Steroidal glycoalkaloids (SGAs) are secondary metabolites produced by approximately 350 species in the Solanaceae family. SGAs are reported to be important for pest resistance and flavor enhancement at low concentrations but are toxic to humans and other mammals at high concentrations. Studies on sterol / SGA biosynthesis have implicated squalene synthase as a key regulatory enzyme because it catalyzes an irreversible step from the mevalonic acid pathway. However, the regulatory mechanisms of squalene synthase are not yet known. A study was conducted to elucidate the distribution pattern of SGAs and to clone the squalene synthase gene in order to determine a relationship between SGAs and gene expression levels. Solanum chacoense, a wild potato species was used as a model plant from which tissues were harvested at specified developmental stages and analyzed for SGA content. The results from the SGA analysis suggest a qualitative and quantitative tissue- and age-dependent accumulation of SGAs. Regenerative tissues such as, axiliary shoots, flowers and floral buds had the highest levels of 88, 49 and 63 µmole/g DW, respectively. The roots, stems and tubers showed the lowest amounts of SGAs of 1 to 8, 5 to 15 and 7 to 15 µmole/g DW, respectively. Stolons and tubers accumulated higher amounts of α-chaconine (59 to 67%) than α-solanine (61 to 64%) at all developmental stages analyzed. On the other hand, in young expanding, fully expanded, and old senescing leaves where leptine and leptinines tend to dominate, α-solanine and α-chaconine together accounted for only 8 to 15%, 7 to 15%, and 8 to 45%, respectively. Plant organs that showed the highest biosynthetic activity for SGA production also had high levels of transcripts coding for genes of isoprenoid biosynthesis. The results from the cloning and characterization of squalene synthase suggest that the cloned cDNA fragment is a putative S. chacoense squalene synthase gene with an open reading frame / predicted protein precursor of 411 amino acids. The cloned cDNA has high similarity (68-100%) to known plant squalene synthase genes and contains six deduced peptide domains observed in other species. The 3â untranslated regions of floral buds, young leaves (early vegetative stage), and fully expanded leaves (anthesis) were different in length with, 249, 335, and 202 nucleotides, respectively. The Southern blot analysis suggests a single copy gene although the existence of a gene family cannot be ruled out. / Ph. D.

A calêndula é uma planta medicinal de grande importância para indústria cosmética e farmacêutica. Existem poucos estudos sobre as necessidades hídricas e nutricionais das plantas medicinais. O controle do potencial matricial de água no solo pode ser uma alternativa de manejo de irrigação que favoreça a qualidade e produção de metabólitos secundários. O objetivo do experimento foi avaliar a resposta fisiológica e bioquímica da Calendula officinalis L. submetida a vários níveis de potencial matricial de água no solo para manejo da irrigação em três diferentes fases de desenvolvimento. O experimento foi conduzido em ambiente protegido sem controle de temperatura e umidade na Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\", Piracicaba, São Paulo. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com 6 tratamentos e 4 repetições, totalizando 24 unidades experimentais. Foram utilizadas sementes de calêndula bonina sortida para produção de mudas. As mudas foram transplantadas para vasos de 8 L para condução do experimento. Os potenciais matriciais adotados foram: -10, -15, -30, -40, -50 e -60 kPa. Foram realizados três ensaios distintos definidos de acordo com a fase de desenvolvimento: ciclo completo, fase vegetativa e fase reprodutiva/florescimento. O controle do potencial matricial de água no solo foi realizado utilizando tensiômetros de punção previamente instalados na profundidade de 20 cm. As leituras foram realizadas uma vez por semana com auxílio de tensímetro, desde o transplantio até a senescência das plantas. As irrigações foram realizadas por sistema de irrigação por gotejamento com gotejadores autocompensantes com vazão média de 3,92 L h-1. Os parâmetros analisados foram: taxa de crescimento relativo, massa