Die Meiose ist eine besondere Art der Zellteilung, die während der Keimzellreifung stattfindet. Sie umfasst zwei aufeinander folgende Zellteilungen mit nur einer DNA-Repli-kationsrunde, wodurch aus einer diploiden Ausgangszelle vier haploide Gameten entstehen. In der ersten meiotischen Teilung werden die homologen Chromosomen miteinander rekombiniert und voneinander getrennt, in der Meiose II findet die Trennung der Schwesterchromatiden statt. Für den korrekten Ablauf dieser Prozesse musste sich eine spezielle molekulare Architektur des meiotischen Chromosoms entwickeln welche die Synapse der homologen Chromosomen durch den Synaptonemalkomplex (SC) beinhaltet. SCs sind evolutionär hochkonservierte, meiosespezifische Proteinkomplexe, die eine zentrale Bedeutung für Synapse, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen haben. Ein SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs), die den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert sind, einer zentralen Region (CR) und einem zentralen Element (CE). Eine Hauptstrukturkomponente der LEs in Vertebraten ist das Synaptonemalkomplexprotein, SYCP3. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP3 für die Zusammenlagerung der LE aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP3, exprimiert in somatischen Zellen, erforscht. In diesem experimentellen Ansatz polymerisierte SYCP3 autonom zu stabilen, höher geordneten, filamentösen Strukturen. Die „Coiled-Coil“-Domäne und die flankierenden, evolutionär konservierten Motive sind dabei notwenig, und nach Deletion des weniger konservierten N-terminalen Bereichs auch ausreichend für die Bildung der höher geordneten Strukturen. Der N-Terminus hingegen spielt eine Rolle in der Stabilität der Polymärstrukturen, welche durch Phosphorylierung zweier Serinreste im N-terminalen Bereich beeinflusst werden könnte. Obwohl die Struktur des SC in der Evolution hochkonserviert ist, sind die Protein-komponenten auf Aminosäuresequenzebene sehr unterschiedlich und weisen wenn überhaupt eine strukturelle Homologie in ihrer Domänenorganisation auf. Um den SC-Aufbau und dessen Funktion besser verstehen zu können, wurden die orthologen SC-Proteine zwischen taxonomisch entfernten Spezies Ratte und Medaka verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass trotz der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen die sich in den letzen 450 Millionen Jahren zwischen Fisch- und Säugern-SYCP3 akkumuliert haben, die Eigenschaften der Proteine vergleichbar sind, und das sie unter experimentellen Bedingungen miteinander interagieren und zu höher geordneten Strukturen kopolymerisieren können. / Meiosis is a germ line specific, special type of cell division which creates haploid daughter cells from a diploid cell in a manner that ensures each daughter cell a complete haploid genome. A meiotic cell undergoes two cell divisions without an intervening DNA replication step. In the first meiotic division the homologous chromosomes get separated and recombination takes place, while the sister chromatids remain associated until the second meiotic division. To align the homologue chromosomes in meiotic prophase I, a specialized structure has evolved the so called synaptonemal complex (SC). SCs are meiosis-specific nuclear structures that are critically involved in synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. SYCP3 is a major determinant of axial/lateral element assembly of the mammalian SC. To investigate the contribution of SYCP3 in the assembly of axial/lateral elements, I studied SYCP3 polymerization in a heterologous system where SC proteins are not expressed normally. Under these experimental conditions SYCP3 on its own can form higher order structures that, like SCs, are largely resistant to harsh cell fractionation procedures. I also obtained compelling evidence that the SYCP3 coiled-coil domain together with two flanking, evolutionary conserved motifs (CM) are necessary and also sufficient for higher order structure assembly. Notably, most of the SYCP3 N-terminus appears to be dispensable for polymerization, but plays a key role in the stability of polymer structure. I show that two N-terminal serine residues at positions 32 and 35 are crucial. Their mutation to glutamate residues, whereby phosphate charges are mimicked, leads to the formation of altered higher order structures showing a significantly reduced binding strength. The results are compatible with the notion that SYCP3 provides mechanical stability to SC axial/lateral elements that can be regulated by phosphorylation events. Although the SC structure is conserved in evolution this is not the case for its protein components. To provide information on SC proteins which would be important for our understanding of the conserved SC structure and function, here I compared ortholog SYCP3 proteins of two evolutionary distant vertebrate species, namely rat and medaka fish. To this end I have investigated the polymerization properties of both proteins by immunocytochemistry, electron microscopy and cell fractionation. I found that despite of the sequence differences that have accumulated over the last 450 million years mammalian and fish SYCP3 have similar properties that allow them to co-assemble higher order structures under experimental conditions.

