Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:36Z : No. of bitstreams: 1 000849664.pdf: 1189084 bytes, checksum: cbc1fe6d442a04c2f695f228e768b010 (MD5) / Em camundongo, estudos recentes demonstraram que o precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) e o seu receptor do tipo 2 (NPR2) são essenciais para a manutenção do bloqueio da meiose I no oócito. Além disso, fatores parácrinos secretados pelo oócito, como a proteína morfogenética óssea (BMP15), podem modular esse bloqueio pelo estímulo da expressão do gene NPR2 nas células do cumulus de camundongos. Em recente estudo na espécie bovina, o fluido folicular bovino (FFb), quando adicionado ao meio de maturação, interferiu na maturação nuclear do oócito e, como resultado, melhorou a produção in vitro de embriões. Contudo, não são conhecidos quais os fatores, presentes no FFb, que são responsáveis por esse efeito podendo inclusive haver participação das microvesículas presentes neste. Além de ser um componente do FFb, foi demonstrado que o estradiol pode participar diretamente da estimulação do NPR2. Portanto, os objetivos gerais do presente trabalho envolvem a elucidação do sistema NPPC-NPR2 no ovário bovino e a investigação da influência do NPPC exógeno, do estradiol e das vesículas extracelulares sobre a expressão do gene da PDE3 no oócito bovino e sobre a concentração de nucleotídeos cíclicos nos complexos cumulus-oócito. Foram realizado s quatro experimentos: 1) Ensaio imunoenzimático (ELISA) para investigar a presença e a concentração do NPPC no fluido folicular, no lisado de células da granulosa mural e nas vesículas extracelulares, de acordo com a classe de diâmetro folicular (3 a 6 mm; 6 a 8 mm e >8 mm); 2) Imunolocalização do receptor NPR2 no folículo antral bovino; 3) Expressão do gene da PDE3 no oócito bovino, mediante RT - PCR em tempo real, em CCOs im aturos e maturados in vitro por 6 horas com NPPC exógeno, estradiol e vesículas extracelulares; 4) Mensuração da concentração de AMPc e GMPc, em oócitos e células... / In mice, recent studies have demonstrated that the natriuretic peptide precursor C (NPPC) and its type - 2 - receptor (NPR2) are essential for the maintenance of meiosis I arrest in the oocyte. Moreover, paracrine factors secreted by the oocyte such as bone mo rphogenetic protein 15 (BMP15) can modulate this arrest through the expression of the NPR2 gene in cumulus cells of mice. In a recent study in cattle, the bovine follicular fluid (bFF) added to the maturation medium was able to interfere with the oocyte nu clear maturation resulting in higher embryo yield in vitro . However, it is not known what factors present in bFF might be responsible for this effect and one candidate could be the presence of microvesicles in the bFF. Additionally, the estradiol hormone i s component of the bFF and was demonstrated to directly stimulate NPR2 expression. Therefore, the objectives of this work includes the investigation of the NPPC - NPR2 system in the bovine ovary and the assessment of the effects of exogenous NPPC, estradiol and extracellular vesicles on the expression of the PDE3 gene in bovine oocytes and the concentrations of cyclic - nucleotides in cumulus - oocyte complexes. We designed four experiments: 1) enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence and concen tration of the NPPC in follicular fluid, in the lysate of mural granulosa cells and in the extracellular vesicles, according to follicular diameter (3 to 6 mm, 6 to 8 mm, >8 mm); 2) Immunolocalization of NPR2 receptor in bovine antral follicles; 3) PDE3 ge ne expression in bovine oocyte by RT - PCR in real time, in immature COCs and in COCs in vitro matured for 6 h with exogenous NPPC, estradiol and extracellular vesicles; 4) Measurement of the concentration of cAMP and cGMP in oocytes and cumulus cells, respectively, either immature or matured in vitro for 6 h with exogenous NPPC or extracellular vesicles through specific...