seca de parte aérea, comprimento de raiz, volume de raiz, massa seca de raiz, produção de capítulos florais, massa seca de capítulos florais, relação raiz/parte aérea, produtividade de água, teor e rendimento de flavonoides totais e concentração de prolina. Os dados obtidos foram submetidos ao teste F, ao teste de normalidade de Komogorov-Smirnov e ao teste de Scott- Knott para comparação de médias. Os parâmetros que apresentaram diferenças entre os tratamentos foram submetidos à regressão. Foi utilizado o pacote estatístico Assistat 7.7 Beta. A taxa de crescimento relativo, a massa seca de parte aérea, o volume e massa seca de raiz, e a produção de capítulos florais apresentaram diferenças significativas apenas para o ensaio com estresse hídrico durante todo ciclo de desenvolvimento da calêndula. Para essas variáveis a diminuição da disponibilidade de água no solo apresentou resultados negativos para a planta. A massa seca de capítulos florais foi superior para o potencial matricial de -10 kPa durante a fase reprodutiva e ciclo completo. A produtividade de água foi superior para os potenciais matriciais de -30 e -40 kPa no ciclo completo e fase reprodutiva. O rendimento de flavonoides e a concentração de prolina apresentaram resultados inversamente proporcionais. A redução do rendimento de flavonoides com o decréscimo da disponibilidade de água no solo favoreceu o aumento da prolina. / Calendula is a medicinal plant of great importance in cosmetic and pharmaceutical industry. There are few studies on hydric and nutritional requirement of medicinal plants. The control of water with soil matric potential can be an alternative to the irrigation management that improve the quality and production of secondary metabolites. The objective of the experiment was to evaluate the physiological and biochemical response of Calendula officinalis L. subjected to various degree of water stress soil water for irrigation management in three different stages of development. The experiment was conducted in a greenhouse without temperature and humidity control in the Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\", Piracicaba, São Paulo. The experimental design was a randomized block design with 6 treatments and 4 repetitions, totaling 24 experimental units. The calendula bonina sortida seed were used to produce seedlings. The seedlings were transplanted to 8 L vessels to conduct the experiment. The potential matrices adopted were: -10, -15, -30, -40, -50 and -60 kPa. Three different tests were performed according to defined stages of development: full cycle, vegetative phase and reproductive/flowering stage. The control of the matric potential of soil water was performed using punch tensiometers previously installed at a depth of 20 cm. The measurements were performed with a tensiometer once a week, beginning the transplanting until senescence of plants. The irrigation was drip irrigation system with drip with flow of 4 L h-1. The parameters analyzed were: relative growth rate, dry weight of shoot, root length, root volume, root dry weight, production of floral chapters, dry mass of flower heads, root/shoot, water productivity, content and yield of total flavonoids and concentration of proline. The data were submitted to the test F, the normality test Komogorov -Smirnov and the Scott -Knott test for comparison of means. The parameters that show differences between treatments were submitted to regression. We used the statistical package Assistat 7.7 Beta . The relative growth rate, shoot dry weight, volume and root dry weight, and the production of floral chapter showed significant differences only for test water stress throughout the marigold development cycle. For these variables, decreased water availability in the soil was negative for the plant. The dry mass of floral chapter was superior to the matric potential of - 10 kPa during the reproductive phase and full cycle. The productivity of water was higher for the matric potentials of -30 and -40 kPa in the complete cycle and reproductive phase. The yield of flavonoids and proline concentration showed inversely proportional results. The reduction in the yield of flavonoids with decreased water availability occurred an increase of proline.