Meiosis is the specialised cell division which produces haploid germ cells, capable of developing into fertile gametes, from diploid progenitor cells. During meiosis, chromosomes undergo strictly regulated and strongly conserved dynamic processes, at the beginning of which the telomeres are actively tethered and intimately attached to the nuclear envelope (NE). The attached telomeres are then moved within the NE through cytoskeletal forces to cluster within a restricted region, forming the highly conserved bouquet stage. Subsequently, the bouquet is released simultaneously to the completion of the synaptonemal complex assembly tightly linking homologous chromosome pairs together. In combination these processes are essential for the successful completion of meiosis. Because the meiotic NE serves as a platform for telomere attachment and movement it can be assumed to be critically involved in these events crucial for fertility. However, the precise roles of many meiotic NE proteins in the attachment and movement of telomeres still remain elusive. Therefore, it was the aim of this thesis to investigate the functions of two mammalian meiotic NE components in telomere attachment and dynamics. The first part of this thesis is concerned with the meiosis-specific lamin C2. Lamin C2 is the only A-type lamin expressed during meiosis and has in previous studies shown to feature altered meiosis-specific properties, clearly distinguishing it from somatic lamins. Because lamin C2 is enriched at sites of telomere attachment, exhibits a high mobility within the nuclear lamina and influences NE integrity, it has been postulated that it may locally increase NE flexibility to allow efficient meiotic telomere movement. Therefore, possible functions of lamin C2 in the movement of attached telomeres were investigated in this thesis by studying the bouquet formation and release of pubertal mice specifically lacking lamin C2. This revealed that lamin C2 deficient mice show a delayed bouquet release, leading to severe defects in the synaptic pairing of homologous chromosomes, which in turn results in infertility of the males. Therefore, the efficient repositioning of attached meiotic telomeres, facilitated by lamin C2, seems essential for completing meiosis. The second part of this thesis focuses on the protein complex responsible for the attachment of meiotic telomeres to the NE and their coupling to the cytoskeleton. The so-called LINC complex is composed of SUN domain proteins in the inner nuclear membrane interacting with KASH domain proteins of the outer nuclear membrane. In previous studies it had been shown that SUN1, SUN2 and KASH5 localise to the attached meiotic telomeres. Regarding the meiotic role of SUN2, however, contradicting results have recently been discussed, showing the need for further investigations. Using an available SUN1 deficient mouse strain, this thesis was able to show that SUN2 is sufficient for telomere attachment per se although telomere attachment is impaired in SUN1 deficient mice leading to infertility. It is also demonstrated that SUN2 forms a functional LINC complex together with KASH5 to mediate this telomere attachment. This LINC complex in the absence of SUN1 is able to move attached telomeres into a bouquet-like cluster formation. Therefore, this demonstrates that SUN2 is involved in the functional attachment and movement of meiotic telomeres. In summary, this thesis has shown SUN2 and the meiotic nuclear lamina to be directly involved in or essential for the highly conserved attachment and movement of telomeres, making them critical for a successful meiosis. The meiotic NE is therefore in this thesis demonstrated to be a determinant of mammalian fertility. / Die Meiose, eine spezialisierte Zellteilung, produziert aus diploiden Vorläuferzellen haploide Keimzellen, welche sich zu befruchtungsfähigen Gameten entwickeln können. Chromosomen durchlaufen während der Meiose stark regulierte, evolutionär hochkonservierte Bewegungen. Zunächst werden die Telomere aktiv und stabil an der Kernhülle verankert. Angeheftete Telomere werden durch das Cytoskelett entlang der Kernhülle bewegt um sich in einer begrenzten Region anzureichern und das chromosomale Bouquet bilden. Das Bouquet wird durch gerichtete Telomerbewegungen anschließend wieder aufgelöst während die finalen Schritte des Zusammenbaus des Synaptonemalkomplexes stattfinden. Diese Prozesse sind in ihrer Summe essentiell für den erfolgreichen Ablauf der Meiose. Da die meiotische Kernhülle als Plattform für die Anheftung und Bewegung der Telomere dient, kann angenommen werden, dass sie in diese für die Fertilität kritischen Prozesse involviert ist. Die genaue Funktion von Kernhüllenproteinen in der Anheftung und Bewegung meiotischer Telomere ist trotzdem zu großen Teilen noch unverstanden. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit zwei Komponenten der meiotische Kernhülle und deren Rolle in Telomeranheftung und –dynamik zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem meiosespezifischen Lamin C2, welches das einzige während der Meiose exprimierte A-typ Lamin ist. Weil Lamin C2 in Bereichen der Telomeranheftung angereichter ist, eine hohe Mobilität in der Kernhülle aufweist und Kernhülleneigenschaften verändern kann, wurde postuliert dass es lokal die Flexibilität der Kernhülle steigern könnte um leichtere Bewegungen der Telomere zu ermöglichen. Demzufolge sollte in dieser Arbeit eine mögliche Rolle von Lamin C2 in der effizienten Bewegung angehefteter Telomere anhand von jungen Lamin C2-defizienten Mäuse untersucht werden. Dies ergab, dass Lamin C2-defiziente Mäuse eine verlangsamte Auflösung des meiotische Bouquets zeigten, was Defekte in der Homologenpaarung verursacht und letztlich zur Infertilität der Männchen führt. Schlussendlich, scheint die effiziente Bewegung angehefteter Telomere, ermöglicht durch Lamin C2, damit essentiell für einen erfolgreichen Ablauf der Meiose. Der zweite Teil dieser Arbeit ist auf einen Proteinkomplex fokussiert welcher für die Anheftung meiotische Telomere und deren Verbindung zum Cytoskelett verantwortlich ist. Dieser LINC complex besteht aus SUN-domänenproteinen der inneren Kernmembran welche mit KASH-domänenproteinen der äußeren Kernmembran interagieren. Aus früheren Studien ist bekannt, dass SUN1, SUN2 und KASH5 an angehefteten Telomeren lokalisieren. Die meiotische Funktion von SUN2, jedoch, wird aktuell anhand widersprüchlicher Ergebnisse diskutiert. Durch die Verwendung SUN1-defizienter Mäuse konnte diese Arbeit zeigen, dass obwohl die partiell unvollständige Telomeranheftung in der Abwesenheit von SUN1 zu Infertilität führt, SUN2 dennoch für Telomeranheftung an sich ausreichend ist. Um diese Anheftung zu vermitteln, bildet SUN2 einen funktionellen LINC complex mit KASH5 welcher angeheftete Telomere in der Abwesenheit von SUN1 in bouquet-ähnliche Konformationen führt. Demzufolge demonstriert diese Arbeit, dass SUN2 an der funktionellen Telomeranheftung und –bewegung beteiligt ist. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass SUN2 und die meiotische Lamina in die hochkonservierte Anheftung und Bewegung von Telomeren direkt involviert oder für sie essentiell sind, und somit unabdingbar für eine erfolgreiche Meiose. Damit definiert diese Arbeit die meiotische Kernhülle als eine Determinante für die Fertilität von Säugern.

