This thesis aimed to investigate several fundamental and perplexing questions relating to the phloem loading and transport mechanisms of <i>Cucurbita maxima</i>, by combining metabolomic analysis with cell biological techniques. This putative symplastic loading species has long been used for experiments on phloem anatomy, phloem biochemistry, phloem transport physiology and phloem signalling. Symplastic loading species have been proposed to use a polymer trapping mechanism to accumulate RFO (raffinose family oligosaccharides) sugars to build up high osmotic pressure in minor veins which sustains a concentration gradient that drives mass flow. However, extensive evidence indicating a low sugar concentration in their phloem exudates is a long-known problem that conflicts with this hypothesis. Previous metabolomic analysis shows the concentration of many small molecules in phloem exudates is higher than that of leaf tissues, which indicates an active apoplastic loading step. Therefore, in the view of the phloem metabolome, a symplastic loading mechanism cannot explain how small molecules other than RFO sugars are loaded into phloem. <br><br> Most studies of phloem physiology using cucurbits have neglected the possible functions of vascular architecture in phloem transport. It is well known that there are two phloem systems in cucurbits with distinctly different anatomical features: central phloem and extrafascicular phloem. However, mistaken conclusions on sources of cucurbit phloem exudation from previous reports have hindered consideration of the idea that there may be important differences between these two phloem systems. <br><br> The major results are summarized as below:<br> 1) O-linked glycans in <i>C.maxima</i> were structurally identified as beta-1,3 linked glucose polymers, and the composition of glycans in cucurbits was found to be species-specific. Inter-species grafting experiments proved that these glycans are phloem mobile and transported uni-directionally from scion to stock.<br> 2) As indicated by stable isotopic labelling experiments, a considerable amount of carbon is incorporated into small metabolites in phloem exudates. However, the incorporation of carbon into RFO sugars is much faster than for other metabolites.<br> 3) Both CO2 labelling experiments and comparative metabolomic analysis of phloem exudates and leaf tissues indicated that metabolic processes other than RFO sugar metabolism play an important role in cucurbit phloem physiology.<br> 4) The underlying assumption that the central phloem of cucurbits continuously releases exudates after physical incision was proved wrong by rigorous experiments including direct observation by normal microscopy and combined multiple-microscopic methods. Errors in previous experimental confirmation of phloem exudation in cucurbits are critically discussed.<br> 5) Extrafascicular phloem was proved to be functional, as indicated by phloem-mobile carboxyfluorescein tracer studies. Commissural sieve tubes interconnect phloem bundles into a complete super-symplastic network.<br> 6) Extrafascicular phloem represents the main source of exudates following physical incision. The major transported metabolites by these extrafacicular phloem are non-sugar compounds including amino acids, O-glycans, amines.<br> 7) Central phloem contains almost exclusively RFO sugars, the estimated amount of which is up to 1 to 2 molar. The major RFO sugar present in central phloem is stachyose. <br> 8) Cucurbits utilize two structurally different phloem systems for transporting different group of metabolites (RFO sugars and non-RFO sugar compounds). This implies that cucurbits may use spatially separated loading mechanisms (apoplastic loading for extrafascicular phloem and symplastic loading for central phloem) for supply of nutrients to sinks. <br> 9) Along the transport systems, RFO sugars were mainly distributed within central phloem tissues. There were only small amounts of RFO sugars present in xylem tissues (millimolar range) and trace amounts of RFO sugars in cortex and pith. The composition of small molecules in external central phloem is very different from that in internal central phloem.<br> 10) Aggregated P-proteins were manually dissected from central phloem and analysed by both SDS-PAGE and mass spectrometry. Partial sequences of peptides were obtained by QTOF <i>de novo</i> sequencing from trypsin digests of three SDS-PAGE bands. None of these partial sequences shows significant homology to known cucurbit phloem proteins or other plant proteins. This proves that these central phloem proteins are a completely new group of proteins different from those in extrafascicular phloem. The extensively analysed P-proteins reported in literature to date are therefore now shown to arise from extrafascicular phloem and not central phloem, and therefore do not appear to be involved in the occlusion processes in central phloem. / Phloem transportiert ein ausgedehntes Spektrum an Molekülen zwischen Pflanzenorganen, um Wachstum und Entwicklung zu koordinieren. Folglich ist eine umfassende und unvoreingenommene Metabolom-Analyse notwendig, um unser Verständnis über den Transport von Stoffwechselprodukten sowie über Phloemtransport zu vertiefen. Phloemexsudate