A calêndula é uma planta medicinal de grande importância para indústria cosmética e farmacêutica. Existem poucos estudos sobre as necessidades hídricas e nutricionais das plantas medicinais. O controle do potencial matricial de água no solo pode ser uma alternativa de manejo de irrigação que favoreça a qualidade e produção de metabólitos secundários. O objetivo do experimento foi avaliar a resposta fisiológica e bioquímica da Calendula officinalis L. submetida a vários níveis de potencial matricial de água no solo para manejo da irrigação em três diferentes fases de desenvolvimento. O experimento foi conduzido em ambiente protegido sem controle de temperatura e umidade na Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\", Piracicaba, São Paulo. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com 6 tratamentos e 4 repetições, totalizando 24 unidades experimentais. Foram utilizadas sementes de calêndula bonina sortida para produção de mudas. As mudas foram transplantadas para vasos de 8 L para condução do experimento. Os potenciais matriciais adotados foram: -10, -15, -30, -40, -50 e -60 kPa. Foram realizados três ensaios distintos definidos de acordo com a fase de desenvolvimento: ciclo completo, fase vegetativa e fase reprodutiva/florescimento. O controle do potencial matricial de água no solo foi realizado utilizando tensiômetros de punção previamente instalados na profundidade de 20 cm. As leituras foram realizadas uma vez por semana com auxílio de tensímetro, desde o transplantio até a senescência das plantas. As irrigações foram realizadas por sistema de irrigação por gotejamento com gotejadores autocompensantes com vazão média de 3,92 L h-1. Os parâmetros analisados foram: taxa de crescimento relativo, massa seca de parte aérea, comprimento de raiz, volume de raiz, massa seca de raiz, produção de capítulos florais, massa seca de capítulos florais, relação raiz/parte aérea, produtividade de água, teor e rendimento de flavonoides totais e concentração de prolina. Os dados obtidos foram submetidos ao teste F, ao teste de normalidade de Komogorov-Smirnov e ao teste de Scott- Knott para comparação de médias. Os parâmetros que apresentaram diferenças entre os tratamentos foram submetidos à regressão. Foi utilizado o pacote estatístico Assistat 7.7 Beta. A taxa de crescimento relativo, a massa seca de parte aérea, o volume e massa seca de raiz, e a produção de capítulos florais apresentaram diferenças significativas apenas para o ensaio com estresse hídrico durante todo ciclo de desenvolvimento da calêndula. Para essas variáveis a diminuição da disponibilidade de água no solo apresentou resultados negativos para a planta. A massa seca de capítulos florais foi superior para o potencial matricial de -10 kPa durante a fase reprodutiva e ciclo completo. A produtividade de água foi superior para os potenciais matriciais de -30 e -40 kPa no ciclo completo e fase reprodutiva. O rendimento de flavonoides e a concentração de prolina apresentaram resultados inversamente proporcionais. A redução do rendimento de flavonoides com o decréscimo da disponibilidade de água no solo favoreceu o aumento da prolina. / Calendula is a medicinal plant of great importance in cosmetic and pharmaceutical industry. There are few studies on hydric and nutritional requirement of medicinal plants. The control of water with soil matric potential can be an alternative to the irrigation management that improve the quality and production of secondary metabolites. The objective of the experiment was to evaluate the physiological and biochemical response of Calendula officinalis L. subjected to various degree of water stress soil water for irrigation management in three different stages of development. The experiment was conducted in a greenhouse without temperature and humidity control in the Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\", Piracicaba, São Paulo. The experimental design was a randomized block design with 6 treatments and 4 repetitions, totaling 24 experimental units. The calendula bonina sortida seed were used to produce seedlings. The seedlings were transplanted to 8 L vessels to conduct the experiment. The potential matrices adopted were: -10, -15, -30, -40, -50 and -60 kPa. Three different tests were performed according to defined stages of development: full cycle, vegetative phase and reproductive/flowering stage. The control of the matric potential of soil water was performed using punch tensiometers previously installed at a depth of 20 cm. The measurements were performed with a tensiometer once a week, beginning the transplanting until senescence of plants. The irrigation was drip irrigation system with drip with flow of 4 L h-1. The parameters analyzed were: relative growth rate, dry weight of shoot, root length, root volume, root dry weight, production of floral chapters, dry mass of flower heads, root/shoot, water productivity, content and yield of total flavonoids and concentration of proline. The data were submitted to the test F, the normality test Komogorov -Smirnov and the Scott -Knott test for comparison of means. The parameters that show differences between treatments were submitted to regression. We used the statistical package Assistat 7.7 Beta . The relative growth rate, shoot dry weight, volume and root dry weight, and the production of floral chapter showed significant differences only for test water stress throughout the marigold development cycle. For these variables, decreased water availability in the soil was negative for the plant. The dry mass of floral chapter was superior to the matric potential of - 10 kPa during the reproductive phase and full cycle. The productivity of water was higher for the matric potentials of -30 and -40 kPa in the complete cycle and reproductive phase. The yield of flavonoids and proline concentration showed inversely proportional results. The reduction in the yield of flavonoids with decreased water availability occurred an increase of proline.