During meiosis proteins of the chromosome axis are important for monitoring chromatin structure and condensation, for pairing and segregation of chromosomes, as well as for accurate recombination. They include HORMA-domain proteins, proteins of the DNA repair system, synaptonemal complex (SC) proteins, condensins and cohesins. To understand more about their function in shaping the meiotic chromosome it is crucial to establish a defined model of their molecular architecture. Up to now their molecular organization was analysed using conventional methods, like confocal scanning microscopy (CLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Unfortunately, these techniques are limited either by their resolution power or their localization accuracy. In conclusion, a lot of data on the molecular organization of chromosome axis proteins stays elusive. For this thesis the molecular structure of the murine synaptonemal complex (SC) and the localization of its proteins as well as of three cohesins was analysed with isotropic resolution, providing new insights into their architecture and topography on a nanoscale level. This was done using immunofluorescence labelling in combination with super-resolution microscopy, line profiles and average position determination. The results show that the murine SC has a width of 221.6 nm ± 6.1 nm including a central region (CR) of 148.2 nm ± 2.6 nm. In the CR a multi-layered organization of the central element (CE) proteins was verified by measuring their strand diameters and strand distances and additionally by imaging potential anchoring sites of SYCP1 (synaptonemal complex protein 1) to the lateral elements (LEs). We were able to show that the two LEs proteins SYCP2 and SYCP3 do co-localize alongside their axis and that there is no significant preferential localization towards the inner LE axis of SYCP2. The presented results also predict an orderly organization of murine cohesin complexes (CCs) alongside the chromosome axis in germ cells and support the hypothesis that cohesins in the CR of the SC function independent of CCs. In the end new information on the molecular organization of two main components of the murine chromosome axis were retrieved with nanometer precision and previously unknown details of their molecular architecture and topography were unravelled. / Innerhalb der Meiose sind Proteine der Chromosomenachse wichtig für das Monitoring der Chromatinstruktur und dessen Kondensation, sowie für die Paarung und Trennung der Chromosomen und für eine fehlerfreie Rekombination. Zu diesen Proteinen zählen HORMA-domain Proteine, Proteine des DNA-Reparatur-Systems und des synaptonemalen Komplexes, sowie Kohäsine und Kondesine. Um mehr über ihre Rolle in der Formgebung meiotischer Chromosomen zu erfahren, ist es unabdingbar ein genau definiertes Modell über ihre molekulare Architektur zu erstellen. Bis jetzt wurde ihre molekulare Organisation mit konventionellen Methoden wie dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) und dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) untersucht. Beide Techniken sind jedoch entweder in ihrer Auflösung oder ihrer Lokalisationsgenauigkeit beschränkt, wodurch viele Daten zur molekularen Organisation der Chromosomenachse noch nicht erfasst werden konnten. Die vorliegende Arbeit untersucht mit isotropischer Auflösung die molekulare Struktur des synaptonemalen Komplexes (SC) der Maus und die Lokalisation seiner Proteine, sowie die Lokalisation von drei Kohäsinen, was neue Einsichten in deren Architektur und Topographie auf der nanomolekularen Ebene erbrachte. Dies gelang durch die Verwendung von Immunfluoreszenzmarkierungen in Kombination mit hochauflösender Mikroskopie, Linienprofilen und durchschnittlicher Positionsbestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass der murine SC eine Weite von 221,6 nm ± 6,1 nm besitzt, inklusive einer 148,2 nm ± 2,6 nm weiten zentralen Region (CR). Innerhalb der CR konnte eine mehrschichtige Anordnung der Proteine des zentralen Elements (CE) bestätigt werden. Dies gelang indem ihre Strangdurchmesser und –abstände gemessen worden sind und zusätzlich potentielle Bindestellen von SYCP1 (synaptonemal complex protein 1) an den lateral Elementen des SCs (LEs) abgebildet werden konnten. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die beiden LE Proteine, SYCP2 und SYCP3, kolokalisieren. Dabei zeigte SYCP2 keine präferentielle Lokalisation im inneren Bereich der LE. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine organisierte Anordnung der murinen Kohäsin Komplexe (CCs) entlang der Chromosomenachse in Keimzellen hin und unterstützen die Hypothese, dass Kohäsine innerhalb der CR des SC eine Funktion unabhängig der von CCs haben. Schlussendlich konnten neue Informationen zur molekularen Anordnung von zwei wichtigen Komponenten der murinen Chromosomenachse mit einer Präzision im Nanometerbereich gewonnen werden und bisher nicht bekannte Details ihrer molekularen Architektur und Topographie aufgedeckt werden.

