Cerca de um terço das mudas de cana-de-açúcar, plantadas no Estado de São Paulo, tem sido produzida por micropropagação. Quando se pratica micropropagação pretende-se conservar a integridade genética da planta doadora de explante, visto que a finalidade desta técnica é a obtenção de muitos clones com características idênticas às da planta doadora. Porém, tem-se observado elevados níveis de instabilidade fenotípica em plantas micropropagadas, como na variedade RB83-5486. Neste, trabalho utilizou-se a técnica do RAPD com a finalidade de detectar a variação induzida pela cultura de tecidos em cana-de-açúcar. Foram analisadas 48 plantas propagadas via colmos e 48 plantas micropropagadas (via cultura de meristema) da variedade RB83-5486. Calculou-se a taxa de polimorfismo a partir de 98 locos, sendo constatado um aumento do polimorfismo de 1,02% para 7,14%, com incremento de cerca de sete vezes na taxa de polimorfismo. Posteriormente, foram analisadas 50 plantas no campo, provenientes de dez meristemas nas cinco fases de repicagens, e 30 plantas in vitro provenientes de 5 meristemas nas seis fases de repicagens, em duas variedades. Encontrou-se taxas de polimorfismo variáveis em todas as fases do cultivo in vitro. E a variedade RB83-5486 mostrou ter um comportamento in vitro mais instável quando comparada com a variedade SP80-185. / Approximately a third part of sugar cane plants in São Paulo State has been produced by micropropagation. As far as micropropagation is concerned, it is desirable to preserve genetic integrity of the explant donor plant, since the aim of this technique is to obtain many clones with characteristics identical to the donor plant. However, high levels of phenotypic instability has been observed in micropropagated plants, such as variety RB83-5486. In the present work, RADP technique was employed in order to detect tissue culture-induced variations in sugar cane. Forty-eight plants propagated via stem and forty-eight micropropagated plants (via meristem culture) from variety RB83-5486 were analised. The polymorphism rate was calculated from ninety-eight loci and an increase from 1,02% to 7,14% was observed, representing approximately a sevenfold higher polymorphism rate. Fifty field-grown plants, from ten meristems at each one of the five subcultivation stages, and thirty in vitro plants from five meristems at each one of the six subcultivation stages, from two varieties were analysed. Different polymorphism rates were found at every in vitro cultivation phase. Concerning to the multiplication phase, we found variable polymorphism rates. Variety RB83- 5486 appeared to have a more unstable in vitro behavior than variety SP80-185.

O emprego da cultura de tecidos, órgãos ou plantas In vitro tem sido largamente utilizado como técnica de micropropagação com finalidade de estudar os vários fatores envolvidos no crescimento e desenvolvimento vegetal. O objetivo do presente trabalho foi estudar as condições fisiológicas relacionadas a diferentes respostas organogenéticas de natureza vegetativa e reprodutiva em plantas de Dendrobium Second Love (Orchidaceae) cultivadas in vitro. Foi possível analisar através da técnica de micropropagação de incubação de tais plantas no escuro as variações no potencial organogenético de seus segmentos caulinares apical e subapical em formar explantes para a regeneração de novas plantas in vitro e as decorrente variações morfológicas das plantas assim regeneradas. A referida técnica foi também empregada com a incubação dessas plantas no claro para gerar material suficiente ao estudo do envolvimento do TDZ, Z, ZR, iP, iPR na indução de seu brotamento e de sua floração. Foi possível assim a análise das variações tanto dos teores endógenos de açúcares solúveis quanto de etileno decorrentes da aplicação dessas citocininas, bem como aferir a influência da duração do tratamento e da idade da planta. Os resultados mostraram que a idade de incubação das plantas no escuro e no claro é importante não apenas para gerar novas plantas como também para induzir o seu brotamento e o florescimento. Sucessivas etapas de padronização evidenciaram que a causa principal da variação no potencial organogenético dos explantes utilizados derivou da região de origem da planta estiolada, bem como da idade do próprio tecido, sendo que um menor tempo de incubação no escuro levou a um aumento na porcentagem de regeneração das plantas, da mesma forma que um menor período de escuro tornou as plantas mais homogêneas em relação ao tamanho. Dentre as condições estudadas, todas as citocininas induziram brotamento, porém em relação ao florescimento apenas o TDZ mostrou-se eficaz. Pôde-se ainda verificar que um período de exposição de 10 dias no TDZ induziu as plantas à floração. Os níveis de açúcares solúveis dos brotos submetidos aos tratamentos com Z, ZR, iP, iPR e TDZ mostrou-se mais elevado naqueles tratados com TDZ sugerindo uma maior utilização de açúcares nas plantas induzidas a floração. Em relação ao acúmulo de etileno dentro dos frascos verificou-se, por fim, que as plantas tratadas com TDZ induziram maior acúmulo de etileno em relação às plantas controle. / In vitro tissues, organs or plants culture has been widely used as a micropropagation technique aiming to study a number of factors involved in vegetable growth and development. In the present study, we evaluated the physiological conditions related to different vegetative or reproductive organogenetic responses in in vitro Dendrobium Second Love (Orchidaceae) plants. We evaluated the organogenetic potential of the shoot segments in inducing explants for the regeneration of new in vitro plants and their morphological changes. This technique was also micropropagated with light incubation of the plants in order to provide enough material for the study of the participation of TDZ, Z, ZR, iP, iPR in the