progression of the G2M phase of the cell cycle. The extract of Ageratum fastigiatum aerial parts also produced the G0-G1 phase retention. All extracts induced Jukart cell apoptosis, and cell number on late apoptotic phase predominated on the necrotic ones.

Os corantes ciânicos com dois cromóforos possuem características espectrais e energéticas vantajosas para aplicação em Terapia Fotodinâmica (TFD) do câncer. Entretanto, sua fotoatividade contra neoplasias não foi ainda estudada nem in vivo nem in vitro. Nesta tese apresentamos os resultados dos estudos in vitro dos mecanismos da fotocitotoxicidade dos corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) com ângulos entre os cromóforos = 1800, 1500 e 900 contra células neoplásicas, com a finalidade de avaliar a potencialidade da aplicação dos BCD como fotossensibilizadores (FS) em TFD. Os estudos foram realizados em comparação com o fotossensibilizador Photogem®,que já está sendo aplicado em TFD. Foram estudados o efeito fototóxico, a distribuição intracelular do BCD e a contribuição de apoptose e necrose na morte celular induzida por ele. Além disso, foi realizada a busca da formulação farmacêutica adequada para aplicação tópica do BCD180. Nos estudos da fotocitotoxicidade foram utilizadas as células neoplásicas de melanoma murino B16F10, melanoma humano C8161, adenocarcinoma de colo retal humano HT29, leucemia T humano (Jurkat) e leucemia mielóde aguda humana Hl-60. A citotoxicidade foi estudada em função da dose da irradiação, da concentração do FS e do tempo de incubação das células com FS. Todos os compostos testados apresentaram baixa citotoxicidade no escuro, quando sob irradiação com luz visível (? > 600 nm) sua citotoxicidade aumentou consideravelmente. Observamos que para todos os tipos de células neoplásicas a fotocitotoxicidade dos BCD, depois de atingir seu máximo na variação do tempo de incubação, é igual ou ultrapassa a fotocitotoxicidade do Photogem® nas mesmas condições experimentais. O estudo comparativo do BCD180 e dos BCD150 e BCD90 mostrou que nas mesmas condições experimentais os dois últimos possuem fotocitotoxicidade maior do que o BCD180. O conjunto dos resultados obtidos mostra que os BCD? podem ser considerados promissores FS para TFD do câncer. Os estudos através de microscopia de fluorescência da distribuição intracelular do BCD180 e dos marcadores fluorescentes das mitocôndrias Mitotracker GreenTM e Rodamina 123 e do núcleo 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mostraram que o BCD180 se localiza preferencialmente na região das mitocôndrias. Os mecanismos da morte celular induzida pelo BCD180 foram analisados através do estudo da morfologia das células Jurkat, liberação da fosfatidilserina, liberação do citocromo c, ativação da caspase-3 e do efeito na citotoxicidade do BCD180 da proteína Bcl-2 (inibidor do citocromo c). A análise mostrou que a apoptose é a principal responsável pela morte celular induzida pelo BCD180 no escuro, enquanto que, sob irradiação luminosa, tanto a apoptose quando a necrose contribuem para a morte celular, e a contribuição da necrose aumenta com o aumento da concentração do BCD180 e do tempo de pós-irradiação. A apoptose ocorre, provavelmente, pela via intrínseca ou mitocondrial. Além disso, foram realizados os testes de permeação cutânea do BCD180 utilizando várias formulações farmacológicas e foi determinado que a mistura de 10% de monoleína em propilenoglicol possui melhores características entre todas as formulações testadas. / Cyanine dyes with two chromophores possess vantage spectral and energetic characteristics for application in Photodynamic Therapy (PDT) of cancer. At the same time, their photoactivity against neoplasias was not yet studied neither in vivo, nor in vitro. In this thesis, we present the results of in vitro studies of photocytotoxicity mechanisms of cyanine dyes with two chromophores (BCD) with angles = 180,150 and 90 between chromophores against neoplasic cells, with the objective to evaluate BCD potentiality to be applied as photosensitizers (PS) to Photodynamic Therapy (PDT). The studies were realized in comparison with photosensitizer Photogem®, which is already applied to PDT. The BCD? phototoxic effect, their intracellular distribution and contribution of the apoptosis