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La neurotransmission nécessite la fusion de vésicules synaptiques (VS) avec la membrane pré-synaptique pour libérer les neurotransmetteurs qui vont activer les récepteurs du neurone post-synaptique. Le nombre de VS dans le bouton pré-synaptique est limité, ce qui nécessite des mécanismes efficaces pour régénérer ces vésicules. Parmi ces mécanismes, il existe l’endocytose dépendante de la clathrine, l'endocytose ultra-rapide et l'endocytose de masse (ADBE), ces deux dernières étant indépendantes de la clathrine. Dans cette étude, il est montré que l'absence d'Alix (ALG-2 interacting protein-X) entraîne des modifications morphologiques et fonctionnelles des synapses qui pourraient être la conséquence d’un recyclage défectueux des VS. Nous avons récemment montré que Alix et l’un de ses partenaires, l'endophiline-A, sont essentiels pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les fibroblastes, ce qui nous amène à penser que Alix pourrait jouer le même rôle dans le bouton pré-synaptique. Au cours de ce travail, j’ai montré que Alix se concentre au niveau des boutons pré-synaptiques après une stimulation à haute fréquence des neurones. En utilisant des formes mutantes d’Alix, j’ai montré que le recrutement d’Alix à la membrane pré-synaptique était dépendant de son interaction avec ALG-2 (protéine de liaison au calcium). De même la relocalisation de l’endophiline-A à la synapse est dépendante de son interaction avec Alix. Par ailleurs, l’absence d'Alix dans les neurones conduit à une altération de l'ADBE, qui peut être restaurée par l'expression d'Alix, mais pas avec ses mutants incapables d'interagir avec ALG-2 ou l'endophiline-A.Les résultats de cette étude démontrent qu'Alix est important pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les synapses, processus indispensable au recyclage des vésicules synaptiques au cours d'une activité neuronale normale. / Neurotransmission involves the fusion of synaptic vesicles (SVs) to the presynaptic membrane to release neurotransmitters that will bind receptors on the postsynaptic neuron. The number of SVs in central nerve terminals is limited, necessitating a set of reliable mechanisms to regenerate SVs. Among such mechanisms are clathrin-mediated endocytosis, ultrafast endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis (ADBE), where the latter two are clathrin-independent. The present study reveals that the depletion of Alix (ALG-2 interacting protein-X) leads to morphological and functional changes of synapses that indicate defective SV recycling. Our recent finding that Alix and its major partner, endophilin-A, is crucial for clathrin-independent endocytosis in fibroblasts, led us to hypothesise that Alix may have such a role at the presynapse. The present study has allowed us to demonstrate that Alix concentrates at presynaptic boutons during intense stimulation. Using mutant forms of Alix, we demonstrate that this recruitment of Alix is depends on the ability of Alix to interact with the calcium binding protein, ALG-2. Endophilin-A is also recruited to presynaptic boutons and this recruitment is dependent on its capacity to interact with Alix. It is then revealed that the lack of Alix in neurons leads to impaired ADBE, suggesting the importance of Alix in ADBE. Such a role of Alix depends on its ability to interact with ALG-2 and endophilin since the impairment of ADBE was reversed upon rescuing the expression of wild-type Alix, but not with Alix mutants unable interact with ALG-2 or endophilin-A.The findings of this study demonstrate that Alix is important for clathrin-independent endocytosis at synapses, a process necessary for the recycling of synaptic vesicles during normal neuronal activity.