induction of their budding and its flowering. Thus, it was possible to analyze the endogenous levels of soluble sugars, ethylene concentration, following the application of these cytokinins, as well as evaluated the effect of treatment duration and the plant age. The results showed that the plant incubation age is not only important to generate new plants, but also to induce its budding and flowering, irrespective of the dark/light condition. Successives tests showed that the main reason for changes in the organogenetic potential of the explants was due to the etiolated plant region, as well the tissue age. In this sense, lower dark incubation length led to an increase in the percentage of plants regeneration, and to more homogeneous plant sizes. Among the studied conditions, all cytokinins induced budding, however concerning flowering only TDZ was effective. It was also verified that a 10-day exposure to TDZ can induce plants to flowering. The level of soluble sugars in the buds submitted to the treatment with Z, ZR, iP, iPR and TDZ was higher in the ones treated with TDZ, suggesting a higher sugar use in the plants induced flowering. Regarding the ethylene accumulation in the flasks, it was observed that plants treated with TDZ induced higher ethylene accumulation when compared to control plants.

Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.

O emprego da cultura de tecidos, órgãos ou plantas In vitro tem sido largamente utilizado como técnica de micropropagação com finalidade de estudar os vários fatores envolvidos no crescimento e desenvolvimento vegetal. O objetivo do presente trabalho foi estudar as condições fisiológicas relacionadas a diferentes respostas organogenéticas de natureza vegetativa e reprodutiva em plantas de Dendrobium Second Love (Orchidaceae) cultivadas in vitro. Foi possível analisar através da técnica de micropropagação de incubação de tais plantas no escuro as variações no potencial organogenético de seus segmentos caulinares apical e subapical em formar explantes para a regeneração de novas plantas in vitro e as decorrente variações morfológicas das plantas assim regeneradas. A referida técnica foi também empregada com a incubação dessas plantas no claro para gerar material suficiente ao estudo do envolvimento do TDZ, Z, ZR, iP, iPR na indução de seu brotamento e de sua floração. Foi possível assim a análise das variações tanto dos teores endógenos de açúcares solúveis quanto de etileno decorrentes da aplicação dessas citocininas, bem como aferir a influência da duração do tratamento e da idade da planta. Os resultados mostraram que a idade de incubação das plantas no escuro e no claro é importante não apenas para gerar novas plantas como também para induzir o seu brotamento e o florescimento. Sucessivas etapas de padronização evidenciaram que a causa principal da variação no potencial organogenético dos explantes utilizados derivou da região de origem da planta estiolada, bem como da idade do próprio tecido, sendo que um menor tempo de incubação no escuro levou a um aumento na porcentagem de regeneração das plantas, da mesma forma que um menor período de escuro tornou as plantas mais homogêneas em relação ao tamanho. Dentre as condições estudadas, todas as citocininas induziram brotamento, porém em relação ao florescimento apenas o TDZ mostrou-se eficaz. Pôde-se ainda verificar que um período de exposição de 10 dias no TDZ induziu as plantas à floração. Os níveis de açúcares solúveis dos brotos submetidos aos tratamentos com Z, ZR, iP, iPR e TDZ mostrou-se mais elevado naqueles tratados com TDZ sugerindo uma maior utilização de açúcares nas plantas induzidas a floração. Em relação ao acúmulo de etileno dentro dos frascos verificou-se, por fim, que as plantas tratadas com TDZ induziram maior acúmulo de etileno em relação às plantas controle. / In vitro tissues, organs or plants culture has been widely used as a micropropagation technique aiming to study a number of factors involved in vegetable growth and development. In the present study, we evaluated the physiological conditions related to different vegetative or reproductive organogenetic responses in in vitro Dendrobium Second Love (Orchidaceae) plants. We evaluated the organogenetic potential of the shoot segments in inducing explants for the regeneration of new in vitro plants and their morphological changes. This technique was also micropropagated with light incubation of the plants in order to provide enough material for the study of the participation of TDZ, Z, ZR, iP, iPR in the induction of their budding and its flowering. Thus, it was possible to analyze the endogenous levels of soluble sugars, ethylene concentration, following the application of these cytokinins, as well as evaluated the effect of treatment duration and the plant age. The results showed that the plant incubation age is not only important to generate new plants, but also to induce its budding and flowering, irrespective of the dark/light condition. Successives tests showed that the main reason for changes in the organogenetic potential of the explants was due to the etiolated plant region, as well the tissue age. In this sense, lower dark incubation length led to an increase in the percentage of plants regeneration, and to more homogeneous plant sizes. Among the studied conditions, all cytokinins induced budding, however concerning flowering only TDZ was effective. It was also verified that a 10-day exposure to TDZ can induce plants to flowering. The level of soluble sugars in the buds submitted to the treatment with Z, ZR, iP, iPR and TDZ was higher in the ones treated with TDZ, suggesting a higher sugar use in the plants induced flowering. Regarding the ethylene accumulation in the flasks, it was observed that plants treated with TDZ induced higher ethylene accumulation when compared to control plants.