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in engl. Sprache.

Orientador: Cesar Martins / Resumo: As células possuem um conjunto regular de cromossomos denominados cromossomos do complemento A e, eventualmente cromossomos extras a esse complemento. Uma destas classes de elementos extras é denominada de cromossomos B (Bs) e ocorrem em uma ampla diversidade de eucariotos incluindo fungos, plantas e animais. Desde sua descrição, os Bs tem atraído a atenção dos pesquisadores. Para ser classificado com um um cromossomo B, este deve apresentar algumas características como: ter uma morfologia distinta dos cromossomos As, número da cópia pode variar entre os indivíduos que o possuem, muitas vezes são heterocromáticos, não são homólogos ao complemento A, não se pareiam ou se recombinam aos As, e frequentemente exibem herança não-Mendeliana. Os cromossomos B tem sido descritos em diversos vertebrados, incluindo o peixe ciclídeo Astatotilapia latifasciata, natural dos lagos Kyoga e Nawampasa, lagos satélites ao lago Vitória no leste Africano, este ciclídeo possui 44 cromossomos e a presença de 1 a 2 cromossomos B. O objetivo deste trabalho foi investigar o comportamento meiótico dos cromossomos B via imunocoloração com anticorpos específicos contra proteínas do complexo sinaptonêmico, coesinas e modificações de histonas; cruzamentos direcionados entre machos e fêmeas com e sem B; e análise de expressão dos genes synaptonemal complex protein 2-like, mitochondrial cardiolipin hydrolase-like, separin-like, tubulin beta-1 chain-like e kinesin-like. A imunocoloração com os anticorpos H3K... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cells have a regular set of chromosomes known as A chromosomes. However, there are extra chromosomes and one of them is the extra elements called B-chromosomes (Bs) that occurs in a wide variety of eukaryotes including fungi, plants and animals. Since its description, Bs have attracted the attention of the researchers. To be classified as a B, some characteristics must be present such as: distinct morphology of A chromosomes, number of copy can vary between the individuals bearing it, they are often heterochromatic, they are not homologous to the A complement set, they did not pare or recombine with As, and often exhibit non-Mendelian heritage. B chromosomes have been described in several vertebrates, including the cichlid fish Astatotilapia latifasciata, native to Kyoga and Nawampasa lakes, satellite lakes to Victoria lake in East Africa, which has 44 chromosomes and the presence of 1 to 2 B chromosomes. This work aimed to investigate the meiotic behavior of B chromosomes via immunostaining with specific antibodies against synaptonemic complex proteins, coesins and histone modifications; directed crosses between males and females with and without B; and gene expression analysis: synaptonemal complex protein 2-like, mitochondrial cardiolipin hydrolase-like, separin-like, tubulin beta-1 chain-like and kinesin-like. Immunostaining with antibodies H3K27me3 and H3K4me3 showed a global distribution in the pachytene phase. The H3K9ac antibody was dispersed throughout all the re... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Ciências Médicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-29T16:17:27Z No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:00:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:00:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Introdução: A maturação do complexo cumulus-ovócito (CCO) in vitro depende do meio de cultivo no qual se encontra e é uma biotécnica bastante difundida para a geração de embriões bovinos para a produção de gado. A biologia do desenvolvimento do ovócito tem como indicadores a maturação nuclear, esteroidogênese, apoptose e nutrição dos CCOs, tendo as células do cumulus papel central nesses aspectos. A via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-K) tem ações comprovadas nos parâmetros citados, tornando-a ponto relevante no estudo da biologia dos CCOs bovinos. O presente trabalho visa estudar esses parâmetros para esclarecer algumas funções biológicas do meio definido e patenteado MIV B e da adição de 10 ng/mL de FSH. Para inferir a importância da PI3-K foi utilizado o inibidor dessa via (LY294002) durante o cultivo de CCOs. Métodos: Ovário bovinos foram coletados em abatedouros e os CCOs aspirados para cultivo por 22–24 horas. Os seguintes meios-teste foram utilizados, tendo o meio MIV B como base: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY ou 10FSH 100LY. Posteriormente, a dose de 10 μM foi excluída, pois não apresentou nenhum efeito. A androstenediona foi suplementada para sustentar a esteroidogênese. Após o cultivo, os CCOs foram desnudos e as células do cumulus isoladas para as aferições subsequentes. Foram avaliadas a retomada e progressão da maturação nuclear, a expulsão do corpúsculo polar e a produção de hormônios 17 beta-estradiol (E2) e progesterona (P4). As células do cumulus foram analisadas para determinar a expressão de genes, por PCR real time, referentes à esteroidogênese (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1), apoptose (Bax), sobrevida celular (Bcl-2) e nutrição do CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH e SNAP25). Resultados: No meio 0FSH foi encontrado imaturidade nuclear e baixa taxa de expulsão