O miclobutanil é fungicida quiral da família dos triazóis, comercializado como mistura racêmica. Apesar dos enantiômeros apresentarem as mesmas propriedades físico-químicas, estes podem diferir em termos de atividade, metabolismo, excreção e toxicidade. No presente trabalho, foram realizados estudos in vitro enantiosseletivos de metabolismo empregando microssomas hepáticos de humanos cujos objetivos foram determinar os parâmetros cinéticos das enzimas do citocromo P450 (CYP450) após metabolismo do miclobutanil (na forma de racemato e enantiômeros isolados), determinar quais isoformas do CYP450 são responsáveis pelo metabolismo do praguicida e também a capacidade deste praguicida em inibir as principais enzimas do CYP450. Os estudos foram realizados empregando a mistura racêmica e também os enantiômeros isolados. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método para análise enantiosseletiva do miclobutanil em meio microssomal empregando a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas. A separação dos enantiômeros foi realizada na coluna Chiralpak AD® empregando metanol (100%) como fase móvel. Após a validação do método, os parâmetros cinéticos foram determinados, com valores de Vmáx, Km e CLint de 66,06 + 4,59 nmol min-1 mg-1, 3,61 + 0,88 ?mol L-1 e 18,30 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o substrato foi o racemato e de 305,50 + 18,39 nmol min-1 mg-1, 6,85 + 1,29 ?mol L-1 e 44,60 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o (+)-miclobutanil foi empregado como substrato. O (?)-miclobutanil não foi metabolizado pelas enzimas presentes nos microssomas hepáticos de humanos. As isoformas responsáveis pelo metabolismo do miclobutanil foram a CYP2C19 e a CYP3A4. Os estudos in vitro de inibição mostraram que o miclobutanil é um inibidor moderado das enzimas CYP2D6 e CYP2C9 um inibidor forte das enzimas CYP3A4/5 e CYP2C19. / Myclobutanil is a chiral triazole fungicide, sold as a racemic mixture. Although the enantiomers have the same physico-chemical properties, they may exhibit different bioactivity, metabolism, excretion and toxicity. In the present work, in vitro enantioselective metabolism studies were carried out by using human liver microsomes, aiming to determine the kinetic parameters of cytochrome P450 (CYP450) enzymes after myclobutanil metabolism and the main CYP450 isoforms involved in the metabolism. In addition, the myclobutanil inhibition capacity over the main CYP450 enzymes was evaluated. The studies were carried out with rac-myclobutanil as well as with the isolated enantiomers. To accomplish that, an enantioselective method for myclobutanil analysis was developed and validated by using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The separation of enantiomers was realized on a Chiralpak AD® column and methanol (100%) was used as mobile phase. The enzymatic kinetics, Vmáx, Km and CLint, were: 66.06 + 4.59 nmol min-1 mg-1, 3.61 + 0.88 ?mol L-1 and 18.30 mL min-1 mg-1, respectively, for rac-myclobutanil and 305.50 + 18.39 nmol min-1 mg-1, 6.85 + 1.29 ?mol L-1 and 44.60 mL min-1 mg-1, respectively, for the (+)-myclobutanil. The (?)-myclobutanil was not metabolized by CYP450 enzymes. The isoforms involved in myclobutanil metabolism were CYP2C19 and CYP3A4. In vitro inhibition studies showed that myclobutanil is a medium inhibitor of CYP2D6 and CYP2C9 enzymes and a strong inhibitor of CYP3A4/A5 and CYP2C19 enzymes.

A carambola (Avehrroa carambola L.) é uma rica fonte de vitaminas, sais minerais e antioxidantes. Seu formato de estrela, quando seccionada transversalmente, torna essa fruta muito valorizada na culinária. Contudo, nos últimos anos têm sido relatados alguns casos de intoxicação após ingestão desta fruta, relacionados, principalmente, a pacientes nefropatas. Sintomas como soluços intratáveis, agitação, confusão mental, vômito, convulsão e morte, decorrentes do status epilepticus (SE), foram descritos na maioria dos casos de intoxicação. Este quadro pode estar associado a presença de uma neurotoxina, caramboxina (CBX), que tem a capacidade de inibir o sistema de condução GABAérgico, além de atuar sobre os principais receptores glutamatérgicos, levando a ativação do mecanismo de excitotoxicidade neuronal. Há diversos modelos experimentais que buscam estudar os mecanismos ligados ao aparecimento do SE. Uma vez que a caramboxina pode estar relacionada com a indução do SE, estudos para melhor compreender seu metabolismo podem contribuir para sua possível aplicação em modelos experimentais de epilepsia. Portanto, este trabalho teve como objetivo estudar o metabolismo in vitro da caramboxina, utilizando microssomas hepáticos e modelo de oxidação biomimética. Um extrato metanólico foi preparado na proporção de 1:1 (m/v) e em seguida fracionado em coluna contendo sephadex LH-20. A fração contendo CBX foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para seu isolamento. Essa metodologia permitiu um rendimento superior ao descrito na literatura, permitindo que esta neurotoxina possa ser futuramente avaliada em modelos experimentais in vivo de epilepsia. Parte da CBX isolada foi avaliada em ensaios de metabolismo in vitro com microssomas hepáticos de ratos, no entanto, não foi observado formação de produtos de oxidação nas condições empregadas, o que pode sugerir que não ocorra metabolismo de fase I da CBX, corroborando com a proposta de rápida eliminação pela urina por pessoas saudáveis que ingerem carambola. A avaliação da oxidação da CBX por modelo biomimético, utilizando catalizador de Jacobsen e oxidante e iodosilbenzeno (PhIO), apresentou a formação de um metabólito, o qual poderá ser posteriormente utilizado nos estudos de mecanismo de ação da CBX / The Star fruit (Averrhoa carambola L.) is a good source of vitamins, minerals and antioxidants. Its star shape, when cross-sectioned, makes this fruit highly prized in cooking. However, in the last years some cases of intoxication after ingestion of this fruit, mainly related to nephropathy patients, have been reported. Symptoms such as intractable hiccups, agitation, mental confusion, vomiting, convulsion, and death, due to status epilepticus (SE), have been described in most cases of intoxication. These clinical conditions may be associated with the presence of a neurotoxin, caramboxine (CBX), which has the capacity to inhibit the GABAergic conduction system, in addition to acting on the main glutamatergic receptors, leading to activation of the mechanism of neuronal excitotoxicity. Several experimental models aim to study the mechanisms related to the appearance of the SE. Since caramboxin may be related to the induction of ES, studies to better understand its metabolism may contribute to its possible application in experimental models of epilepsy. Therefore, this work aimed to study the in vitro metabolism of caramboxin, using hepatic microsomes and biomimetic oxidation model. A methanolic extract was prepared in the ratio of 1: 1 (m / v) and then fractionated on a column containing LH-20 sephadex. The fraction containing CBX was submitted to high performance liquid chromatography (HPLC) for its isolation. This methodology allowed a higher yield than described in the literature, allowing this neurotoxin to be evaluated in vivo in experimental models of epilepsy. Part of the isolated CBX was evaluated in in vitro metabolism assays with hepatic microsomes of rats, however, no oxidation product formation was observed under the conditions employed, which may suggest that CBX phase I metabolism does not occur, corroborating with a proposal for rapid urinary elimination by healthy people who eat carambola. The evaluation of CBX oxidation by biomimetic model, using Jacobsen\'s catalyst and oxidant and iodosilbenzene (PhIO), presented the formation of a metabolite, which could be used in future CBX action mechanism studies.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.