and necrosis in the cell death induced by BCD were studied. Besides, the search of adequate pharmaceutical formulation for BCD180 topic application was realized. The neoplasic cell lines of melanoma B16F10 in mice, human melanoma C8161, human colon adenocarcinoma HT29, human T-cell leukemia (Jurkat) and human leukemia Hl-60, were used in the study of photocytotoxicity, which was studied as a function of irradiation dose, PS concentration and incubation time of cells with PS. All tested compounds demonstrated low cytotoxicity in the darkness, while under irradiation by visible light (? > 600 nm) their cytotoxicity considerably increased. It was observed that for all types of neoplasic cells BCD photocytotoxicity under the same experimental conditions is equal or exceeds that of Photogem® when reaches the maximum with the incubation time variation. The comparative study of BCD180 with BCD150 and BCD90 demonstrated that under the same experimental conditions two latter compounds possess photocytotoxicity exceeding that of BCD180. A set of the results obtained demonstrates that BCD can be considered as promising PS for PDT of cancer. The study of intracellular distribution of BCD180, and of mitochondria and nucleus fluorescence selective probes Mitotracker GreenTM, Rhodamine 123 and 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) show that BCD180 is mostly localized in the region of mitochondria. The mechanisms of the cell death induced by BCD180 were analyzed in the study of Jurkat cells morphology, phosphatidyl serine and cytochrome c liberation, caspase-3 activation, and by protein Bcl-2 (cytochrome c inhibitor) effect on BCD180 cytotoxicity. The analysis demonstrated that apoptosis is the main responsible for the cell death induced by BCD180 in darkness, while under light irradiation both apoptosis and necrosis contribute to the cell death, and necrosis contribution increases with BCD180 concentration and post-irradiation time.The apoptosis is probably realized by an intrinsic or mitochondrial way. Besides, the tests of BCD180 cutaneum permeation were realized using various pharmacological formulations. It was determined that among all formulations tested, the mixture of 10% of monoleine in propylene glycol possesses the best characteristics.

Os corantes ciânicos com dois cromóforos possuem características espectrais e energéticas vantajosas para aplicação em Terapia Fotodinâmica (TFD) do câncer. Entretanto, sua fotoatividade contra neoplasias não foi ainda estudada nem in vivo nem in vitro. Nesta tese apresentamos os resultados dos estudos in vitro dos mecanismos da fotocitotoxicidade dos corantes ciânicos com dois cromóforos (BCD) com ângulos entre os cromóforos = 1800, 1500 e 900 contra células neoplásicas, com a finalidade de avaliar a potencialidade da aplicação dos BCD como fotossensibilizadores (FS) em TFD. Os estudos foram realizados em comparação com o fotossensibilizador Photogem®,que já está sendo aplicado em TFD. Foram estudados o efeito fototóxico, a distribuição intracelular do BCD e a contribuição de apoptose e necrose na morte celular induzida por ele. Além disso, foi realizada a busca da formulação farmacêutica adequada para aplicação tópica do BCD180. Nos estudos da fotocitotoxicidade foram utilizadas as células neoplásicas de melanoma murino B16F10, melanoma humano C8161, adenocarcinoma de colo retal humano HT29, leucemia T humano (Jurkat) e leucemia mielóde aguda humana Hl-60. A citotoxicidade foi estudada em função da dose da irradiação, da concentração do FS e do tempo de incubação das células com FS. Todos os compostos testados apresentaram baixa citotoxicidade no escuro, quando sob irradiação com luz visível (? > 600 nm) sua citotoxicidade aumentou consideravelmente. Observamos que para todos os tipos de células neoplásicas a fotocitotoxicidade dos BCD, depois de atingir seu máximo na variação do tempo de incubação, é igual ou ultrapassa a fotocitotoxicidade do Photogem® nas mesmas condições experimentais. O estudo comparativo do BCD180 e dos BCD150 e BCD90 mostrou que nas mesmas condições experimentais os dois últimos possuem fotocitotoxicidade maior do que o BCD180. O conjunto dos resultados obtidos mostra que os BCD? podem ser considerados promissores FS para TFD do câncer. Os estudos através de