do corpúsculo polar. Porém, manteve a produção de E2 e P4 e a expressão dos receptores de FSH e LH e das enzimas da esteroidogênese, mimetizando a condição de folículo ovariano em crescimento. O meio 0FSH ainda apresenta baixa expressão de Bax, Bcl-2 e GLUT1 e aumento da expressão de G6PDH e SNAP25. A adição do inibidor (meio 0FSH 100LY) causou a progressão da meiose, inibição da expulsão do corpúsculo polar, diminuição de E2 e aumento de P4. O meio inibiu a expressão de LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1. Também houve diminuição da expressão de GLUT4 e G6PDH. No meio 10FSH há retomada e progressão da meiose e expulsão do corpúsculo polar, manutenção da produção de E2 e P4. Houve baixa expressão de LHR, FSHR, CYP19A1 e HSD17B1. Além disso, houve aumento da expressão de GLUT1, G6PDH, Bcl-2 e Bax e baixa expressão de GLUT4 e SNAP25, em relação ao meio 0FSH. A suplementação do inibidor (meio 10FSH 100LY) causou inibição da expulsão do corpúsculo polar e diminuição de E2. Houve aumento da expressão de LHR e CYP19A1, além da diminuição da G6PDH e Bax. O gene PDH não sofreu modificação em nenhum dos tratamentos. SNAP25, GLUT1 e Bcl-2 não foram afetadas pelo LY294002. Conclusões: O meio MIVB 0FSH é capaz de manter a esteroidogênese e a nutrição do CCOs, baseando-se na expressão gênica. A adição de FSH causa diminuição da expressão de genes importantes da esteroidogênese, mas aumenta os de sobrevida e de metabolismo (GLUT1 e G6PDH). Além disso, a via PI3-K tem ações diferentes no meio com e sem FSH. No meio sem FSH, a via mantém a expressão dos genes esteroidogênese e metabolismo (GLUT4 e G6PDH). No meio com FSH, inibe LHR e CYP19A1 e mantém G6PDH e Bax. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The maturation of cumulus oocyte complex (COC) in vitro depends on culture medium environment and it is a widely used biotechnology to produce bovine embryos for livestock production. The developmental biology of oocyte involves nuclear maturation, steroidogenesis, apoptosis and nutrition of COC, with central role of cumulus cells. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) pathway controls the parameters cited previously, making PI3-K pathway relevant for the COC biology. The aim of the present work was to study those parameters to elucidate biology functions of a defined medium MIV B (patent medium of the lab) and the addition of 10 ng/mL of FSH. To infer the PI3-K role, its inhibitor (LY294002) was used in COC culture. Methods: Bovine ovaries were obtained at abattoirs and COC were aspirated for 22– 24 hours of culture. The CCOs were allocated in the following experimental groups, using the MIV B: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY or 10FSH 100LY. After preliminary results the 10 μM of LY294002 were excluded because did not show effect. Androstenedione was supplemented to sustain steroidogenesis. After culture, COC were denuded and cumulus cells were isolated to subsequent evaluations. Resumption and progression of nuclear maturation, polar body extrusion, and steroid hormones final concentration 17 beta-estradiol (E2) and progesterone (P4) were evaluated. The cumulus cells were analyzed to determine gene expression, for PCR real time, of proteins involved in steroidogenesis (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1), apoptosis (Bax), cell survival (Bcl-2), and nutrition of CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH and SNAP25). Results: MIV B 0FSH leads to immature nuclear status and low rates of polar body extrusion. However, the medium maintained the E2 and P4 values in culture media and expression of receptor of FSH and LH and of steroidogenic enzymes, mimetizing a growing ovarian follicle. 0FSH group presented low expression of Bax, Bcl-2 and GLUT1 and high levels of G6PDH and SNAP25. The addition of inhibitor (0FSH 100LY group) caused the meiosis progression, inhibition of polar body extrusion, decrease of E2 and enhance of P4 levels. The medium also decreased the LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1 gene expression. GLUT4 and G6PDH expression were also inhibited by the medium. In the 10FSH medium the levels of resumption and progression of meiosis and polar body extrusion were higher, and E2 and P4 levels were maintained. LHR, FSHR, CYP19A1 and HSD17B1 expression were inhibited. In addition, the expression of GLUT1, G6PDH, Bcl-2 and Bax were stimulated and GLUT4 and SNAP25 were inhibited in comparison to 0FSH. The supplementation of inhibitor (10FSH 100LY group) prevented polar body extrusion and decreased E2 values. There was an increase of LHR and CYP19A1, and decrease of G6PDH and Bax expression. PDH gene expression did not change after culture treatments. SNAP25, GLUT1 and Bcl-2 expression were not affected by the LY294002. Conclusion: In conclusion, the MIV B 0FSH was able to maintain steroidogenesis and the nutrition of COC, based on gene expression. The addition of FSH caused a diminishing of gene expression of steroidogenesis, however improves those related to cell survival and metabolism (GLUT1 and G6PDH). Furthermore, PI3-K pathway demonstrates different action in the medium with and without FSH. The medium without FSH, the pathway maintains steroidogenesis and metabolism (GLUT4 and G6PDH). The medium with FSH inhibits LHR and CYP19A1 and maintains G6PDH and Bax.