Considerando a importância do comportamento meiótico e da recombinação para regular os níveis de variabilidade genética, realizamos o primeiro estudo sobre a meiose masculina e feminina de seis membros do grupo da Drosophila willistoni, um dos mais representativos da família Drosophilidae na região Neotropical. Como ponto de partida, foi necessário padronizar condições técnicas para tal, adaptando protocolos pré-existentes e estabelecidos por outros autores para espécies procedentes do Hemisfério Norte, como a cosmopolita Drosophila melanogaster e a D. ananassae. A qualidade dos preparados e a resolução por nós encontradas para as espécies do grupo willistoni, foi muito superior às obtidas para D. melanogaster, sendo comparável com a excelência das figuras meióticas propiciadas pela D. ananassae. Apesar do baixo número de células em divisão (cerca de 45% dos machos, em média) detectadas, conseguimos caracterizar as fases da divisão meiótica em primórdios das gônadas de larvas macho de D. willistoni e o padrão de sinapse do par sexual e dos autossomos. Inicialmente, foi realizada a análise de duas diferentes populações, cuja prole apresenta sinais de instabilidade genética (como hipermutabilidade e atrofia gonadal), sob condições de cultivo em temperaturas fisiológica e restritiva. Em machos de ambas as linhagens (exceto em uma delas, onde observou-se um indivíduo aneuplóide XO), e nos machos da primeira geração de cruzamento entre as duas populações, não foram observadas irregularidades meióticas nem aberrações cromossômicas, tanto sob temperatura fisiológica, quanto restritiva. Análise posterior da população híbrida, mantida em laboratório, entretanto, permitiu a detecção de quebras, de pontes anafásicas, e de figuras compatíveis com quiasmas no segundo par cromossômico No braço esquerdo do cromossomo II (o chamado IIL) nesta população híbrida, segregam três inversões, a IILF (sub-terminal) e as inversões IILD+E, (na região mediana). Analisando paralelamente as configurações dos cromossomos politênicos interfásicos das glândulas salivares larvais e os meióticos dos primórdios das gônadas de cada larva macho individualmente, observou-se que sempre que ocorreram pontes anafásicas, os indivíduos eram heterozigotos para pelo menos a inversão IILF, e que as quebras detectadas no segundo cromossomo ocorreram na região subterminal de um dos braços. Estes achados fazem supor que nestes machos, estaria havendo recombinação dentro da alça de inversão formada em heterozigotos para a inversão IILF, o que necessita ser testado através de dados genéticos, em estudos futuros. Em machos de uma população natural desta espécie, também observou-se figuras compatíveis com quiasmas na parte terminal do mesmo braço esquerdo do segundo cromossomo, onde segrega a inversão IILH. Já a meiose de machos de uma população de cada uma das espécies crípticas D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis, D. insularis e da não críptica D. nebulosa, mostrou-se regular, não sendo encontradas evidências de não-disjunções, quebras e pontes anafásicas, como em D. willistoni, apesar de todas elas apresentarem polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas (embora menor). O estudo futuro de novas populações deverá esclarecer se a D. willistoni suporta ou não, maiores níveis de recombinação em machos do que as outras espécies, e se estes achados podem ser interpretados como uma estratégia da D. willistoni (considerada como ancestral às outras) para manter altos níveis de polimorfismo, sem perdas gaméticas importantes, nem comprometimento da estabilidade de seu sistema genético A meiose de fêmeas de Drosophila willistoni e de D. paulistorum também foi caracterizada em linhagens igualmente polimórficas, de ambas as espécies. A detecção citológica de recombinação, entretanto, não foi possível, devido à peculiaridade dos cromossomos de oócitos, de assumirem a forma de cariossomo, altamente compactada justo nas fases de prófase I.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-05Bitstream added on 2014-06-13T18:50:06Z : No. of bitstreams: 1 mattos_vf_me_rcla_parcial.pdf: 211845 bytes, checksum: 7ec1dc6e246bc7d6d11ec60c16ad9201 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-04T11:39:29Z: 000713593_20180405.pdf,Bitstream added on 2015-02-04T11:40:14Z : No. of bitstreams: 1 000713593_20180405.pdf: 211410 bytes, checksum: b49448754b9a2e19ae5d9ae5aa91fa43 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-04-13T18:26:29Z: 000713593_20180405.pdf,Bitstream added on 2015-04-13T18:27:07Z : No. of bitstreams: 1 000713593_20180405.pdf: 211410 bytes, checksum: b49448754b9a2e19ae5d9ae5aa91fa43 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Buthidae possui cerca de 900 espécies descritas taxonomicamente; porém, menos de 5% destas espécies foram analisadas sob o ponto de vista citogenético. O número diploide nos butídeos varia entre 2n=5 a 2n=56, e a presença de cromossomos holocêntricos com comportamento sináptico e aquiasmático durante a meiose I é uma característica comum a todas as espécies previamente estudadas. Neste trabalho, os cromossomos mitóticos e meióticos de 11 espécies de escorpiões Buthidae (Ananteris balzanii, Rhopalurus agamemnon, Rhopalurus rochai, Tityus bahiensis, Tityus confluens, Tityus costatus, Tityus fasciolatus, Tityus