microscopia de fluorescência da distribuição intracelular do BCD180 e dos marcadores fluorescentes das mitocôndrias Mitotracker GreenTM e Rodamina 123 e do núcleo 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mostraram que o BCD180 se localiza preferencialmente na região das mitocôndrias. Os mecanismos da morte celular induzida pelo BCD180 foram analisados através do estudo da morfologia das células Jurkat, liberação da fosfatidilserina, liberação do citocromo c, ativação da caspase-3 e do efeito na citotoxicidade do BCD180 da proteína Bcl-2 (inibidor do citocromo c). A análise mostrou que a apoptose é a principal responsável pela morte celular induzida pelo BCD180 no escuro, enquanto que, sob irradiação luminosa, tanto a apoptose quando a necrose contribuem para a morte celular, e a contribuição da necrose aumenta com o aumento da concentração do BCD180 e do tempo de pós-irradiação. A apoptose ocorre, provavelmente, pela via intrínseca ou mitocondrial. Além disso, foram realizados os testes de permeação cutânea do BCD180 utilizando várias formulações farmacológicas e foi determinado que a mistura de 10% de monoleína em propilenoglicol possui melhores características entre todas as formulações testadas. / Cyanine dyes with two chromophores possess vantage spectral and energetic characteristics for application in Photodynamic Therapy (PDT) of cancer. At the same time, their photoactivity against neoplasias was not yet studied neither in vivo, nor in vitro. In this thesis, we present the results of in vitro studies of photocytotoxicity mechanisms of cyanine dyes with two chromophores (BCD) with angles = 180,150 and 90 between chromophores against neoplasic cells, with the objective to evaluate BCD potentiality to be applied as photosensitizers (PS) to Photodynamic Therapy (PDT). The studies were realized in comparison with photosensitizer Photogem®, which is already applied to PDT. The BCD? phototoxic effect, their intracellular distribution and contribution of the apoptosis and necrosis in the cell death induced by BCD were studied. Besides, the search of adequate pharmaceutical formulation for BCD180 topic application was realized. The neoplasic cell lines of melanoma B16F10 in mice, human melanoma C8161, human colon adenocarcinoma HT29, human T-cell leukemia (Jurkat) and human leukemia Hl-60, were used in the study of photocytotoxicity, which was studied as a function of irradiation dose, PS concentration and incubation time of cells with PS. All tested compounds demonstrated low cytotoxicity in the darkness, while under irradiation by visible light (? > 600 nm) their cytotoxicity considerably increased. It was observed that for all types of neoplasic cells BCD photocytotoxicity under the same experimental conditions is equal or exceeds that of Photogem® when reaches the maximum with the incubation time variation. The comparative study of BCD180 with BCD150 and BCD90 demonstrated that under the same experimental conditions two latter compounds possess photocytotoxicity exceeding that of BCD180. A set of the results obtained demonstrates that BCD can be considered as promising PS for PDT of cancer. The study of intracellular distribution of BCD180, and of mitochondria and nucleus fluorescence selective probes Mitotracker GreenTM, Rhodamine 123 and 4\',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) show that BCD180 is mostly localized in the region of mitochondria. The mechanisms of the cell death induced by BCD180 were analyzed in the study of Jurkat cells morphology, phosphatidyl serine and cytochrome c liberation, caspase-3 activation, and by protein Bcl-2 (cytochrome c inhibitor) effect on BCD180 cytotoxicity. The analysis demonstrated that apoptosis is the main responsible for the cell death induced by BCD180 in darkness, while under light irradiation both apoptosis and necrosis contribute to the cell death, and necrosis contribution increases with BCD180 concentration and post-irradiation time.The apoptosis is probably realized by an intrinsic or mitochondrial way. Besides, the tests of BCD180 cutaneum permeation were realized using various pharmacological formulations. It was determined that among all formulations tested, the mixture of 10% of monoleine in propylene glycol possesses the best characteristics.