No description available.

Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer / From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

Die Plasmamembranspannung von eukaryotischen Zellen soll maßgeblich zur Regulation von zellulären Prozessen wie der Zellmigration, Mitose, Endo- und Exozytose, Membranreparatur, Osmoregulierung und Zellspreiten beitragen, welche zu einer Veränderung der Membranfläche und ihrer Deformation führt. In dieser Arbeit wurde die epitheliale Zelllinie MDCK II (Madin-Darby Canine Kidney) benutzt, um spannungsgesteuerte Oberflächenregulierung zu untersuchen. Indentationsexperimente kombiniert mit dem Herausziehen von Membrannanoröhren wurden mit Hilfe des Rasterkraftmikroskops (Atomic Force Microskope, AFM) durchgeführt, um lokale Variationen in der Membranspannung und überschüssiger Membranfläche als Funktion von äußeren Reizen abzuschätzen. Die verwendeten externen Stimuli beinhalten eine Veränderung der Funktionalität des Actomyosin-Cortexes durch die Wirkung von Blebbistatin und Cytochalasin D, sowie die Manipulation der Zytoskelett-Membran Adhäsionspunkte durch Einzel-Mikroinjektion. Die Injektion von Neomycin verhindert die Anbindung von ERM-Proteinen an das Lipid Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) und bewirkt somit die Abkopplung des Zytoskeletts von der Plasmamembran. Als Gegenexperiment diente die Injektion des Lipids PIP2 selbst, welches zur Erhöhung der Anzahl der Zytoskelett-Membran Adhäsionspunkte führte. Weiterhin wurden die als Membranreservoire dienenden Mikrovilli durch den Entzug von Cholesterol entfernt. Auswirkung auf das Vorhandensein von Membranreservoiren hat ebenfalls die Veränderung des osmotischen Drucks innerhalb der Zellen. Zusätzlich wurden die elastischen Eigenschaften von apikalen Zellmembran-Fragmenten von konfluenten MDCK II Zellen untersucht, welche Aufschluss über die intrinsischen Membraneigenschaften ohne den Einfluss des Zytosols und Zytoskeletts geben konnten. Abschließend wurde die Mechanik von adhärierenden und spreitenden Zellen untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmamembran, bestehend aus einer Phospholipiddoppelschicht, lateral schwer ausdehnbar ist aufgrund ihrer flüssig-kristallinen Natur. Durch das Vorhandensein von dynamischen Membranreservoiren wie Mikrovilli, die schnell auf Veränderungen der Membranspannung durch Membranhomöostase reagieren, werden zellulare Prozesse wie die Zellmotilität oder die Anpassung an osmotischen Stress ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit gelang es gleichzeitig, die Membranspannung und die Verfügbarkeit von Membranfläche von adhärenten konfluenten als auch von adhärierenden und spreiten Zellen zu messen. Die durchgeführten Experimente ergaben ein detailliertes Bild wie sich die zelluläre Oberflächenregulierung in der Membranmechanik widerspiegelt.

No description available.

No description available.

During vertebrate development, gastrulation leads to the formation of three distinct germlayers. In zebrafish a central process is the delamination and the ingression of single cells from a common ancestor tissue - that will lead to the formation of the germlayers. Several molecules have been identified to regulate this process but the precise cellular mechanisms are poorly understood. Differential adhesiveness, a concept first introduced by Steinberg over 40 years ago, has been proposed to represent a key phenomena by which single hypoblast cells separate from the epiblast to form the mesendoderm at later stages. In this work it is shown that differential adhesion among the germlayer progenitor cells alone cannot predict germlayer formation. It is a combination of several mechanical properties such as cell cortex tension, cell adhesion and membrane mechanical properties that influence the migratory behavior of the constituent cells.