maranhensis, Tityus martinpaechi, Tityus paraguayensis e Tityus stigmurus) foram estudados através de técnicas de citogenética clássica, molecular e ultraestrutural, com o objetivo de estabelecer os mecanismos responsáveis pela diversidade inter e intraespecífica de número cromossômico e/ou origem das complexas associações multivalentes observadas durante a meiose I, bem como, a evolução dos cromossomos holocêntricos. Nas 11 espécies examinadas, o número diploide variou de 2n=6 a 2n=28 e, em representantes dos três gêneros, associações cromossômicas multivalentes foram observadas em células paquitênicas e pós-paquitênicas. Além disso, uma variabilidade intraespecífica quanto à presença ou ausência de cadeias cromossômicas e ao número de cromossomos envolvidos nas complexas associações multivalentes foi observada em A. balzanii, R. agamemnon, R. rochai, T. bahiensis, T. maranhensis e T. paraguayensis. Células impregnadas pelo íon prata e submetidas à técnica de FISH revelaram certa constância quanto ao número e localização das RONs ativas e sítios de rDNA 45S, apesar da grande variação cromossômica verificada entre as espécies, visto que, RONs localizadas... / The family Buthidae has about 900 species taxonomically described; however, less than 5% of these species were analyzed from the cytogenetic point of view. The diploid number in buthid ranges from 2n=5 to 2n=56, and the presence of holocentric chromosomes with synaptic and achiasmatic behavior during the meiosis I is a common feature for all previously studied species. In this work, the mitotic and meiotic chromosomes of 11 species of Buthidae scorpions (Ananteris balzanii, Rhopalurus agamemnon, Rhopalurus rochai, Tityus bahiensis, Tityus confluens, Tityus costatus, Tityus fasciolatus, Tityus maranhensis, Tityus martinpaechi, Tityus paraguayensis and Tityus stigmurus) were studied through classical, molecular and ultrastructural cytogenetic techniques, aiming to establish the responsible mechanisms for inter and intraspecific diversity of chromosomal number and/or origin of the multivalent complex associations observed during the meiosis I, as well as, the holocentric chromosome evolution. In the 11 species examined, the diploid number ranged from 2n=6 to 2n=28; multivalent chromosomal associations were observed in pachytene and postpachytene cells of species of the three genera. Moreover, an intraspecific variability regarding to the presence or absence of chromosome chains and the number of chromosomes involved in multivalent complex associations was observed in A. balzanii, R. agamemnon, R. rochai, T. bahiensis, T. maranhensis and T. paraguayensis. Silver-impregnated cells and nuclei submitted to the FISH technique revealed constancy in relation to the number and localization of the active NORs and rDNA 45S sites, respectively, despite of the high chromosomal variation verified among species, i.e., NORs located on terminal and subterminal region of two chromosomes were the common pattern for buthids... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marielle Cristina Schneider / Banca: Rodrigo Marques Lima dos Santos / Banca: Mateus Mondin / Resumo: A família Buthidae possui cerca de 900 espécies descritas taxonomicamente; porém, menos de 5% destas espécies foram analisadas sob o ponto de vista citogenético. O número diploide nos butídeos varia entre 2n=5 a 2n=56, e a presença de cromossomos holocêntricos com comportamento sináptico e aquiasmático durante a meiose I é uma característica comum a todas as espécies previamente estudadas. Neste trabalho, os cromossomos mitóticos e meióticos de 11 espécies de escorpiões Buthidae (Ananteris balzanii, Rhopalurus agamemnon, Rhopalurus rochai, Tityus bahiensis, Tityus confluens, Tityus costatus, Tityus fasciolatus, Tityus maranhensis, Tityus martinpaechi, Tityus paraguayensis e Tityus stigmurus) foram estudados através de técnicas de citogenética clássica, molecular e ultraestrutural, com o objetivo de estabelecer os mecanismos responsáveis pela diversidade inter e intraespecífica de número cromossômico e/ou origem das complexas associações multivalentes observadas durante a meiose I, bem como, a evolução dos cromossomos holocêntricos. Nas 11 espécies examinadas, o número diploide variou de 2n=6 a 2n=28 e, em representantes dos três gêneros, associações cromossômicas multivalentes foram observadas em células paquitênicas e pós-paquitênicas. Além disso, uma variabilidade intraespecífica quanto à presença ou ausência de cadeias cromossômicas e ao número de cromossomos envolvidos nas complexas associações multivalentes foi observada em A. balzanii, R. agamemnon, R. rochai, T. bahiensis, T. maranhensis e T. paraguayensis. Células impregnadas pelo íon prata e submetidas à técnica de FISH revelaram certa constância quanto ao número e localização das RONs ativas e sítios de rDNA 45S, apesar da grande variação cromossômica verificada entre as espécies, visto que, RONs localizadas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The family Buthidae has about 900 species taxonomically described; however, less than 5% of these species were analyzed from the cytogenetic point of view. The diploid number in buthid ranges from 2n=5 to 2n=56, and the presence of holocentric chromosomes with synaptic and achiasmatic behavior during the meiosis I is a common