FORTES, S.S. Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural Licarina A empregando microssomas hepático de humanos. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Muitos fármacos comercializados tiveram sua origem em produtos naturais e seus derivados. Devido ao grande potencial farmacológico destas novas moléculas pesquisadas, uma etapa importante e inicial no desenvolvimento de um novo fármaco é a avaliação do seu comportamento frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450), incluindo os estudos de interações medicamentosas. Neste contexto, um substrato que merece destaque é a Licarina A (Lic A). Este composto é uma neolignana encontrada em algumas espécies de plantas e vêm demonstrando várias propriedades biológicas promissoras, dentre elas destaca-se a atividade anti-leishimania. No entanto, para que esta substância com comprovada atividade se torne um fármaco é necessário realizar, na fase pré-clínica, estudos sobre seu perfil metabólico frente às enzimas do CYP450 e estudos de interação medicamentosa. Portanto, esta Tese teve como objetivo determinar os parâmetros enzimáticos utilizando microssomas hepáticos de humanos através do estudo de metabolismo in vitro com esta molécula e realizar estudos de interação medicamentosa através dos estudos de inibição enzimática e pesquisar a isoforma do CYP450 que metaboliza predominantemente este produto natural através do emprego de enzimas recombinantes de humanos. Primeiramente, foi desenvolvido um método analítico para a determinação do produto natural Licarina A em meio microssomal. As análises foram realizadas por cromatografia liquida de alta eficiência empregando a coluna Ascentis C18 e fase móvel composta por metanol: solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (75:25, v/v); a vazão empregada foi de 1,0 mL min-1. O método foi validado na faixa de concentração de 0,383 a 76,65 ?mol L-1, com coeficiente de correlação linear de 0,99 e limite de quantificação de 0,383 ?mol L-1. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. Após validação do método, estabeleceram-se as condições lineares para a depleção da Lic A no meio microssomal e posteriormente, a cinética foi determinada em condições de velocidade inicial utilizando para tanto 0,20 mg mL-1 de concentração de proteínas microssomais e 20 minutos de tempo de incubação. O comportamento observado na cinética enzimática para a depleção da Lic A foi um comportamento atípico, caracterizada pelo modelo cinético de Hill. Os valores de Vmax, S50 e coeficiente de Hill foram, 1,651 ?mol mg-1 min-1, 3,87 ?mol L-1 e 2,0 respectivamente. A partir dos parâmetros cinéticos o valor de clearance intrínseco (CLint) para a Lic A foi de 0,22 mL min-1 mg-1. Posteriormente, a correlação in vitro in vivo foi realizada e foi observado um clareance hepático (CLhep) de 20 mL min-1 kg-1 e taxa de extração hepática (E) de 1. As isoformas do CYP450 envolvidas no metabolismo da Lic A foram CYP 1A2 e 2B6. Os estudos de inibição mostraram que a Lic A é um inibidor fraco frente as isoformas do CYP450 estudadas, com valores de IC50 maiores do que 80 ?mol L-1. Embora já tenha sido estudada diferentes vias metabólicas da licarina A com vários metabólitos identificados, esta foi a primeira vez que foi observado a formação de um metabólito in vitro com o uso de microssomas hepático humano. Com o auxílio da espectrometria de massa foi possível a identificação do metabólito de m/z 343 [M+H]+, possivelmente um composto epoxidado, da licarina A. / FORTES, S.S. In vitro metabolism and enzymatic inhibition study of the natural product Licarin A employing human liver microsomes. 2017. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Many marketed drugs had their origin in natural products and their derivatives. Due to the biological potential of these new molecules, an important initial step in the development of a new drug is the evaluation of its behavior in front of cytochrome P450 enzymes (CYP 450), including studies of drug interactions. In this context, a substrate that deserves attention is Licarin A (Lic A). This compound is a neolignan found in some species of plants and several promising biological properties have been describing for this natural product, among them anti-leishimania activity. However, for this substance to become a drug, it is necessary to perform, in the preclinical phase, studies regarding its metabolic profile and drug interactions. Therefore, this thesis aimed to determine the enzymatic parameters by using human liver microsomes through in vitro metabolism study with this molecule and to conduct drug interaction studies through the enzyme inhibition studies and finally, to investigate the CYP450 isoforms that metabolize predominantly this natural product through the use of recombinant human enzymes. Firstly, an analytical method was developed for the quantification of the natural product Licarin A in microsomal medium. The analyzes were performed by high performance liquid chromatography employing an Ascentis C18 column and mobile phase composed of methanol: 0.1% formic acid aqueous solution (75:25, v / v); the flow rate used was 1.0 mL min-1. The method was validated in the concentration range of 0.333 to 76.65 ?mol L-1, with a linear correlation coefficient of 0.99 and a quantification limit of 0.333 ?mol L-1. Accuracy and precision showed results in agreement with ANVISA guidelines. After method validation, the linear conditions for depletion of Lic A in the microsomal medium were established. Subsequently, the kinetics were determined under initial velocity conditions using 0.20 mg mL-1 of microsomal protein concentration and 20 minutes of incubation time. The behavior observed in the enzymatic kinetics for the depletion of Lic A was an atypical behavior, characterized by the Hill kinetic model. The values of Vmax, S50 and Hill coefficient were 1.651 ?mol mg-1 min-1, 3.87 ?mol L-1 and 2.0, respectively. From the kinetic parameters, the intrinsic clearance (CLint) for Lic A was 0.22 mL min-1 mg-1. Subsequently, in vitro in vivo correlation was performed and a hepatic clareance (CLhep) of 20 mL min-1 kg-1 and a hepatic extraction rate (E) of 1 was observed. The CYP450 isoforms involved in the metabolism of Lic A were CYP 1A2 and 2B6. Inhibition studies have shown that Lic A is a weak CYP450 inhibitor, with IC50 values greater than 80 ?mol L-1. Although different metabolic pathways of licanin A have been studied and several metabolites were identified, this is the first report about the formation of an in vitro metabolite after metabolism by human liver microsomes. With the aid of mass spectrometry it was possible to identify the metabolite of m/z 343 [M+H]+, possibly an epoxidized compound, of licanin A.