Caveolae sind charakteristische Plasmamembraneinstülpungen, die in vielen Zelltypen vorkommen und deren biologische Funktion umstritten ist. Ihre besondere Form und ihre Häu gkeit in Zellen, die stets mechanischen Belastungen ausgesetzt sind, führten zu der Annahme, dass Caveolae die Plasmamembran vor mechanischen Belastungen schützen und als Membranreservoir dienen. Dies sollte mit dieser Dissertation experimentell geprüft werden. Zunächst wurde der Ein uss der Caveolae auf die Membranspannung von Zellen im Normalzustand untersucht. Dann wurden die Zellen mechanisch belastet. Mit Fluoreszensmikroskopie wurde das Verschwinden von Caveolae nach Strecken der Zellen oder nach einem hypo-osmotischen Schock beobachtet. Messungen der Membranspannung vor und unmittelbar nach dem hypo-osmotischem Schock zeigten, dass Caveolae einen Anstieg der Membranspannung verhindern, unabhängig von ATP und dem Cytoskelett. Die Erzeugung von Membranvesikel mit Caveolae erlaubte es, diesen Effekt der Caveolae in einem vereinfachten Membransystem zu beobachten. Schliesslich wurden Muskelzellen untersucht. Zellen, die genetisch bedingt weniger Caveolae haben und mit Muskelschwundkrankheiten in Verbingung stehen, waren mechanisch weniger belastbar als gesunde Zellen. Zusammenfassend wird mit dieser Dissertation die These bestärkt, dass Caveolae einem Anstieg der Membranspannungen entgegenwirken. Dass dies in Zellen und in Vesikeln unabhängig von Energie und Cytoskelett geschieht, lässt auf einen passiven, mechanisch getriebenen Prozess schliessen. Diese Erkenntnis trägt zum Verständnis der Rolle von Caveolae in Zellen bei und kann dem besseren Verständnis von Krankheiten bedingt durch Caveolin-Mutationen, wie z.B. Muskelschwundkrankheiten, dienen. / Caveolae, the characteristic plasma membrane invaginations present in many cells, have been associated with numerous functions that still remain debated. Taking into account the particular abundance of caveolae in cells experiencing mechanical stress, it was proposed that caveolae constitute a membrane reservoir and bu er the membrane tension upon mechanical stress. The present work aimed to check this proposition experimentally. First, the in uence of caveolae on the membrane tension was studied on mouse lung endothelial cells in resting conditions using tether extraction with optically trapped beads. Second, experiments on cells upon acute mechanical stress showed that caveolae serve as a membrane reservoir bu ering surges in membrane tension in their immediate, ATP- and cytoskeleton-independent attening and disassembly. Third, caveolae incorporated in membrane vesicles also showed the tension bu ering. Finally, in a physiologically more relevant case, human muscle cells were studied, and it was shown that mutations with impaired caveolae which are described in muscular dystrophies render muscle cells less resistant to mechanical stress. In Summary the present work provides experimental evidence for the hypothesis that caveolae bu er the membrane tension upon mechanical stress. The fact that this was observed in cells and membrane vesicles in an ATP and cytoskeleton independent manner reveals a passive, mechanically driven process. This could be a leap forward in the comprehension of the role of caveolae in the cell, and in the understanding of genetic diseases like muscular dystrophies. / Cavéoles sont des invaginations caractéristiques de la membrane plas- mique présents dans beaucoup de types cellulaires. Ils sont liées à plusieurs fonctions cellulaires, ce qui sont encore débattues. Prenant compte de l importance des cavéoles dans les cellules soumises au stress mécanique, les cavéoles sont proposées de constituer un réservoir membranaire et de tamponner la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Cette étude a eu le but de tester cette hypothèse expérimentalement. En premier, l in uence des cavéoles sur la tension membranaire au repos a été étudiée sur des cellules endothéliales du poumon de la souris. Puis, on a montré que les cavéoles tamponnent l augmentation de la tension membranaire après l application d un stress mécanique. En suite, la réalisation des vésicules membranaires contenant des cavéoles a permit de montrer leur rôle comme réservoir membranaire dans un système simpli é. Finalement, dans un contexte physiologiquement plus relevant, l étude des cellules musculaires a montrée que les mutations du cavéolin associées aux dystrophies musculaires rendent les cellules moins résistante aux stresses mécaniques. En conclusion, cette étude supporte l\'hypothèse que les cavéoles tamponnent la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Le fait que cela se passe dans les cellules et les vésicules indépendamment d ATP et du cytosquelette révèlent un processus passif et mécanique. Cela pourrait servir à une meilleure compréhension du rôle des cavéoles dans la cellule et les maladies génétiques comme les dystrophies musculaires.

During vertebrate development, gastrulation leads to the formation of three distinct germlayers. In zebrafish a central process is the delamination and the ingression of single cells from a common ancestor tissue - that will lead to the formation of the germlayers. Several molecules have been identified to regulate this process but the precise cellular mechanisms are poorly understood. Differential adhesiveness, a concept first introduced by Steinberg over 40 years ago, has been proposed to represent a key phenomena by which single hypoblast cells separate from the epiblast to form the mesendoderm at later stages. In this work it is shown that differential adhesion among the germlayer progenitor cells alone cannot predict germlayer formation. It is a combination of several mechanical properties such as cell cortex tension, cell adhesion and membrane mechanical properties that influence the migratory behavior of the constituent cells.