feature for all previously studied species. In this work, the mitotic and meiotic chromosomes of 11 species of Buthidae scorpions (Ananteris balzanii, Rhopalurus agamemnon, Rhopalurus rochai, Tityus bahiensis, Tityus confluens, Tityus costatus, Tityus fasciolatus, Tityus maranhensis, Tityus martinpaechi, Tityus paraguayensis and Tityus stigmurus) were studied through classical, molecular and ultrastructural cytogenetic techniques, aiming to establish the responsible mechanisms for inter and intraspecific diversity of chromosomal number and/or origin of the multivalent complex associations observed during the meiosis I, as well as, the holocentric chromosome evolution. In the 11 species examined, the diploid number ranged from 2n=6 to 2n=28; multivalent chromosomal associations were observed in pachytene and postpachytene cells of species of the three genera. Moreover, an intraspecific variability regarding to the presence or absence of chromosome chains and the number of chromosomes involved in multivalent complex associations was observed in A. balzanii, R. agamemnon, R. rochai, T. bahiensis, T. maranhensis and T. paraguayensis. Silver-impregnated cells and nuclei submitted to the FISH technique revealed constancy in relation to the number and localization of the active NORs and rDNA 45S sites, respectively, despite of the high chromosomal variation verified among species, i.e., NORs located on terminal and subterminal region of two chromosomes were the common pattern for buthids... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: José Buratini Junior / Resumo: A comunicação entre o oócito e células somáticas adjacentes é essencial para a diferenciação do complexo cumulus-oócito (COC). Essa comunicação é proporcionada por processos citoplasmáticos trans-zonais (TZP) que penetram através da zona pelúcida e atingem a membrana do oócito, onde junções do tipo gap permitem transporte bidirecional de sinais elétricos e moléculas reguladoras. A maturação oócitária in vivo é controlada por gonadotrofinas e peptídeos intra-ovarianos e desencadeada pelo pico de LH. Este, induz a expressão dos fatores EGF-like que desencadeiam uma série de fatores que levam a fosforilação das conexinas, e com isso o fechamento de junções gap e consequentemente perda dos efeitos inibitórios do monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), proporcionando assim a retomada da meiose. O objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos da inclusão de uma fase de pré maturação seguida da maturação in vitro sobre a progressão da meiose, funcionalidade das junções gap e produção embrionária. A pré maturação foi empregada utilizando componentes de ordem fisiológica encontradas no ambiente folicular, e esta, foi capaz de retardar a quebra da vesícula germinativa (VGBD), enquanto favoreceu a comunicação entre oócito e células do cumulus, o que acreditamos ser beneficial para o desenvolvimento oocitário in vitro. No entanto, quando seguida da maturação in vitro também utilizando componentes fisiológicos, foi capaz de prod... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The maturation of the cumulus oocyte complex (COC) is triggered by the ovulatory LH surge in vivo, and precociously induced when the COC is removed from the follicle. Natriuretic peptide type C (NPPC) plays a central role in maintaining meiotic arrest in vivo and delays GVBD while increasing oocytecumulus communication during IVM in cattle. In this study we first tested the hypothesis that follicular steroids (estradiol, progesterone and androstenedione) combined with FSH at approximately physiological levels cooperate with NPPC to delay GVBD and to maintain oocyte-cumulus communication. Then, we assessed the effects of follicular steroids, NPPC and the combination of both in a pre-IVM culture followed by IVM induced with AREG on embryo production. Follicular steroids combined with NPPC was most effective in increasing the proportion of GV oocytes in Bos indicus, although follicular steroids did not significantly enhance the effect of NPPC in Bos Taurus. . Moreover, follicular steroids enhanced the ability of NPPC to increase the proportion of COCs with opened GAP junctions. The addition of follicular steroids and/or NPPC to a pre- IVM culture did not alter blastocyst production after IVF. In conclusion, the combination of follicular steroids with NPPC can alter GVBD dynamics and cell communication favorably to oocyte developmental competence, but when used in a pre-IVM culture followed by induction of COC maturation with AREG and IVF, it did not increase e... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar os efeitos da cilostamida e das metades foliculares sobre o bloqueio da retomada da meiose de oÃcitos in vitro no complexo cumulus oÃcito bovinos (COC) , (2) investigar a reversibilidade do efeito da cilostamida na retomada da meiose, e (3) quantificar os nÃveis de AMPc em COCs, oÃcitos desnudos (OD) e cÃlulas do cumulus (CC) apÃs o cultivo de COCs na presenÃa de cilostamida e metades foliculares. Para este fim, os oÃcitos de bovino foram submetidos a um perÃodo de prÃ-maturaÃÃo de 12 h em meio contendo 10 μM cilostamida, metades foliculares ou combinaÃÃo de ambos e, em seguida, submetidos a maturaÃÃo in vitro. Para avaliar a reversibilidade do efeito da cilostamida, no final deste perÃodo de cultura, COC foram lavados e colocados em meio de maturaÃÃo, sem cilostamida por 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 horas. Para avaliar os nÃveis de AMPc, COCs submetidos a prÃ-maturaÃÃo por 6 h foram utilizados para a quantificaÃÃo do nÃvel de AMPc. ApÃs 12 horas de cultivo, grupos de COCs foram fixados para avaliar a configuraÃÃo da cromatina e progressÃo da meiose. Os resultados mostraram que COCs cultivados em presenÃa de cilostamida e metades foliculares apresentaram percentuais significativamente maiores de oÃcitos em vesÃcula germinativa (94%), depois de um perÃodo de 12 h de prÃ-maturaÃÃo, do que COCs cultivados em outros tratamentos. ApÃs o bloqueio, 75% dos oÃcitos atingiram metÃfase II apÃs 16 horas de maturaÃÃo, enfatizando que o tratamento nÃo à tÃxico para os oÃcitos. AlÃm disso, os oÃcitos cultivados em meio contendo cilostamida e metades foliculares tinham nÃveis significativamente mais elevados de AMPc quando comparado com outros tratamentos. Concluiu-se que a cilostamida e metades foliculares interagem e promovem a manutenÃÃo de oÃcitos no estÃgio de vesÃcula germinativa, aumentando os nÃveis de AMPc em COCs cultivados. / The aims of this study were (1) to evaluate the effects of cilostamide and follicular hemisections on the blockage of in vitro oocyte meiotic resumption in bovine cumulus oocyte complexs (COCs), (2) to investigate the reversibility of cilostamide effect on meiotic resumption, and (3) to quantify the levels of cAMP in COCs, denuded oocytes (DO) and cumulus cells (CC) after culturing COCs in presence of cilostamide and follicular hemisections. To this end, bovine oocytes were subjected to a pre-maturation period of 12 h in medium containing 10 ÂM cilostamide, follicular hemisections or combination of both and,then, submitted to in vitro maturation. To evaluate the reversibility of cilostamide effect, at the end of this culture period, COCs were washed and placed in maturation medium without cilostamide for 12, 14, 16, 18, 20, 22 and 24 hours. To investigate the levels of cAMPc, COCs subject to pre-maturation for 6 h were used to measure the levels of cAMP. After 12 hours of culture, groups COCs were fixed to assess chromatin configuration and meiotic rogression. The results showed that COCs cultured in presence of cilostamide and follicular hemisections had significantly higher percentages of oocytes at germinal vesicle stage (94%), after a period of 12 h of pre-maturation, than COCs cultured in other treatments. After blocking treatment, 75% of oocytes reached metaphase II after 16 h of maturation, emphasizing that the treatment is not toxic to oocytes. Moreover, oocytes cultured in medium containing cilostamide and follicular hemisctions had significantly higher levels of cAMP when compared to other treatments. It is concluded that cilostamide and follicular hemisections interact and promotes the maintenance of oocytes at germinal vesicle stage by increasing the levels cAMP in cultured COCs.

La recombinaison méiotique est au cœur de l'hérédité Mendélienne, de l'évolution et de l'amélioration des plantes, car elle assure, grâce aux crossovers, une transmission fidèle des chromosomes et le brassage de l’information génétique au fil des générations. Deux voies de formation des crossovers coexistent chez les plantes. La voie principale (voie I) dépend de la protéine MSH4 (et de quelques autres). La voie secondaire ne produit que quelques crossovers (dits de voie II) au cours de la méiose d’une plante de type sauvage ; ils sont indépendants de MSH4 et leur nombre est limité par des protéines telles que FANCM. Si ces deux voies ont été bien décrites chez des espèces diploïdes, ce n’est pas le cas chez des plantes allopolyploïdes, pourtant très fréquentes parmi les plantes cultivées. Il s'agit là d'une lacune importante, car la présence de plusieurs jeux de chromosomes apparentés conduit à augmenter le nombre de partenaires susceptibles de former des crossovers et le nombre de copies de tous les gènes méiotiques, rendant la recombinaison méiotique plus complexe. Cette thèse vise à explorer l'interaction entre les voies de formation des crossovers et la polyploïdie en utilisant des mutants de colza (Brassica napus; AACC) et d’un de ces parents diploïdes (B. rapa; AA) pour deux gènes de la recombinaison méiotique.J'ai tout d'abord testé dans quelle mesure la formation de crossovers entre chromosomes homologues et entre homéologues (chromosomes A et C) est tributaire des voies I et II en évaluant l’effet d’une diminution du nombre de copies fonctionnelles de MSH4 sur le nombre de crossovers. J'ai montré que ce dernier n'est altéré que lorsque les deux copies MSH4 sont inactivées, toute autre combinaison de mutations conduisant au même nombre de crossovers inter-homologues que chez le sauvage. J'ai également montré que la proportion de crossovers de voie II chez des mutants msh4 de colza est bien supérieure à celles observées chez d’autres plantes mutantes pour msh4. Cette observation reste vraie chez des mutants msh4 de B. rapa, suggérant que la proportion accrue de crossovers de voie II n’est pas spécifique au colza, mais probablement une caractéristique des Brassicaceae. Chez des plantes allohaploïdes (AC) de colza, chez lesquelles les crossovers ne peuvent se former qu’entre