O estudo químico das folhas e dos frutos de P. richardiaefolium resultou no isolamento de oito lignanas, sendo duas lignanas furofurânicas (sesamina e kobusina), quatro lignanas dibenzilbutirolactônicas (hinokinina, kusunokinina, arctigenina e haplomirfolina), duas lignanas dibenzilbutirolactólicas (cubebina e 3,4- dimetoxi-3,4-desmetilenodioxicubebina), dois cinamatos de bornila (ferulato de bornila e cumarato de bornila) e na identificação de duas amidas (piplartina e diidropiplartina). Das folhas de P. richardiaefolium foi extraído e analisado o óleo volátil. As estruturas das substâncias isoladas foram identificadas através de métodos espectroscópicos (RMN de 1H e de 13C e espectrometria de massas). O estudo de análise de componentes principais (PCA) das espécies Piper (P. truncatum - k 616, P. richardiaefolium - k 290, P. richardiaefolium - k 350, P. richardiaefolium - k 593, P. truncatum - k 597, P. pseudopotifolium - k 598, P. richardiaefolium - k 854, P. richardiaefolium - k 610, P. truncatum - k 112, P. pseudopotifolium - k 211 e P. cernuum - k 137) permitiu agrupar as espécies em dois grandes grupos e quatro subgrupos em relação à similaridade entre elas. Ligninas do caule de seis espécies de Piper foram extraídas utilizando o método de degradação de Klason e método de Bjorkman, e analisadas por métodos espectroscópicos (IV, RMN de 1H e de 13C). O método de degradação por oxidação por nitrobenzeno foi o escolhido para determinar a relação entre os monolignóis siringila e guaiacila. Os principais metabólitos das espécies estudadas foram comparados com os tipos de ligninas das mesmas espécies e os resultados sugeriram uma independência entre as vias biossintéticas de ligninas e lignanas. / The chemical study of leaves and the fruits of P. richardiaefolium resulted in the isolation of eight lignans, being two furofurânics lignans (sesamin and kobusin), four dibenzylbutirolactonics lignans (hinokinin, kusunokinin, arctigenin and haplomirfolin), two dibenzylbutirolactolics lignans (cubebin and 3\',4\'-dimethoxy-3,4- desmethylenedioxicubebin), two cinnamates (bornyl ferulate and bornyl cumarate) and in the identification of two amides (piplartine and dihydropiplartine). Of leaves of P. richardiaefolium was extracted and analyzed the volatile oil. The structures of isolated substances had been identified using the spectroscopic methods (1H and 13C NMR) and mass spectrometry. The study of principal components analysis (PCA) of the species Piper (P. truncatum - k 616, P. richardiaefolium - k 290, P. richardiaefolium - k 350, P. richardiaefolium - k 593, P. truncatum - k 597, P. pseudopotifolium - k 598, P. richardiaefolium - k 854, P. richardiaefolium - k 610, P. truncatum - k 112, P. pseudopotifolium - k 211 and P. cernuum - k 137) allowed the separation in two groups and four sub-groups. Lignins of stem of six species of Piper had been extracted using the method of degradation of Klason and method of Bjorkman, and analyzed for spectroscopic methods (IR, 1H and 13C NMR). The degradation method by nitrobenzene oxidation was chosen to determine the relationship between monolignols syringil and guaiacyl moieties. The major metabolities of the Piper species were compared to the lignins types of the same species and the results suggested independence between the biosynthetic pathways of lignins and lignans.