CHMP2B est une sous-unité du complexe ESCRT-III, un complexe cytosolique très conservé, responsable du remodelage des membranes biologique, dans divers processus cellulaires. Des mutations de CHMP2B sont associées à une forme familiale de démence frontotemporale. Une étude précédente a mis en évidence que les mutants pathogènes de CHMP2B altèrent la morphologie des épines dendritiques, un phénomène potentiellement à l'origine de la maladie. Ce travail de recherche a pour objectif de décrire le rôle de CHMP2B, et du complexe ESCRT-III, dans la structure et le fonctionnement des épines dendritiques. Dans des lignées cellulaires, nous avons démontré que CHMP2B a la propriété de s'associer préférentiellement à la membrane plasmique, de se polymériser en filaments hélicoïdaux et de former de longs et fins tubes membranaires. Ce résultat indique que CHMP2B est directement impliqué dans le remodelage de la membrane plasmique. Dans les neurones, CHMP2B se concentre dans des régions sous-membranaires proches de la PSD. Une analyse biochimique a montré que CHMP2B et CHMP4B sont associées à d'autres sous-unités, pour former un complexe ESCRT-III postsynaptique particulièrement stable. Nous avons identifié par spectrométrie de masse que ce complexe interagit également avec des protéines d'échafaudage postsynaptiques et des protéines de remodelage du cytosquelette d'actine. La déplétion de CHMP2B par RNAi, dans des neurones en culture, affecte la complexité de l'arborisation dendritique, la morphologie des épines dendritiques et empêche le gonflement des épines associé à la LTP. Des expériences de récupération, avec des mutants pontuels, indiquent que le rôle de CHMP2B dans le maintien de l'arborisation dendritique est dépendant à la fois de de son association avec ESCRT-III et la bicouche phospholipidique. Nous proposons une nouvelle fonctionnalité pour un complexe ESCRT-III contenant CHMP2B, dans les processus de remodelage de la membrane postsynaptique associés à la maturation et à la plasticité des épines dendritiques. / CHMP2B is a subunit of ESCRT-III, a highly conserved cytosolic protein machinery, responsible for membrane remodeling in diverse cellular mechanisms. Mutations in CHMP2B are responsible for a familial form of frontotemporal dementia. A previous study highlighted that FTD-related mutants of CHMP2B impair the morphological maturation of dendritic spines, a process that may underlie neurodegeneration in this disease. The goal of this research work id directed towards understanding the role of CHMP2B and ESCRT-III in dendritic spines structure and function. In cell lines, we demonstrated that CHMP2B associates preferentially with the plasma membrane, polymerizes in helical filaments and forms long and thin membrane protrusions. This result indicates that CHMP2B is directly involved in plasma membrane remodeling. In neurons, CHMP2B concentrates in specific sub-membrane microdomains close to the PSD. Biochemical analysis revealed that CHMP2B and CHMP4B associate with other subunits to form a remarkably stable postsynaptic ESCRT-III complex. Mass-spectrometry indicated that this complex also interacts with postsynaptic scaffolds and proteins involved in actin cytoskeleton remodelling. RNAi depletion of CHMP2B, in cultured neurons, alters stability of dendrite branching and morphology of dendritic spines, and impairs spine head growth, normally associated with LTP. Rescue experiments, with point mutants, indicated that CHMP2B activity in dendrite branching is dependent on its capacity to both bind phospholipids and oligomerization with ESCRT-III. We propose a novel functionality for an ESCRT-III complex containing CHMP2B, in maturation-dependent and plasticity-dependent processes of dendritic spine morphogenesis.

Un nouveau modèle de biomembrane de type liposome a été développé à partir de lipides synthétisés comportant une unité biphényle sur leur chaînes sn2 et une chaîne aliphatique sn1 de longueur et insaturation variables. L’anisotropie de susceptibilité magnétique positive de ces molécules induit une déformation en oblate de ces liposomes dits « biphényles » dans le champ magnétique B0. Cette déformation spécifique a été caractérisée par RMN des solides 31P et 2H en faisant varier différents paramètres : l’intensité de B0, l'élasticité membranaire, la température et la taille des liposomes (Helfrich, 1973). Ces vésicules déformées ont pu être observées par microscopies optiques et électroniques et la rémanence de la déformation en dehors de B0 a pu être analysée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). Enfin, les premières applications des liposomes biphényles comme nouveau modèle de biomembrane pour analyser la structure et l’orientation (par RMN des solides 15N) de peptides ou protéines membranaires, ont été étudiées. / A new model of biomembrane (liposome) was developed from synthesized lipids containing a biphenyl unit on the sn2 aliphatic chain and possessing a sn1 aliphatic chain which varies in length and unsaturation. The positive magnetic susceptibility anisotropy of these molecules induces an oblate deformation of these «biphenyls » liposomes under the magnetic field B0. This particular deformation has been characterized by 31P and 2H solid state NMR by varying different parameters: the intensity of B0, the membrane elasticity, the temperature and the size of the liposomes (Helfrich, 1973). These deformed vesicles were observed by optical and electron microscopy and the remanence of the deformation outside B0 has been analyzed by Small angles X-ray scattering (SAXS).Finally, the first applications of biphenyls liposomes as new biomembrane model to analyze the structure and orientation of membrane proteins or peptides were studied by 15N solid state NMR