Cerca de um terço das mudas de cana-de-açúcar, plantadas no Estado de São Paulo, tem sido produzida por micropropagação. Quando se pratica micropropagação pretende-se conservar a integridade genética da planta doadora de explante, visto que a finalidade desta técnica é a obtenção de muitos clones com características idênticas às da planta doadora. Porém, tem-se observado elevados níveis de instabilidade fenotípica em plantas micropropagadas, como na variedade RB83-5486. Neste, trabalho utilizou-se a técnica do RAPD com a finalidade de detectar a variação induzida pela cultura de tecidos em cana-de-açúcar. Foram analisadas 48 plantas propagadas via colmos e 48 plantas micropropagadas (via cultura de meristema) da variedade RB83-5486. Calculou-se a taxa de polimorfismo a partir de 98 locos, sendo constatado um aumento do polimorfismo de 1,02% para 7,14%, com incremento de cerca de sete vezes na taxa de polimorfismo. Posteriormente, foram analisadas 50 plantas no campo, provenientes de dez meristemas nas cinco fases de repicagens, e 30 plantas in vitro provenientes de 5 meristemas nas seis fases de repicagens, em duas variedades. Encontrou-se taxas de polimorfismo variáveis em todas as fases do cultivo in vitro. E a variedade RB83-5486 mostrou ter um comportamento in vitro mais instável quando comparada com a variedade SP80-185. / Approximately a third part of sugar cane plants in São Paulo State has been produced by micropropagation. As far as micropropagation is concerned, it is desirable to preserve genetic integrity of the explant donor plant, since the aim of this technique is to obtain many clones with characteristics identical to the donor plant. However, high levels of phenotypic instability has been observed in micropropagated plants, such as variety RB83-5486. In the present work, RADP technique was employed in order to detect tissue culture-induced variations in sugar cane. Forty-eight plants propagated via stem and forty-eight micropropagated plants (via meristem culture) from variety RB83-5486 were analised. The polymorphism rate was calculated from ninety-eight loci and an increase from 1,02% to 7,14% was observed, representing approximately a sevenfold higher polymorphism rate. Fifty field-grown plants, from ten meristems at each one of the five subcultivation stages, and thirty in vitro plants from five meristems at each one of the six subcultivation stages, from two varieties were analysed. Different polymorphism rates were found at every in vitro cultivation phase. Concerning to the multiplication phase, we found variable polymorphism rates. Variety RB83- 5486 appeared to have a more unstable in vitro behavior than variety SP80-185.

Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil. Como outras culturas de importância econômica, é também afetada por diversos patógenos como fungos, bactérias, vírus e fitoplasmas que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquitismo-da-soqueira da cana-de-açúcar (RSD). Esta doença não apresenta sintomas externos característicos de fácil reconhecimento. Dessa forma, a incidência do RSD pode não ser perceptível durante inspeções visuais de campo e, assim, ser facilmente disseminado de uma região para outra. A bactéria restrita ao xilema é transmitida mecanicamente de plantas infectadas para plantas saudáveis por meio da seiva presente em ferramentas de corte e em outros equipamentos durante o plantio, o cultivo e a colheita da cultura. Em razão da importância da cana-de-açúcar e do dano causado por Lxx, este trabalho visou avaliar a termoterapia e o cultivo in vitro em dois experimentos direcionados à obtenção de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 livres de Leifsonia xyli subsp. xyli e, assim, fornecer subsídio para o aprimoramento das medidas atuais de controle. O primeiro experimento combinou a termoterapia de toletes de uma gema (52 °C por 30 minutos) com o cultivo de meristemas apicais de três tamanhos (0,5 mm, 1,0 mm e 1,5 mm); o segundo combinou três tempos de termoterapia (1 hora, 2 horas e 3 horas) a 50 °C em gemas laterais imaturas isoladas do tolete com o cultivo in vitro. No primeiro experimento, os resultados de RT-PCR das amostras coletadas aos 15 dias na casa de vegetação mostraram que os três tamanhos de meristemas produziram plantas com títulos bacterianos em média 25 vezes mais baixos que suas genitoras, mas não as isentaram completamente de Lxx, com exceção de 8 plantas que não apresentaram Lxx com 90 dias de cultivo (4 plantas provenientes do cultivo de meristemas de 0,5 mm, 1 planta de meristema de 1,0 mm e 3 plantas de meristemas de 1,5 mm). Além disso, os meristemas de 0,5 mm não necessariamente regeneraram plantas com títulos mais baixos da bactéria quando comparados com os meristemas de 1,0 mm e 1,5 mm, mostrando que estes tamanhos testados não apresentaram correlação direta com o nível de infecção da planta regenerada por eles. Em relação ao segundo experimento, os resultados de RT-PCR mostraram que o incremento no tempo de termoterapia proporcionou maior redução nos títulos bacterianos, sendo os tratamentos de 2 horas e 3 horas os mais bem sucedidos com média de redução de 80,08% e 81,73%, respectivamente, mas não foi capaz de eliminar a bactéria. Portanto, estes experimentos demonstram que a termoterapia associada ao cultivo de tecidos é uma metodologia promissora, pois apresentaram redução da presença da bactéria Lxx em plantas de cana-de-açúcar, mas por não terem sido totalmente efetivos na eliminação da mesma, reforça a necessidade de estudos complementares. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil. Like other crops of economic importance, it\'s also affected by several pathogens such as fungus, bacteria, viruses and phytoplasmas that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting disease in sugarcane (RSD). This disease shows no external symptoms characteristic of easy recognition. Thus, the incidence of RSD may not be noticeable during visual inspection in the field and be easily spread from one region to another. The xylem-limited bacterium is transmitted mechanically from infected plants to healthy plants by the sap present in cutting tools and others equipments for planting, growing and harvesting the crop. Due to the importance of sugarcane and the damage caused by Lxx, this work aimed to evaluate thermotherapy and in vitro culture in two experiments in order to obtain sugarcane plants of variety SP80-3280 free from Leifsonia xyli subsp. xyli and thus provide subsidy for the improvement of current control methods. The first experiment combined thermotherapy on the individual bud (52 °C for 30 minutes) and the cultivation of apical meristems of three sizes (0,5 mm, 1,0 mm and 1,5 mm); the second combined three period of thermotherapy (1 hour, 2 hours and 3 hours) at 50 °C in immature lateral buds totally isolated from the tissue source followed by in vitro culture. In the first experiment, the results of RT-PCR samples collected at 15 days in the greenhouse showed that the three sizes of meristems produced plants with bacterial titers on average 25 times lower than their mother plants, but not completely exempted them from Lxx, except 8 plants that showed no Lxx after 90 days of cultivation (4 plants were from cultivation of meristems with 0,5 mm, 1 plant from 1,0 mm meristem and 3 plants from 1,5 mm meristems size). Furthermore, the meristems of 0,5 mm does not necessarily regenerate plants with lower title of the bacteria compared with the meristems of 1.0 mm and 1.5 mm, showing that these sizes tested did not present direct correlation with the level of infection on the plants regenerated from them. Regarding the second experiment, RT-PCR results showed that the increase in time of thermotherapy provided greater reduction in bacterial titers, and the treatments of 2 and 3 hours were the most successful with average reduction of 80,08 % and 81,73%, respectively, but was not able to eliminate the bacteria. Therefore, these experiments showed that thermotherapy associated with tissue culture is a promising methodology because it reduced titer of Lxx in sugarcane, but were not fully effective in eliminating the same, reinforcing the need for complementary studies.