Sexually reproducing organisms depend on meiosis for the generation of haploid, genetically diverse gametes to maintain genome stability and the potential to adapt to changing environments. Haploidization is achieved through two successive rounds of cell division after a single initial pre-meiotic DNA replication. Meiosis I segregates the homologous chromosomes, followed by the segregation of the sister chromatids in meiosis II. Genetic diversity is achieved through the process of recombination that de-scribes the exchange of genetic material between the maternal and paternal homolog. Recombination and the initial steps of haploidization are executed already early on in prophase I. Both essential processes depend on a variety of multiprotein complexes, such as the linker of nucleo- and cytoplasm (LINC) complex and the synaptonemal complex (SC). The structure of multiprotein complexes is adjusted according to their function, environment, and the forces they are subjected to. Coiled-coil domains typical in load-bearing proteins characterize the meiotic mechanotransducing LINC complexes. SCs resemble ladder-like structures that are highly conserved amongst eukaryotes, while the primary sequence of the proteins that form the complex display very little if any sequence homology. Despite the apparent significance of the structure to their function, little quantitative and topological data existed on the LINC complexes and the SC within their morphological context prior to the present work. Here, the molecular architecture of the meiotic telomere attachment site where LINC complexes reside and the SC have been analyzed in depth, mainly on the basis of electron microscope tomography derived 3D models complemented by super-resolution light microscopic acquisitions of the respective protein components. / Sich sexuell fortpflanzende Organismen sind auf die Meiose angewiesen, um haploide, genetisch vielfältige Keimzellen zu erzeugen, die die Stabilität des Genoms und die Fähigkeit zur Anpassung an sich verändernde Umgebungen erhalten. Die Haploidisierung wird durch zwei aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung nach einer einzigen anfänglichen prä-meiotischen DNA Replikation erreicht. In der Meiose I werden die homologen Chromosomen getrennt, gefolgt von der Trennung der Schwesterchromatiden während der Meiose II. Genetische Diversität wird durch den Prozess der Rekombination erreicht, der den Austausch von genetischem Material zwischen den mütterlichen und väterlichen Homologen beschreibt. Die Rekombination und die ersten Schritte der Haploidisierung werden bereits früh in der Prophase I durchgeführt. Beide essentiellen Prozesse hängen von einer Vielzahl von Multiproteinkomplexen ab, wie z.B. dem Linker of Nucleo- and Cytoplasm (LINC)-Komplex und dem synaptonemalen Komplex (SC). Die Struktur von Multiproteinkomplexen wird je nach ihrer Funktion, ihrer Umgebung und den Kräften, denen sie ausgesetzt sind, angepasst. Coiled-coil-Domänen, die für tragende Proteine typisch sind, charakterisieren die meiotischen, mechanotransduzierenden LINC-Komplexe. SCs ähneln leiterähnlichen Strukturen, die unter Eukaryonten hoch konserviert sind, während die Primärsequenz der Proteine, die den Komplex bilden, sehr wenig bis gar keine Sequenzhomologie aufweist. Trotz der offensichtlichen Bedeutung der Struktur für ihre Funktion gab es vor der vorliegenden Arbeit nur wenige quantitative und topologische Daten über die LINC Komplexe und den SC in ihrem morphologischen Kontext. Hier wurde die molekulare Architektur der Telomeranheftungsstellen, an denen sich die LINC-Komplexe befinden, und die des SCs eingehend analysiert, hauptsächlich auf der Grundlage von auf der Elektronenmikroskop-Tomographie basierenden 3D-Modellen, ergänzt durch hochauflösende lichtmikroskopische Aufnahmen der jeweiligen Proteinkomponenten.