O estudo químico das folhas e dos frutos de P. richardiaefolium resultou no isolamento de oito lignanas, sendo duas lignanas furofurânicas (sesamina e kobusina), quatro lignanas dibenzilbutirolactônicas (hinokinina, kusunokinina, arctigenina e haplomirfolina), duas lignanas dibenzilbutirolactólicas (cubebina e 3,4- dimetoxi-3,4-desmetilenodioxicubebina), dois cinamatos de bornila (ferulato de bornila e cumarato de bornila) e na identificação de duas amidas (piplartina e diidropiplartina). Das folhas de P. richardiaefolium foi extraído e analisado o óleo volátil. As estruturas das substâncias isoladas foram identificadas através de métodos espectroscópicos (RMN de 1H e de 13C e espectrometria de massas). O estudo de análise de componentes principais (PCA) das espécies Piper (P. truncatum - k 616, P. richardiaefolium - k 290, P. richardiaefolium - k 350, P. richardiaefolium - k 593, P. truncatum - k 597, P. pseudopotifolium - k 598, P. richardiaefolium - k 854, P. richardiaefolium - k 610, P. truncatum - k 112, P. pseudopotifolium - k 211 e P. cernuum - k 137) permitiu agrupar as espécies em dois grandes grupos e quatro subgrupos em relação à similaridade entre elas. Ligninas do caule de seis espécies de Piper foram extraídas utilizando o método de degradação de Klason e método de Bjorkman, e analisadas por métodos espectroscópicos (IV, RMN de 1H e de 13C). O método de degradação por oxidação por nitrobenzeno foi o escolhido para determinar a relação entre os monolignóis siringila e guaiacila. Os principais metabólitos das espécies estudadas foram comparados com os tipos de ligninas das mesmas espécies e os resultados sugeriram uma independência entre as vias biossintéticas de ligninas e lignanas. / The chemical study of leaves and the fruits of P. richardiaefolium resulted in the isolation of eight lignans, being two furofurânics lignans (sesamin and kobusin), four dibenzylbutirolactonics lignans (hinokinin, kusunokinin, arctigenin and haplomirfolin), two dibenzylbutirolactolics lignans (cubebin and 3\',4\'-dimethoxy-3,4- desmethylenedioxicubebin), two cinnamates (bornyl ferulate and bornyl cumarate) and in the identification of two amides (piplartine and dihydropiplartine). Of leaves of P. richardiaefolium was extracted and analyzed the volatile oil. The structures of isolated substances had been identified using the spectroscopic methods (1H and 13C NMR) and mass spectrometry. The study of principal components analysis (PCA) of the species Piper (P. truncatum - k 616, P. richardiaefolium - k 290, P. richardiaefolium - k 350, P. richardiaefolium - k 593, P. truncatum - k 597, P. pseudopotifolium - k 598, P. richardiaefolium - k 854, P. richardiaefolium - k 610, P. truncatum - k 112, P. pseudopotifolium - k 211 and P. cernuum - k 137) allowed the separation in two groups and four sub-groups. Lignins of stem of six species of Piper had been extracted using the method of degradation of Klason and method of Bjorkman, and analyzed for spectroscopic methods (IR, 1H and 13C NMR). The degradation method by nitrobenzene oxidation was chosen to determine the relationship between monolignols syringil and guaiacyl moieties. The major metabolities of the Piper species were compared to the lignins types of the same species and the results suggested independence between the biosynthetic pathways of lignins and lignans.