No description available.

Caveolae sind charakteristische Plasmamembraneinstülpungen, die in vielen Zelltypen vorkommen und deren biologische Funktion umstritten ist. Ihre besondere Form und ihre Häu gkeit in Zellen, die stets mechanischen Belastungen ausgesetzt sind, führten zu der Annahme, dass Caveolae die Plasmamembran vor mechanischen Belastungen schützen und als Membranreservoir dienen. Dies sollte mit dieser Dissertation experimentell geprüft werden. Zunächst wurde der Ein uss der Caveolae auf die Membranspannung von Zellen im Normalzustand untersucht. Dann wurden die Zellen mechanisch belastet. Mit Fluoreszensmikroskopie wurde das Verschwinden von Caveolae nach Strecken der Zellen oder nach einem hypo-osmotischen Schock beobachtet. Messungen der Membranspannung vor und unmittelbar nach dem hypo-osmotischem Schock zeigten, dass Caveolae einen Anstieg der Membranspannung verhindern, unabhängig von ATP und dem Cytoskelett. Die Erzeugung von Membranvesikel mit Caveolae erlaubte es, diesen Effekt der Caveolae in einem vereinfachten Membransystem zu beobachten. Schliesslich wurden Muskelzellen untersucht. Zellen, die genetisch bedingt weniger Caveolae haben und mit Muskelschwundkrankheiten in Verbingung stehen, waren mechanisch weniger belastbar als gesunde Zellen. Zusammenfassend wird mit dieser Dissertation die These bestärkt, dass Caveolae einem Anstieg der Membranspannungen entgegenwirken. Dass dies in Zellen und in Vesikeln unabhängig von Energie und Cytoskelett geschieht, lässt auf einen passiven, mechanisch getriebenen Prozess schliessen. Diese Erkenntnis trägt zum Verständnis der Rolle von Caveolae in Zellen bei und kann dem besseren Verständnis von Krankheiten bedingt durch Caveolin-Mutationen, wie z.B. Muskelschwundkrankheiten, dienen.:I Introduction 9 1 Physical Description of Cellular Membranes 11 1.1 Membrane Physics at Equilibrium . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.1.1 Elastic Membrane Properties . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1.2 Mathematical Description of the Membrane . . . . . . 16 1.1.3 Membrane Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2 Techniques to Measure Mechanical Properties of Membranes . 20 1.2.1 The Micropipette Aspiration Technique . . . . . . . . . 21 1.2.2 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.2.3 Force and Radius of a Tether . . . . . . . . . . . . . . 25 2 From Vesicles to Cells 30 2.1 Structure of the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.2 Cytoskeleton of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.2.1 Actin Filaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.2.2 Actin Cortex Impairing Drugs . . . . . . . . . . . . . . 37 2.3 Cellular Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.4 Membrane Area and Membrane Tension Regulation . . . . 39 2.5 Tether Extraction From Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3 Caveolae 44 3.1 The De nition of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2 The Caveolin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.2.1 The Structure of Caveolin . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.3 The Cavin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 3.3.1 Cavin1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.2 Cavin2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.3 Cavin3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 3.3.4 Cavin4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 13.4 The Assembly of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . .54 3.4.1 Caveolin is Synthesized in the Endoplasmic Reticulum, and Assembles in The Golgi Apparatus .54 3.4.2 Cavin Enters the Stage for Caveola Formation . . . . . 56 3.4.3 The Lipid Composition of Caveolae . . . . . . . . . . . 59 3.5 Caveolae Are Stable Structures at the Plasma Membrane . . 60 3.6 Endocytosis of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.7 Caveolae/Caveolin Proteins and Signaling Processes . . . . . 62 3.7.1 Ion-pumps in Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.7.2 Regulation of eNOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.8 Caveolae in Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . .. . . . 64 3.8.1 Interaction Partners of Cav3 in Myotubes . . . . . . . 64 3.8.2 Muscular Dystrophies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 4 Mechanical Role of Caveolae 74 II Materials and Methods 82 5 Cells and Reagents 84 5.1 Cell Types and Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 5.1.1 HeLa-PFPIG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.3 Mouse Embryonic Fibroblast . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.1.4 Human Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.2 Treatments Altering the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.1 Expression of Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.2 Altering Actin Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.3 ATP depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.4 Cholesterol Depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.3 Vesicles out of Cellular Plasma Membranes . . . . . . . . . . . 91 5.3.1 Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMV) . . . . . . . 93 5.3.2 CytochalasinD-Blebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 5.3.3 Plasma Membrane Spheres (PMS) . . . . . . . . . . . . 