Während der Spermatogenese finden erstaunliche Differenzierungsprozessen statt. Reguliert wird die Spermatogenese sowohl hormonell als auch durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und der extrazellulärer Matrix. Unterteilt wird die Spermatogenese in drei funktionelle Einheiten. Die Proliferationsphase, die Meiose und die Spermiogenese. Im Laufe der Proliferationsphase gehen aus den Spermatogonien, Spermatocyten hervor, die die Meiose durchlaufen. Während der Prophase I der Meiose kommt es zur Reduktion und Rekombination des genetischen Materials, was mit charakteristischen und höchst dynamischen Bewegungsvorgängen der Telomere einhergeht. Auf die Meiose folgt die Spermiogenese, in der das genetische Material in seine „Transportform“ überführt wird und aus einer stationären, zellverbundenen Einheit ein mobiles autark funktionierendes Vehikel des genetischen Materials wird; das Spermium. Um das Verständnis dieser Vorgänge zu erweitern wurden in dieser Arbeit die Verteilungsmuster einiger Proteine in der Kernhülle von Zellen der Spermatogenese, in Hinblick auf ihre dynamische Umverteilung untersucht. Bei diesen Proteinen handelte es sich um die SUN-Domänen Proteine und das meiosespezifische Lamin C2. Die SUN-Domänen Proteine sind Teil des membrandurchspannenden LINC-Komplexes, der Komponenten des Nukleoplasma mit denen des Cytoplasma verbindet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun2 während der Meiose exprimiert werden, und an den Anheftungsplatten meiotischer Chromosomen lokalisieren und deren dynamisches Verteilungsmuster dem Verteilungsmuster der Telomere während der Prophase I der Meiose entsprechen. Dies deutet darauf hin, dass Sun1 und Sun2 eine tragende Rolle, während der koordinierten Bewegungsprozessen der Prophase I der Meiose spielen. In der Spermiogenese sind die SUN-Domänen Proteine, Sun1 und Sun3 vertreten. Dabei weist deren unterschiedliche Lokalisation an entgegengesetzten Zellpolen darauf hin, dass Sun1 und Sun3 möglicherweise unterschiedliche Funktionen bei der Umgestaltung des Spermienkopfes während der Spermiogenese erfüllen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung einer Mauslinie um die Rolle von Lamin C2 in der Meiose untersuchen zu können. Hierzu wurde eine Lamin C2 Knock-out Studie begonnen. In ersten Untersuchungen der knock-out Tiere konnte eine Größenreduktion der Hoden beobachtet werden. Ebenso konnte ein Abbruch der Meiose vermerkt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass sowohl die SUN-Domänen Proteine, als auch Lamin C2, wichtige Rollen in dem komplexen Arrangement der Spermatogenese übernehmen. / During spermatogenesis amazing differentiation processes take place. Spermatogenesis is regulated by hormones and crosstalk between several cell types and the extra cellular matrix. It can be divided in three functional processes: The proliferation phase, meiosis and spermiogenesis. In the course of the proliferation phase spermatogonia become spermatocytes, which then pass through meiosis. During prophase I of meiosis the reduction and the recombination of the genetic material take place, involving characteristic and highly dynamic movements of meiotic telomeres. Meiosis is followed by spermiogenesis, where the genetic material is converted to its “transport form”, thereby turning a static, tissue associated cell into a mobile, self-sufficient vehicle of the genetic material; the sperm. To expand the knowledge of these processes, the localisation of some proteins of the nuclear envelope of spermatogenetic cells were examined in this work, in order to discover their dynamic distribution pattern. These proteins are the SUN-domain proteins and the meiosis specific lamin C2. The SUN-domain proteins are part of the transmembrane LINC-complex, which connects nucleoplasmic and cytoplasmic components. This work shows, that the SUN-domain proteins Sun1 and Sun2 are expressed during meiosis, that they are located at the attachment sites of the meiotic telomeres, and that their localisation parallels the dynamic movements of the telomeres, which take place in meiotic prophase I. These results indicate that Sun1 and Sun2 play a major role in the coordinated telomere movements during prophase I of meiosis. This work furthermore shows the specific expression of Sun1 and Sun3 during spermiogenesis. Their localisation at opposite poles of the spermatid head indicates discrete functions during the transformation of the sperm head, which takes place in this phase of spermatogenesis. Another focus of this work was the establishment of a lamin C2 knock out mouse line to analyse the role of lamin C2 in meiosis. Analysis of the knock out animals showed a reduction of testis-size in comparison to wild-type mice. Additionaly meiosis was aborted in lamin C2 deficient mice. In summary these results make evident, that the SUN-domain proteins, as well as the meiosis specific lamin C2 play an important role in the complex arrangements of spermiogenesis.

Synaptonemal Komplexe (SC) sind evolutionär konservierte, meiosespezifische, proteinöse Strukturen, die maßgeblich an Synapsis, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen beteiligt sind. Sie zeigen eine dreigliedrige strickleiter-artige Organisation, die sich aus i) zwei Lateralelementen (LE), an die das Chromatin der Homologen angelagert ist, ii) zahlreichen Transversalfilamenten (TF), welche die LE in einer reißverschlussartigen Weise miteinander verknüpfen, und iii) einem zentralen Element (CE) zusammensetzt. Die Hauptproteinkomponenten der Säuger-SC sind das Transversalfilamentprotein SYCP1 und die Lateralelementproteine SYCP2 und SYCP3. Wie sich die SC-Struktur zusammenfügt war bisher nur wenig verstanden; es war nicht bekannt wie die TF innerhalb der LE-Strukturen verankert sind und dabei die homologen Chromosomen verknüpfen. Aufgrund dessen wurde die Interaktion zwischen den Proteinen SYCP1 und SYCP2 untersucht. Mit der Hilfe verschiedenster Interaktionssysteme konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von SYCP1 mit SYCP2 interagieren kann. Aufgrund der Bindungsfähigkeit zu beiden Proteinen, SYCP1 und SYCP3, kann angenommen werden, dass SYCP2 als Linker zwischen diesen Proteinen fungiert und somit möglicherweise das fehlende Bindungsglied zwischen den Lateralelementen und Transversalfilamenten darstellt. Obwohl die SC-Struktur in der Evolution hochkonserviert ist, schien