O miclobutanil é fungicida quiral da família dos triazóis, comercializado como mistura racêmica. Apesar dos enantiômeros apresentarem as mesmas propriedades físico-químicas, estes podem diferir em termos de atividade, metabolismo, excreção e toxicidade. No presente trabalho, foram realizados estudos in vitro enantiosseletivos de metabolismo empregando microssomas hepáticos de humanos cujos objetivos foram determinar os parâmetros cinéticos das enzimas do citocromo P450 (CYP450) após metabolismo do miclobutanil (na forma de racemato e enantiômeros isolados), determinar quais isoformas do CYP450 são responsáveis pelo metabolismo do praguicida e também a capacidade deste praguicida em inibir as principais enzimas do CYP450. Os estudos foram realizados empregando a mistura racêmica e também os enantiômeros isolados. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método para análise enantiosseletiva do miclobutanil em meio microssomal empregando a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas. A separação dos enantiômeros foi realizada na coluna Chiralpak AD® empregando metanol (100%) como fase móvel. Após a validação do método, os parâmetros cinéticos foram determinados, com valores de Vmáx, Km e CLint de 66,06 + 4,59 nmol min-1 mg-1, 3,61 + 0,88 ?mol L-1 e 18,30 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o substrato foi o racemato e de 305,50 + 18,39 nmol min-1 mg-1, 6,85 + 1,29 ?mol L-1 e 44,60 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o (+)-miclobutanil foi empregado como substrato. O (?)-miclobutanil não foi metabolizado pelas enzimas presentes nos microssomas hepáticos de humanos. As isoformas responsáveis pelo metabolismo do miclobutanil foram a CYP2C19 e a CYP3A4. Os estudos in vitro de inibição mostraram que o miclobutanil é um inibidor moderado das enzimas CYP2D6 e CYP2C9 um inibidor forte das enzimas CYP3A4/5 e CYP2C19. / Myclobutanil is a chiral triazole fungicide, sold as a racemic mixture. Although the enantiomers have the same physico-chemical properties, they may exhibit different bioactivity, metabolism, excretion and toxicity. In the present work, in vitro enantioselective metabolism studies were carried out by using human liver microsomes, aiming to determine the kinetic parameters of cytochrome P450 (CYP450) enzymes after myclobutanil metabolism and the main CYP450 isoforms involved in the metabolism. In addition, the myclobutanil inhibition capacity over the main CYP450 enzymes was evaluated. The studies were carried out with rac-myclobutanil as well as with the isolated enantiomers. To accomplish that, an enantioselective method for myclobutanil analysis was developed and validated by using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The separation of enantiomers was realized on a Chiralpak AD® column and methanol (100%) was used as mobile phase. The enzymatic kinetics, Vmáx, Km and CLint, were: 66.06 + 4.59 nmol min-1 mg-1, 3.61 + 0.88 ?mol L-1 and 18.30 mL min-1 mg-1, respectively, for rac-myclobutanil and 305.50 + 18.39 nmol min-1 mg-1, 6.85 + 1.29 ?mol L-1 and 44.60 mL min-1 mg-1, respectively, for the (+)-myclobutanil. The (?)-myclobutanil was not metabolized by CYP450 enzymes. The isoforms involved in myclobutanil metabolism were CYP2C19 and CYP3A4. In vitro inhibition studies showed that myclobutanil is a medium inhibitor of CYP2D6 and CYP2C9 enzymes and a strong inhibitor of CYP3A4/A5 and CYP2C19 enzymes.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.