94 6 Experimental Set-Up 96 6.1 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.1 Epi-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.2 Con-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 6.1.3 Cell Stage and Pipette Holder . . . . . . . . . . . . . . 102 6.1.4 Hypo-osmotic Shock System . . . . . . . . . . . . . . . 104 6.1.5 Fabrication of Micropipettes . . . . . . . . . . . . . . . 105 6.1.6 Aspiration Control System . . . . . . . . . . . . . . . . 106 6.1.7 Beads and Bead-coatings . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.8 Online Tracking with MatLab . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.9 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 6.2 TIRF-microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 6.2.1 TIRF Set-up . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 III Results 115 7 Tether Extraction From Adherent Cells 117 7.1 Typical Tether Force Traces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 7.2 Preliminary Remarks and Comments on the Relation Between Tether Force and Membrane Tension on Cells . . . . . . . . 120 8 Do Caveolae Contribute to Setting the Resting Cell Tension? 123 8.1 The E ective Tension of MLEC is A ected by the Presence Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 8.2 The E ective Tension in MEFs Does not Depend on the Presence of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 8.3 Challenging the E ective Cell Tension by Chemical and Biological Treatments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 8.3.1 Alterations of the Cytoskeleton Decrease the E ective Cell Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 8.3.2 ATP depletion Decreases the Membrane Tension . . . . 130 8.3.3 Interaction of Cav1 with Src-kinase . . . . . . . . . . . 131 8.3.4 Cav3 Re-establishes the Cell Tension of Cav1−/− MLEC 133 8.4 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 9 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering Upon Acute Mechanical Stress: Experiments on Cells 137 9.1 Application of Acute Mechanical Stress and Cell Response Observed by TIRF and EM . . . . . . . . . . . 137 9.1.1 Mechanical Stress Leads to the Partial Disappearance of Caveolae from the Plasma Membrane .138 9.1.2 Partial Disappearance of Caveolae Observed by EM . 144 9.2 Membrane Tension Measurements During Hypo-osmotic Shock 147 9.2.1 Caveolae are Required for Bu ering the Tension Surge Due to Hypo-osmotic Shock . . . . . . . . . . . . . . . 147 9.2.2 Clathrin Coated Pits do not Bu er the Membrane Tension 151 9.2.3 Disassembly of Caveolae During Mechanical Stress . . . 153 9.3 Correlation Between the Observed Loss of Caveolae and the Excess of Membrane Area Required to Bu er Membrane Tension 156 10 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering upon Mechanical Stress: Experiments on Plasma Membrane Spheres 159 10.1 Plasma Membrane Spheres Contain Caveolae and Are Devoid of Actin Filaments . . . . . 161 10.1.1 Production of PMS from HeLa-PGFPIG . . . . . . . . 161 10.1.2 Production of PMS from MLEC . . . . . . . . . . . . . 163 10.2 Micropipette Aspiration of PMS Induces Disassembly of Caveolae 166 10.2.1 Quantitative Analysis of Micropipette Aspiration of PMS 167 11 Experiments on Muscle Cells The Role of Caveolin-3 Mutations in Muscular Dystrophy 174 11.1 Tether Force of Di erentiated Muscle Cells . . . . . . . . . . . 176 11.2 Reaction of Myotubes with Cav3-Mutations upon Acute Mechanical Stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 11.3 Contracting Myotubes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .181 IV Discussion 182 12 Caveolae as a Security Device for the Cell Membrane 183 12.1 Comparison of Experimental Data with the Theoretical Model (Sens and Turner) . . . . . . . . . 186 13 Mechanical Stress and the Role of Caveolae in Signaling 189 14 Towards a Better Understanding of Muscular Dystrophies 191 15 Other Caveolin Related Diseases 194 V Appendices 196 A Cell Speci c Protocols 197 A.1 General Cell Handling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.1.1 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3 HeLa and Mouse Embryonic Fibroblast Cells . . . . . . . . . . 199 A.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3.2 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4 Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 A.4.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 B Cav1-Reconstitution in Lipid Vesicles 203 B.1 Puri cation of Cav1-GST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 B.2 puri cation of Cav1-His . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 B.3 Incorporation of Cav1 in Lipid Vesicles . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4 GUV Electro formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 5 B.5 Check of Cav1 Association with Lipids . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.2 Cav1-SUVs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.3 Run Sucrose Gradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.4 TCA precipitation and Western Blot . . . . . . . . . . 212 B.5.5 SDS Page . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 B.5.6 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 / Caveolae, the characteristic plasma membrane invaginations present in many cells, have been associated with numerous functions that still remain debated. Taking into account the particular abundance of caveolae in cells experiencing mechanical stress, it was proposed that caveolae constitute a membrane reservoir and bu er the membrane tension upon mechanical stress. The present work aimed to check this proposition experimentally. First, the in uence of caveolae on the membrane tension was studied on mouse lung endothelial cells in resting conditions using tether extraction with optically trapped beads. Second, experiments on cells upon acute mechanical stress showed that caveolae serve as a membrane reservoir bu ering surges in membrane tension in their immediate, ATP- and cytoskeleton-independent attening and disassembly. Third, caveolae incorporated in membrane vesicles also showed the tension bu ering. Finally, in a physiologically more relevant case, human muscle cells were studied, and it was shown that mutations with impaired caveolae which are described in muscular dystrophies render muscle cells less resistant to mechanical stress. In Summary the present work provides experimental evidence for the hypothesis that caveolae bu er the membrane tension upon mechanical stress. The fact that this was observed in cells and membrane vesicles in an ATP and cytoskeleton independent manner reveals a passive, mechanically driven process. This could be a leap forward in the comprehension of the role of caveolae in the cell, and in the understanding of genetic diseases like muscular dystrophies.:I Introduction 9 1 Physical Description of Cellular Membranes 11 1.1 Membrane Physics at Equilibrium . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.1.1 Elastic Membrane Properties . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1.2 Mathematical Description of the Membrane . . . . . . 16 1.1.3 Membrane Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2 Techniques to Measure Mechanical Properties of Membranes . 20 1.2.1 The Micropipette Aspiration Technique . . . . . . . . . 21 1.2.2 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.2.3 Force and Radius of a Tether . . . . . . . . . . . . . . 25 2 From Vesicles to Cells 30 2.1 Structure of the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.2 Cytoskeleton of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.2.1 Actin Filaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.2.2 Actin Cortex Impairing Drugs . . . . . . . . . . . . . . 37 2.3 Cellular Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.4 Membrane Area and Membrane Tension Regulation . . . . 39 2.5 Tether Extraction From Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3 Caveolae 44 3.1 The De nition of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2 The Caveolin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.2.1 The Structure of Caveolin . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.3 The Cavin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 3.3.1 Cavin1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.2 Cavin2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.3 Cavin3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 3.3.4 Cavin4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 13.4 The Assembly of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . .54 3.4.1 Caveolin is Synthesized in the Endoplasmic Reticulum, and Assembles in The Golgi Apparatus .54 3.4.2 Cavin Enters the Stage for Caveola Formation . . . . . 56 3.4.3 The Lipid Composition of Caveolae . . . . . . . . . . . 59 3.5 Caveolae Are Stable Structures at the Plasma Membrane . . 60 3.6 Endocytosis of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.7 Caveolae/Caveolin Proteins and Signaling Processes . . . . . 62 3.7.1 Ion-pumps in Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.7.2 Regulation of eNOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.8 Caveolae in Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . .. . . . 64 3.8.1 Interaction Partners of Cav3 in Myotubes . . . . . . . 64 3.8.2 Muscular Dystrophies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 4 Mechanical Role of Caveolae 74 II Materials and Methods 82 5 Cells and Reagents 84 5.1 Cell Types and Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 5.1.1 HeLa-PFPIG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.3 Mouse Embryonic Fibroblast . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.1.4 Human Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.2 Treatments Altering the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.1 Expression of Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.2 Altering Actin Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.3 ATP depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.4 Cholesterol Depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.3 Vesicles out of Cellular Plasma Membranes . . . . . . . . . . . 91 5.3.1 Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMV) . . . . . . . 93 5.3.2 CytochalasinD-Blebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 5.3.3 Plasma Membrane Spheres (PMS) . . . . . . . . . . . . 94 6 Experimental Set-Up 96 6.1 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.1 Epi-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.2 Con-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 6.1.3 Cell Stage and Pipette Holder . . . . . . . . . . . . . . 