dies nicht für seine Protein-Untereinheiten zuzutreffen. Um die Struktur und Funktion des SC besser verstehen zu können, wurde ein Vergleich zwischen den orthologen SYCP1 Proteinen der evolutionär entfernten Spezies Ratte und Medaka erstellt. Abgesehen von den erheblichen Sequenzunterschieden die sich in 450 Millionen Jahren der Evolution angehäuft haben, traten zwei bisher nicht identifizierte Sequenzmotive hervor, CM1 und CM2, die hochgradig konserviert sind. Anhand dieser Motive konnte in Datenbankanalysen erstmals ein Protein in Hydra vulgaris nachgewiesen werden, bei dem es sich um das orthologe Protein von SYCP1 handeln könnte. Im Vergleich mit dem SYCP1 der Ratte zeigten die Proteine aus Medaka und Hydra, neben den hoch konservierten CM1 und CM2, vergleichbare Domänenorganisationen und im heterologen System zudem sehr ähnliche Polymerisationseigenschaften. Diese Ergebnisse sprechen für eine evolutionäre Konservierung von SYCP1. / Synaptonemal complexes (SCs) are evolutionarily conserved, meiosis-specific proteinaceous structures critically involved in synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. They show a tripartite ladder-like organization including i) two lateral elements (LEs), to which the chromatin of the homologs is attached, ii) numerous transverse filaments (TFs), that link the two lateral elements in a zipper-like way, and iii) a central element (CE). Major protein components of mammalian SCs are the transverse filaments protein SYCP1, and the lateral element proteins SYCP2 and SYCP3. How SCs become assembled was poorly understood; in particular it was not known how TFs assemble at the plane of LEs to interconnect the homologous chromosomes. Therefore, I have investigated possible interactions between SYCP1 and SYCP2. Using different interaction traps, I was able to show that the C-terminus of SYCP1 interacts with SYCP2. Because of its binding to both, SYCP1 and SYCP3, it can be proposed that SYCP2 acts as a linker between these proteins and therefore would be the missing connecting piece between LEs and TFs. Although the SC-structure is conserved in evolution this appears not to be the case for its protein components. For a better understanding of the conserved SC structure und function, I compared ortholog SYCP1 proteins of evolutionary distant species, namely rat and medaka fish. Despite of the sequence-differences that accumulated during 450 million years of evolution, sequence identity was highest at the level of two previously unidentified motifs (CM1 & CM2). Utilizing these motifs in a database analysis a protein of Hydra vulgaris could be found for the first time. It can be proposed that this protein is the orthologous of SYCP1. Besides the highly conserved motifs the proteins of medaka and hydra show quite similar domain organization and polymerization properties in comparison with rat SYCP1. These results suggest an evolutionary conservation of SYCP1.

Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1. / The synaptonemal complex is an evolutionary highly conserved structure. It assembles specifically during prophase I of meiosis and is essential for the segregation of homologous chromosomes and thus represents a major determinant of the genetic diversity of sexually reproducing organisms. The synaptonemal complex is a proteinacious, ladder-like structure. The ladder beams are termed lateral elements and are composed of the meiosis-specific proteins SYCP2 and SYCP3 which are associated with the chromatin of the homologs. The rungs are made up of transverse filaments mainly consisting of the meiosis-specific protein SYCP1. SYCP1 forms parallel homodimers that are anchored via their C-termini to the lateral elements and interact in a head-to-head fashion with an opposing SYCP1 homodimer. For stabilizing this interaction additional proteins are essential. These are components of the so-called central element of the synaptonemal complex: while SYCE1 stabilizes the N-terminal association of opposing SYCP1 homodimers, the two other central element specific proteins SYCE2 and Tex12 connect adjoined SYCP1 filaments and thus elongate the SYCP1 network along the homologs. This process is termed synapsis and is a key feature of meiosis. Errors occurring during this process frequently lead to aneuploidy of the resulting gametes or cause meiotic arrest and infertility. Within the scope of this study a novel protein of the murine synaptonemal complex, we named SYCE3, was characterized. SYCE3 is exclusively expressed during male and female meiosis and is a component of the central element. Its expression pattern resembles that of SYCP1 and SYCE1 and it is able to interact with both of these proteins. Additionally, an interaction between SYCE3 and SYCE2 could be verified. In the context of this dissertation it was found that loading of SYCE3 to the chromosomal axis requires SYCP1. In contrast, chromosome loading of SYCE3 was independent of lateral element assembly and of the presence of the other central element specific proteins, SYCE1, SYCE2 and Tex12. The second thematic complex addressed in this thesis was the relevance of SYCE3 for synapsis and homologous recombination. To this end a Syce3-/- mouse was generated. Syce3-/- mice are infertile and both testes and ovaries are characterized by a significant reduction in size compared to wild-type littermates. Furthermore, depletion of SYCE3 had no influence on the assembly of axial elements and in males alignment of homologs was not affected. However, Syce3-/- oocytes and spermatocytes were unable to initiate synapsis between homologous chromosomes. In addition, homologous recombination was analyzed in the scope of this study and the obtained data strongly points to a central role of SYCE3 during this process: while early (DNA double-strand breaks) and intermediate (transition nodules) recombination events could take place in the absence of SYCE3, structures indicating late recombination events (recombination nodules) and sites of homologous recombination (crossovers) failed to develop. Taken together, this thesis clearly demonstrates that the novel synaptonemal complex protein SYCE3 is essential for fertility in mice. Deletion of Syce3 blocks initiation of synapsis and formation of crossovers. During synaptonemal complex assembly, SYCE3 acts downstream of SYCP1, but upstream of other central element proteins (SYCE1, SYCE2 and Tex12).