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil. Como outras culturas de importância econômica, é também afetada por diversos patógenos como fungos, bactérias, vírus e fitoplasmas que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquitismo-da-soqueira da cana-de-açúcar (RSD). Esta doença não apresenta sintomas externos característicos de fácil reconhecimento. Dessa forma, a incidência do RSD pode não ser perceptível durante inspeções visuais de campo e, assim, ser facilmente disseminado de uma região para outra. A bactéria restrita ao xilema é transmitida mecanicamente de plantas infectadas para plantas saudáveis por meio da seiva presente em ferramentas de corte e em outros equipamentos durante o plantio, o cultivo e a colheita da cultura. Em razão da importância da cana-de-açúcar e do dano causado por Lxx, este trabalho visou avaliar a termoterapia e o cultivo in vitro em dois experimentos direcionados à obtenção de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 livres de Leifsonia xyli subsp. xyli e, assim, fornecer subsídio para o aprimoramento das medidas atuais de controle. O primeiro experimento combinou a termoterapia de toletes de uma gema (52 °C por 30 minutos) com o cultivo de meristemas apicais de três tamanhos (0,5 mm, 1,0 mm e 1,5 mm); o segundo combinou três tempos de termoterapia (1 hora, 2 horas e 3 horas) a 50 °C em gemas laterais imaturas isoladas do tolete com o cultivo in vitro. No primeiro experimento, os resultados de RT-PCR das amostras coletadas aos 15 dias na casa de vegetação mostraram que os três tamanhos de meristemas produziram plantas com títulos bacterianos em média 25 vezes mais baixos que suas genitoras, mas não as isentaram completamente de Lxx, com exceção de 8 plantas que não apresentaram Lxx com 90 dias de cultivo (4 plantas provenientes do cultivo de meristemas de 0,5 mm, 1 planta de meristema de 1,0 mm e 3 plantas de meristemas de 1,5 mm). Além disso, os meristemas de 0,5 mm não necessariamente regeneraram plantas com títulos mais baixos da bactéria quando comparados com os meristemas de 1,0 mm e 1,5 mm, mostrando que estes tamanhos testados não apresentaram correlação direta com o nível de infecção da planta regenerada por eles. Em relação ao segundo experimento, os resultados de RT-PCR mostraram que o incremento no tempo de termoterapia proporcionou maior redução nos títulos bacterianos, sendo os tratamentos de 2 horas e 3 horas os mais bem sucedidos com média de redução de 80,08% e 81,73%, respectivamente, mas não foi capaz de eliminar a bactéria. Portanto, estes experimentos demonstram que a termoterapia associada ao cultivo de tecidos é uma metodologia promissora, pois apresentaram redução da presença da bactéria Lxx em plantas de cana-de-açúcar, mas por não terem sido totalmente efetivos na eliminação da mesma, reforça a necessidade de estudos complementares. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil. Like other crops of economic importance, it\'s also affected by several pathogens such as fungus, bacteria, viruses and phytoplasmas that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting disease in sugarcane (RSD). This disease shows no external symptoms characteristic of easy recognition. Thus, the incidence of RSD may not be noticeable during visual inspection in the field and be easily spread from one region to another. The xylem-limited bacterium is transmitted mechanically from infected plants to healthy plants by the sap present in cutting tools and others equipments for planting, growing and harvesting the crop. Due to the importance of sugarcane and the damage caused by Lxx, this work aimed to evaluate thermotherapy and in vitro culture in two experiments in order to obtain sugarcane plants of variety SP80-3280 free from Leifsonia xyli subsp. xyli and thus provide subsidy for the improvement of current control methods. The first experiment combined thermotherapy on the individual bud (52 °C for 30 minutes) and the cultivation of apical meristems of three sizes (0,5 mm, 1,0 mm and 1,5 mm); the second combined three period of thermotherapy (1 hour, 2 hours and 3 hours) at 50 °C in immature lateral buds totally isolated from the tissue source followed by in vitro culture. In the first experiment, the results of RT-PCR samples collected at 15 days in the greenhouse showed that the three sizes of meristems produced plants with bacterial titers on average 25 times lower than their mother plants, but not completely exempted them from Lxx, except 8 plants that showed no Lxx after 90 days of cultivation (4 plants were from cultivation of meristems with 0,5 mm, 1 plant from 1,0 mm meristem and 3 plants from 1,5 mm meristems size). Furthermore, the meristems of 0,5 mm does not necessarily regenerate plants with lower title of the bacteria compared with the meristems of 1.0 mm and 1.5 mm, showing that these sizes tested did not present direct correlation with the level of infection on the plants regenerated from them. Regarding the second experiment, RT-PCR results showed that the increase in time of thermotherapy provided greater reduction in bacterial titers, and the treatments of 2 and 3 hours were the most successful with average reduction of 80,08 % and 81,73%, respectively, but was not able to eliminate the bacteria. Therefore, these experiments showed that thermotherapy associated with tissue culture is a promising methodology because it reduced titer of Lxx in sugarcane, but were not fully effective in eliminating the same, reinforcing the need for complementary studies.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.