102 6.1.4 Hypo-osmotic Shock System . . . . . . . . . . . . . . . 104 6.1.5 Fabrication of Micropipettes . . . . . . . . . . . . . . . 105 6.1.6 Aspiration Control System . . . . . . . . . . . . . . . . 106 6.1.7 Beads and Bead-coatings . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.8 Online Tracking with MatLab . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.9 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 6.2 TIRF-microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 6.2.1 TIRF Set-up . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 III Results 115 7 Tether Extraction From Adherent Cells 117 7.1 Typical Tether Force Traces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 7.2 Preliminary Remarks and Comments on the Relation Between Tether Force and Membrane Tension on Cells . . . . . . . . 120 8 Do Caveolae Contribute to Setting the Resting Cell Tension? 123 8.1 The E ective Tension of MLEC is A ected by the Presence Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 8.2 The E ective Tension in MEFs Does not Depend on the Presence of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 8.3 Challenging the E ective Cell Tension by Chemical and Biological Treatments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 8.3.1 Alterations of the Cytoskeleton Decrease the E ective Cell Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 8.3.2 ATP depletion Decreases the Membrane Tension . . . . 130 8.3.3 Interaction of Cav1 with Src-kinase . . . . . . . . . . . 131 8.3.4 Cav3 Re-establishes the Cell Tension of Cav1−/− MLEC 133 8.4 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 9 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering Upon Acute Mechanical Stress: Experiments on Cells 137 9.1 Application of Acute Mechanical Stress and Cell Response Observed by TIRF and EM . . . . . . . . . . . 137 9.1.1 Mechanical Stress Leads to the Partial Disappearance of Caveolae from the Plasma Membrane .138 9.1.2 Partial Disappearance of Caveolae Observed by EM . 144 9.2 Membrane Tension Measurements During Hypo-osmotic Shock 147 9.2.1 Caveolae are Required for Bu ering the Tension Surge Due to Hypo-osmotic Shock . . . . . . . . . . . . . . . 147 9.2.2 Clathrin Coated Pits do not Bu er the Membrane Tension 151 9.2.3 Disassembly of Caveolae During Mechanical Stress . . . 153 9.3 Correlation Between the Observed Loss of Caveolae and the Excess of Membrane Area Required to Bu er Membrane Tension 156 10 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering upon Mechanical Stress: Experiments on Plasma Membrane Spheres 159 10.1 Plasma Membrane Spheres Contain Caveolae and Are Devoid of Actin Filaments . . . . . 161 10.1.1 Production of PMS from HeLa-PGFPIG . . . . . . . . 161 10.1.2 Production of PMS from MLEC . . . . . . . . . . . . . 163 10.2 Micropipette Aspiration of PMS Induces Disassembly of Caveolae 166 10.2.1 Quantitative Analysis of Micropipette Aspiration of PMS 167 11 Experiments on Muscle Cells The Role of Caveolin-3 Mutations in Muscular Dystrophy 174 11.1 Tether Force of Di erentiated Muscle Cells . . . . . . . . . . . 176 11.2 Reaction of Myotubes with Cav3-Mutations upon Acute Mechanical Stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 11.3 Contracting Myotubes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .181 IV Discussion 182 12 Caveolae as a Security Device for the Cell Membrane 183 12.1 Comparison of Experimental Data with the Theoretical Model (Sens and Turner) . . . . . . . . . 186 13 Mechanical Stress and the Role of Caveolae in Signaling 189 14 Towards a Better Understanding of Muscular Dystrophies 191 15 Other Caveolin Related Diseases 194 V Appendices 196 A Cell Speci c Protocols 197 A.1 General Cell Handling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.1.1 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3 HeLa and Mouse Embryonic Fibroblast Cells . . . . . . . . . . 199 A.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3.2 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4 Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 A.4.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 B Cav1-Reconstitution in Lipid Vesicles 203 B.1 Puri cation of Cav1-GST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 B.2 puri cation of Cav1-His . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 B.3 Incorporation of Cav1 in Lipid Vesicles . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4 GUV Electro formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 5 B.5 Check of Cav1 Association with Lipids . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.2 Cav1-SUVs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.3 Run Sucrose Gradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.4 TCA precipitation and Western Blot . . . . . . . . . . 212 B.5.5 SDS Page . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 B.5.6 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 / Cavéoles sont des invaginations caractéristiques de la membrane plas- mique présents dans beaucoup de types cellulaires. Ils sont liées à plusieurs fonctions cellulaires, ce qui sont encore débattues. Prenant compte de l importance des cavéoles dans les cellules soumises au stress mécanique, les cavéoles sont proposées de constituer un réservoir membranaire et de tamponner la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Cette étude a eu le but de tester cette hypothèse expérimentalement. En premier, l in uence des cavéoles sur la tension membranaire au repos a été étudiée sur des cellules endothéliales du poumon de la souris. Puis, on a montré que les cavéoles tamponnent l augmentation de la tension membranaire après l application d un stress mécanique. En suite, la réalisation des vésicules membranaires contenant des cavéoles a permit de montrer leur rôle comme réservoir membranaire dans un système simpli é. Finalement, dans un contexte physiologiquement plus relevant, l étude des cellules musculaires a montrée que les mutations du cavéolin associées aux dystrophies musculaires rendent les cellules moins résistante aux stresses mécaniques. En conclusion, cette étude supporte l\''hypothèse que les cavéoles tamponnent la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Le fait que cela se passe dans les cellules et les vésicules indépendamment d ATP et du cytosquelette révèlent un processus passif et mécanique. Cela pourrait servir à une meilleure compréhension du rôle des cavéoles dans la cellule et les maladies génétiques comme les dystrophies musculaires.:I Introduction 9 1 Physical Description of Cellular Membranes 11 1.1 Membrane Physics at Equilibrium . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.1.1 Elastic Membrane Properties . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1.2 Mathematical Description of the Membrane . . . . . . 16 1.1.3 Membrane Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2 Techniques to Measure Mechanical Properties of Membranes . 20 1.2.1 The Micropipette Aspiration Technique . . . . . . . . . 21 1.2.2 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.2.3 Force and Radius of a Tether . . . . . . . . . . . . . . 25 2 From Vesicles to Cells 30 2.1 Structure of the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.2 Cytoskeleton of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.2.1 Actin Filaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.2.2 Actin Cortex Impairing Drugs . . . . . . . . . . . . . . 37 2.3 Cellular Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.4 Membrane Area and Membrane Tension Regulation . . . . 39 2.5 Tether Extraction From Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3 Caveolae 44 3.1 The De nition of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2 The Caveolin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.2.1 The Structure of Caveolin . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.3 The Cavin Protein Family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 3.3.1 Cavin1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.2 Cavin2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.3 Cavin3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 3.3.4 Cavin4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 13.4 The Assembly of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . .54 3.4.1 Caveolin is Synthesized in the Endoplasmic Reticulum, and Assembles in The Golgi Apparatus .54 3.4.2 Cavin Enters the Stage for Caveola Formation . . . . . 56 3.4.3 The Lipid Composition of Caveolae . . . . . . . . . . . 59 3.5 Caveolae Are Stable Structures at the Plasma Membrane . . 60 3.6 Endocytosis of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.7 Caveolae/Caveolin Proteins and Signaling Processes . . . . . 62 3.7.1 Ion-pumps in Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.7.2 Regulation of eNOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.8 Caveolae in Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . .. . . . 64 3.8.1 Interaction Partners of Cav3 in Myotubes . . . . . . . 64 3.8.2 Muscular Dystrophies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 4 Mechanical Role of Caveolae 74 II Materials and Methods 82 5 Cells and Reagents 84 5.1 Cell Types and Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 5.1.1 HeLa-PFPIG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.3 Mouse Embryonic Fibroblast . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.1.4 Human Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.2 Treatments Altering the Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.1 Expression of Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.2.2 Altering Actin Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.3 ATP depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5.2.4 Cholesterol Depletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.3 Vesicles out of Cellular Plasma Membranes . . . . . . . . . . . 91 5.3.1 Giant Plasma Membrane Vesicles (GPMV) . . . . . . . 93 5.3.2 CytochalasinD-Blebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 5.3.3 Plasma Membrane Spheres (PMS) . . . . . . . . . . . . 94 6 Experimental Set-Up 96 6.1 Tether Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.1 Epi-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 6.1.2 Con-OT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 6.1.3 Cell Stage and Pipette Holder . . . . . . . . . . . . . . 102 6.1.4 Hypo-osmotic Shock System . . . . . . . . . . . . . . . 104 6.1.5 Fabrication of Micropipettes . . . . . . . . . . . . . . . 105 6.1.6 Aspiration Control System . . . . . . . . . . . . . . . . 