homéologues, les copies MSH4 ne se compensent plus complétement ; le nombre de crossovers de voie I fluctue au contraire proportionnellement au dosage de MSH4, devenant presque nul lorsque toutes les copies sont inactivées. Mes résultats illustrent deux nouvelles propriétés spécifiques des crossovers entre homéologues: une plus grande sensibilité vis-à-vis du dosage MSH4 pour les crossovers de voie I et une plus faible efficacité des crossovers de voie II.Dans un second temps, j'ai caractérisé cytologiquement des mutants fancm de colza pour vérifier que l'augmentation des crossovers de voie II ne nuit pas à au bon déroulement de sa méiose. Cette question est restée en suspens, les mutants fancm de colza n’étant pas complètement nuls. Cet écueil m'a incité à développer une approche de TILLING par séquençage pour identifier de nouveaux mutants de recombinaison chez le colza. J'ai alors combiné les mutations fancm et msh4 chez B. rapa pour vérifier si les premières suffisent à corriger les défauts méiotiques induits par les secondes. J'ai montré que, conformément à ce qui avait été observé chez Arabidopsis thaliana, la mutation fancm augmente le nombre de crossovers à un point tel qu’elle restaure la formation de bivalents dans un mutant msh4. La fonction de FANCM est donc conservée chez B. rapa.Mes résultats ont fait progresser la compréhension des voies de formation des crossovers lors d’une méiose allopolyploïde. Ils indiquent que la transmission des chromosomes chez ces espèces implique principalement des crossovers de voie I, et qu’elle pourrait être assurée en limitant l’efficacité de cette voie (e.g. en diminuant le nombre de copies de gènes). / Meiotic recombination ensures, through the formation of crossovers (COs), both faithful chromosome transmission and allelic shuffling over generations; it is at the heart of Mendelian heredity, evolution and plant breeding. Two crossover pathways co-exist in plants. The main pathway (class I) is dependent on MSH4 (and additional proteins). The secondary pathway produces only a few MSH4-independent (class II) crossovers during wild-type meiosis that are limited in number by anti-crossover proteins such as FANCM. These pathways have been extensively described in diploid species, disregarding one of the most pervasive features of crop genomes: polyploidy. This is a major gap in our understanding because the presence of more than two related sets of chromosomes leads both to extra partners for crossover formation and additional copies for all meiotic genes, which make meiotic recombination more intricate. This thesis aims at exploring the interplay between meiotic recombination pathways and polyploidy using mutants for two recombination genes in allotetraploid Brassica napus (AACC; 2n=38) and its diploid progenitor, B. rapa (AA; 2n=20). I have first tested the extent to which class I and class II pathways contribute to inter-homolog and inter-homoeolog (between A and C chromosomes) crossover formation by analyzing how crossovers are affected as the number of functional MSH4 copies decreases. I showed that inter-homolog crossover formation is impaired only when the two MSH4 copies are lost, any other combination of msh4 mutations resulting in wild-type crossover numbers. I also observed that, when class I crossovers are completely abolished in B. napus, the highest frequency of class II crossover ever reported among plant msh4 mutants is observed. I reproduced this result using B. rapa msh4 mutants, thereby demonstrating that increased class II crossover frequencies is not specific to B.napus, but could instead be a general feature of the Brassicaceae. In B. napus allohaploids (AC), where crossovers are forced to occur between homeologs, MSH4 copies no longer complement each other perfectly; counter to the situation in euploids, the number of MSH4-dependent crossovers formed between homoeologs fluctuates with MSH4 dosage in these plants, and approximate zero when all MSH4 copies are depleted. Altogether, my results illustrate two novel specific properties of inter-homeolog crossovers: a greater sensitivity to MSH4 dosage for class I pathway and a lower efficiency for class II.Next, I characterized cytologically B. napus fancm mutants to confirm that boosting class II crossovers would not be detrimental to B. napus meiosis. However, a prudential interpretation of these results is demanded since the B. napus fancm alleles retained residual anti-crossover activity. This has prompted me to set up a TILLING-by-sequencing procedure in order to produce new recombination mutants in B. napus. I also combined the B. rapa fancm and msh4 mutations to test whether the former is sufficient to fix the meiotic defects resulting from the latter. I showed that, similarly to what had been observed in Arabidopsis thaliana, fancm mutation boost COs to such a point that it restores bivalent formation in B. rapa msh4 background. My results therefore confirmed that the function of FANCM is conserved in B. rapa. Overall, the findings and achievements of this thesis make a step forward dissection of CO pathways during allopolyploid meiosis. They indicate that meiotic adaptation to allopolyploidy mainly involve the class I crossover pathway and could be achieved by limiting its efficiency (e.g. by decreasing gene copy number).