106 6.1.7 Beads and Bead-coatings . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.8 Online Tracking with MatLab . . . . . . . . . . . . . . 108 6.1.9 Calibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 6.2 TIRF-microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 6.2.1 TIRF Set-up . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 III Results 115 7 Tether Extraction From Adherent Cells 117 7.1 Typical Tether Force Traces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 7.2 Preliminary Remarks and Comments on the Relation Between Tether Force and Membrane Tension on Cells . . . . . . . . 120 8 Do Caveolae Contribute to Setting the Resting Cell Tension? 123 8.1 The E ective Tension of MLEC is A ected by the Presence Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 8.2 The E ective Tension in MEFs Does not Depend on the Presence of Caveolae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 8.3 Challenging the E ective Cell Tension by Chemical and Biological Treatments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 8.3.1 Alterations of the Cytoskeleton Decrease the E ective Cell Tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 8.3.2 ATP depletion Decreases the Membrane Tension . . . . 130 8.3.3 Interaction of Cav1 with Src-kinase . . . . . . . . . . . 131 8.3.4 Cav3 Re-establishes the Cell Tension of Cav1−/− MLEC 133 8.4 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 9 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering Upon Acute Mechanical Stress: Experiments on Cells 137 9.1 Application of Acute Mechanical Stress and Cell Response Observed by TIRF and EM . . . . . . . . . . . 137 9.1.1 Mechanical Stress Leads to the Partial Disappearance of Caveolae from the Plasma Membrane .138 9.1.2 Partial Disappearance of Caveolae Observed by EM . 144 9.2 Membrane Tension Measurements During Hypo-osmotic Shock 147 9.2.1 Caveolae are Required for Bu ering the Tension Surge Due to Hypo-osmotic Shock . . . . . . . . . . . . . . . 147 9.2.2 Clathrin Coated Pits do not Bu er the Membrane Tension 151 9.2.3 Disassembly of Caveolae During Mechanical Stress . . . 153 9.3 Correlation Between the Observed Loss of Caveolae and the Excess of Membrane Area Required to Bu er Membrane Tension 156 10 Caveola-mediated Membrane Tension Bu ering upon Mechanical Stress: Experiments on Plasma Membrane Spheres 159 10.1 Plasma Membrane Spheres Contain Caveolae and Are Devoid of Actin Filaments . . . . . 161 10.1.1 Production of PMS from HeLa-PGFPIG . . . . . . . . 161 10.1.2 Production of PMS from MLEC . . . . . . . . . . . . . 163 10.2 Micropipette Aspiration of PMS Induces Disassembly of Caveolae 166 10.2.1 Quantitative Analysis of Micropipette Aspiration of PMS 167 11 Experiments on Muscle Cells The Role of Caveolin-3 Mutations in Muscular Dystrophy 174 11.1 Tether Force of Di erentiated Muscle Cells . . . . . . . . . . . 176 11.2 Reaction of Myotubes with Cav3-Mutations upon Acute Mechanical Stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 11.3 Contracting Myotubes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .181 IV Discussion 182 12 Caveolae as a Security Device for the Cell Membrane 183 12.1 Comparison of Experimental Data with the Theoretical Model (Sens and Turner) . . . . . . . . . 186 13 Mechanical Stress and the Role of Caveolae in Signaling 189 14 Towards a Better Understanding of Muscular Dystrophies 191 15 Other Caveolin Related Diseases 194 V Appendices 196 A Cell Speci c Protocols 197 A.1 General Cell Handling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.1.1 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 A.2 Mouse Lung Endothelial Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 A.2.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3 HeLa and Mouse Embryonic Fibroblast Cells . . . . . . . . . . 199 A.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 A.3.2 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4 Muscle Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.1 Cell Type Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.2 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 A.4.3 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 A.4.4 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 B Cav1-Reconstitution in Lipid Vesicles 203 B.1 Puri cation of Cav1-GST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 B.1.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 B.2 puri cation of Cav1-His . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 B.2.2 Puri cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 B.3 Incorporation of Cav1 in Lipid Vesicles . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 B.3.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4 GUV Electro formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 B.4.2 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 5 B.5 Check of Cav1 Association with Lipids . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 B.5.2 Cav1-SUVs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.3 Run Sucrose Gradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 B.5.4 TCA precipitation and Western Blot . . . . . . . . . . 212 B.5.5 SDS Page . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 B.5.6 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212