Orientadora: Marielle Cristina Schneider / Banca: Ana Cristina Prado Veiga Menoncello / Banca: Mara Cristina de Almeida / Banca: Rita de Cássia de Moura / Banca: Edson Lourenço da Silva / Resumo: Os besouros da subfamília Cassidinae s.l. são popularmente conhecidos como "tortoise beetles" devido ao formado peculiar dos élitros que se assemelham ao casco de tartaruga. Esta subfamília inclui mais de 6000 espécies descritas taxonomicamente, das quais menos de 2% foram estudadas sob o ponto de vista citogenético, e evidenciaram número diploide variando entre 2n=16 a 2n=51 e sistemas cromossômicos sexuais dos tipos Xyp, X0, Xy, Xyc, Xyr, neoXY, Xyyp, XpneoXneoYp, entre outros sistemas múltiplos. No entanto, cerca de 85% das espécies apresentaram predominância do cariótipo 2n=16+Xyp, e esta característica cariotípica pode estar relacionada ao baixo número de espécies examinadas, a predominância de análises em espécies pertencentes a um mesmo gênero e/ou tribo, bem como a escassez ou até mesmo a inexistência de estudos que utilizaram marcação de regiões cromossômicas específicas. O objetivo deste trabalho é discutir sobre os mecanismos de evolução cromossômica em espécies de Cassidinae. As análises cromossômicas foram realizadas em 19 espécies de cassidíneos da fauna brasileira, através de coloração convencional, bandeamento C e hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas dos genes ribossomais 28S, 5S, dos clusters teloméricos (TTAGG)n e (TCAGG)n, e do pequeno RNA nuclear (snRNA) U2. O estudo citogenético de 19 espécies de Cassidinae revelou uma grande diversidade em relação ao número diploide - Cassidini: 2n=38+Xyp em Agroiconota inedita, 2n=20+Xyp em Charidotella immaculata, Charidotella sexpunctata e Microctenochira stigmatica, 2n=16+Xyp em Deloyala cruciata, Microctenochira aciculata, Microctenochira optata e Microctenochira quadrata, 2n=18 em Microctenochira gnata; Goniocheniini: 2n=16+Xyp em Chlamydocassis cribripennis; Ischyrosonychini: 2n=16+Xyp em Cistudinella obducta; Mesomphaliini: ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The beetles of the subfamily Cassidinae s.l. are commonly known as tortoise beetles, due to the peculiar shape of the elytra. This subfamily possesses more than 6000 taxonomically described species, of which less than 2% were cytogenetically studied. The cassidines showed diploid number ranged from 2n=16 to 2n=51, and sex chromosome systems of the Xyp, X0, Xy, Xyc, Xyr, neoXY, Xyyp, XpneoXneoYp types, in addition to other multiple systems. Despite the occurrence of this karyotype diversity, about 85% of the species presented the karyotype 2n=16+Xyp. However, this karyotype homogeneity may be related to the low number of species examined, the analyses with species included in the same genus and/or tribe, as well as the scarcity or lack of studies with techniques that identify specific chromosomal regions. The aim of this work is to discuss about the mechanism of chromosome evolution in species of Cassidinae. The chromosomal analysis were performed in 19 species of Cassidinae from Brazilian fauna, using standard staining, C-banding and fluorescent in situ hybridization (FISH) with probes of 28S rDNA, 5S rDNA, (TTAGG)n and (TCAGG)n telomeric clusters, and U2 small nuclear RNA (snRNA). The cytogenetic studies in 19 cassidine beetles revealed a high diversity of diploid number - Cassidini: 2n=38+Xyp in Agroiconota inedita, 2n=20+Xyp in Charidotella immaculata, Charidotella sexpunctata and Microctenochira stigmatica, 2n=16+Xyp in Deloyala cruciata, Microctenochira aciculata, Microctenochira optata and Microctenochira quadrata, 2n=18 in Microctenochira gnata; Goniocheniini: 2n=16+Xyp in Chlamydocassis cribripennis; Ischyrosonychini: 2n=16+Xyp in Cistudinella obducta; Mesomphaliini: 2n=34+Xyp in Botanochara tesselata, 2n=20+Xyp/Xyr in Chelymorpha cribraria, 2n=20+Xyp in Chelymorpha inflata, 2n=20 in Cteisella magica, 2n=38+Xyp in ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Apesar do grande volume de pesquisas e dos avanços da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a eficiência da técnica ainda está distante do desejável, principalmente quando comparada a embriões produzidos in vivo. A maturação in vitro é etapa importante da PIV, visto que a qualidade dos embriões é dependente da qualidade do oócito e, assim, modificações nas condições de maturação in vitro podem trazer avanços à produção de embriões. A melatonina é um hormônio que foi detectado no fluido folicular de humanos, suínos e, mais recentemente, de bovinos. Ainda, seus receptores foram localizados em oócitos e células da granulosa. Estudos in vitro apontam efeitos benéficos de sua utilização na maturação e cultivo in vitro de oócitos e embriões, embora os resultados sejam por vezes contraditórios. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da melatonina na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e também seu potencial como indutor de genes de enzimas antioxidantes e inibidor de fragmentação nuclear em células do cumulus. Para tanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs), obtidos de ovários de abatedouro, foram maturados in vitro na presença de melatonina (10-9 e 10-6 M), FSH (controle positivo) ou sem hormônios (controle negativo). As taxas de maturação nuclear foram avaliadas às 6, 12, 18 e 24 horas de cultivo (Experimento 1). No Experimento 2, os mesmos grupos experimentais foram avaliados quanto à abundância relativa de transcritos de genes de enzimas antioxidantes (Cu,ZnSOD, MnSOD e GPx) em oócitos e células do cumulus (24 horas de MIV) por PCR em tempo real. No Experimento 3 foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a fragmentação nuclear em células do cumulus pela técnica de TUNEL e citometria de fluxo (24 horas de MIV). A taxa de maturação avaliada às 6 h de MIV foi de 100% de oócitos imaturos em vesícula germinativa (VG) (P>0,05). Às 12 horas de cultivo foi observado o efeito da melatonina similar ao FSH, variando a proporção de oócitos em metáfase I (MI) de 54,0 a 80,7 % entre os grupos (P<0,05). Após 18 h de MIV observou-se que a maioria dos oócitos já havia atingindo o estádio de metáfase II (MII) variando de 57,2 a 74,2 % (P>0,05). Após 24 h de MIV, observou-se que a maioria dos oócitos atingiu o estádio de MII (50,7 a 89,5%), sendo que a melatonina na maior concentração apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P<0,05). Em relação à expressão de enzimas antioxidantes em oócitos não houve efeito de nenhum tratamento (P>0,05%). Já em células do cumulus houve maior expressão do MnSOD no grupo com FSH em relação ao grupo maturado sem hormônios ou imaturo (P<0,05). A melatonina nas diferentes concentrações apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P>0,05). Transcritos para a enzima Cu,ZnSOD foram mais abundantes em cumulus de CCOs maturados com a maior concentração de melatonina (10-6 M) em relação ao grupo imaturo (P<0,05), não havendo variação nos demais (P>0,05). GPX4 não foi afetado pelos tratamentos (P>0,05). A quantidade de células do cumulus com fragmentação nuclear não foi afetada por nenhum tratamento (33,4 a 41,5/10.000 células; P>0,05) Com base nestes resultados conclui-se que a melatonina nas concentrações avaliadas (10-9 e 10-6 M), embora seja capaz de estimular a maturação nuclear e induzir a expressão de alguns genes antioxidantes em células do bovinas, ainda que de forma semelhante ao FSH, não provocou redução da fragmentação nuclear nestas células. / Nevertheless the great volume of research and the advances in in vitro production (IVP) of bovine embryos, the efficiency of this techinque is still beyond the desireable, specially when compared to embryos produced in vivo. in vitro maturation (IVM) is an important step in IVP, since the quality of embryos is dependent on the quality of oocytes, and, therefore, modifications to in vitro maturation conditions can bring improvements to embryo production. Melatonin is a hormone which has been detected in the folicular fluid of humans, pigs, and more recently, in bovine. Also, its receptores have been identified in oocytes and granulosa cells. Studies in vitro have shown that melatonin may have beneficial effects when used in oocyte maturation and embryo culture, although results are sometimes contradictory. The aim of the present work was to assess the effect of melatonin during IVM on nuclear maturation of bovine oocytes as well as its potential to induce expression of antioxidant enzymes and to reduce nuclear fragmentation in cumulus cells. Cumulus-oocyte comprexes (COCs), obtained from abbattoir ovaries, were matured in vitro in the presence of melatonin (10-9 e 10-6 M), FSH (positive controle) or without hormones (negative control). Maturation rates were evaluated at 6, 12, 18 and 24 h (Experiment 1). In Experiment 2, the same groups were evaluated for the relative abundance of transcripts encoding antioxidant enzymes (Cu,ZnSOD, MnSOD and GPx) in oocytes and cumulus cells (24 h IVM) by real time PCR. In Experiment 3, the effect of treatments on nuclear fragmentation in cumulus cells was determined by TUNEL and flow cytometry (24 h IVM). At 6 h IVM, all oocytes were at immature germinal vesicle (GV) stage. After 12 h of cuture the effect of melatonin was similar to that of FSH, with proportions of oocytes in metaphase I (MI) varying from 54.0 to 80.7% between groups (P>0.05). After 18 h IVM most oocytes had reached metaphase II (MII) stage (57.2 to 74.2%, P>0.05). At 24 h IVM, oocytes were also mostly in MII stage (50.7 to 89.5%), and the highest melatonin concentration was similar to the gonadotrophin (P>0.05). Regarding expression of antioxidant enzymes in oocytes there was no effect of treatments for any of the genes (P>0.05). However, in cumulus cells MnSOD expression was higher in FSH compared with the groups matured without hormones or immature cells (P<0.05). Melatonin in both concentrations were similar to FSH (P>0.05). Transcripts for Cu,ZnSOD were more abundant in cumulus from COCs matured with the highest melatonin concentration (10-6 M) in relation to immature cells (P<0.05), but was not diferent from other groups (P>0.05). GPx was not affected by treatments (P>0.05). The number of nuclear fragmentation in cumulus cells was also not affected by treatments (33.4 to 41.5/10,000 cells; P>0.05). According to these results it is concluded that melatonin is able to induce meiosis resumption in oocytes (10-9 and 10-6 M) and expression of some antioxidant genes in bovine cumulus cells, similar to the effect of FSH, but was ineffective in reducing nuclear fragmentation in these cells.

O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos. Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias, durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96 h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação, como para a apoptose embrionária. / Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development, and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low (0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h, morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups. Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group. These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.