von Kürbispflanzen werden unter Verwendung der Metabolom-Analyse analysiert. Bei diesen Pflanzen wird angenommen, dass sie symplastische Beladungswege verwenden, um Photoassmilate als Ausgangsschritt des Phloemtransportes zu konzentrieren. Zwei neue Familien Callose-verwandter Substanzen, 1,3-Overknüpfte Glycane, sowie eine Reihe anderer kleinerer Metabolite werden in den Phloemexsudaten detektiert. Metabolom-Daten und physiologische Experimente widersprechen früher berichtetem Verständnis des Phloemexsudationsprozesses in Kürbispflanzen. Folglich bestätigt sich der Phloemexsudationsprozeß durch Kombination unterschiedlicher mikroskopischer Techniken. Kürbispflanzen besitzen zwei Phloemsysteme mit eindeutigen anatomischen Eigenschaften. Es zeigt sich, daß Phloemexsudate in Kürbissen hauptsächlich vom extrafaszikulären Phloem, nicht vom zentralen Phloem, stammen. In den letzten Jahrzehnten wurde gewöhnlich mißverstanden, daß Phloemexsudate vom zentralen Phloem stammen. Die eindeutigen metabolischen Profile der unterschiedlichen Phloemsysteme, die durch Metabolom-Analysen in der räumlichen Auflösung beobachtet werden, bestätigen die unterschiedlichen physiologischen Funktionen der zwei unterschiedlichen Phloemsysteme: das zentrale Phloem transportiert hauptsächlich Zucker, während das extrafaszikuläre Phloem ein ausgedehntes Spektrum von Metaboliten transportiert. Es kann auch ein unterschiedliches metabolisches Profil kleiner Moleküle zwischen internem und externem zentralem Phloem beobachtet werden. Von Strukturproteinen des zentralen Phloems wurden auch Proben genommen und mittels Massenspektrometrie analysiert. Diese Proteine erweisen sich als neuartige Proteine, die sich zu denen im extrafaszikulären Phloem unterscheiden. Dies bestätigt ferner den Funktionsunterschied der unterschiedlichen Phloemsysteme in Kürbispflanzen. Basierend auf diesen neuartigen Entdeckungen des Phloem-Metaboloms und dem vorhergehenden Wissen über den Phloemtransport in Kürbispflanzen, wird ein neues Modell vorgeschlagen, um den Mechanismus des Phloemtransports in der symplastischen Beladung zu verstehen.<br>

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21375号 / 農博第2299号 / 新制||農||1067(附属図書館) / 学位論文||H30||N5148(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻 / (主査)教授 入江 一浩, 教授 橋本 渉, 准教授 後藤 剛 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

Στην μετα-γονιδιωματική εποχή, την εποχή της συστημικής βιολογίας, η κατανόηση της πολυπλοκότητας της κυτταρικής φυσιολογίας απαιτεί την ανάλυση της δυναμικής των δικτύων βιομοριακών αλληλεπιδράσεων σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. Με τη σειρά της, η λειτουργική γονιδιωματική, ένας θεμελιώδης λίθος της συστημικής βιολογίας, στοχεύει στον πολυδιάστατο χαρακτηρισμό ενός γονιδίου, συνδυάζοντας δεδομένα από τις τεχνολογίες υψηλής απόδοσης. Είναι αυτή ακριβώς η ενοποίηση όλων των μοριακών προτύπων για ένα διαταραγμένο βιολογικό σύστημα που μπορεί να δώσει πληροφορίες αναφορικά με την λειτουργία ενός αγνώστου γονιδίου. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα Διπλωματική Εργασία αποτελεί μέρος της ολιστικής λειτουργικής ανάλυσης δύο αλληλεπιδρώντων, αγνώστου βιολογικού ρόλου, πρωτεϊνών, της DGCR14 και της FRA10AC1, οι οποίες έχουν απομονωθεί ως συστατικά του σωματιδίου συναρμογής και έχουν συσχετιστεί με νευρολογικές ασθένειες. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στην μεταβολομική μελέτη των μοριακών επιπτώσεων της υπερέκφρασης της DGCR14 σε ένα ανθρώπινο κυτταρικό μοντέλο, τα κύτταρα HeLa, με την χρήση της αέριας χρωματογραφίας - φασματομετρία μάζας. Ωστόσο, για να επιτευχθεί αυτό, θέματα σχετικά με τις δυνατότητες ποσοτικοποίησης των πολυβηματικών ομικών αναλύσεων έπρεπε να επιλυθούν. Μια σημαντική παράμετρος αφορά στην γρήγορη αδρανοποίηση των ενζυματικών διεργασιών έτσι ώστε οι αποκτηθέντες μετρήσεις να αντικατοπτρίζουν την πραγματική κυτταρική φυσιολογία. Για τον σκοπό αυτό, ο πειραματικός σχεδιασμός πρέπει να τροποποιείται κατάλληλα έτσι ώστε οποιεσδήποτε απαιτούμενες προ-αναλυτικές διαδικασίες χειρισμού των κυττάρων να έχουν ελάχιστη επίδραση στην φυσιολογία τους. Μελετήσαμε συνεπώς την επίδραση τεσσάρων πρωτοκόλλων συλλογής προσκολλημένων κυττάρων και δύο διαφορετικών διαλυμάτων έκπλυσης στο μεταβολικό πρότυπο κυττάρων HeLa. Τα μεταβολομικά δεδομένα αξιολογήθηκαν στο πλαίσιο της καρκινικής μεταβολικής φυσιολογίας και το πρωτόκολλο με την ελάχιστη δυνατή επίδραση στην κυτταρική φυσιολογία καθορίστηκε. Μεταξύ των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης, πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την μεταβολική φυσιολογία των αθανατοποιημένων κυτταρικών σειρών προέκυψαν, οι οποίες ενίσχυσαν σημαντικά την υπάρχουσα γνώση γύρω από τον καρκινικό μεταβολισμό, σε σταθερές ή μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Επακόλουθα, η βελτιστοποίηση της διαδικασίας συλλογής είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός αντιπροσωπευτικού μεταβολικού προτύπου κυττάρων HeLa πάνω στο οποίο πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης DGCR14 χωρίς να επισκιάζεται από πειραματικές αποκλίσεις εισαγόμενες από την διαδικασία χειρισμού των κυττάρων. Αναφορικά με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την DGCR14, η μεταβολομική ανάλυση εντόπισε μια αλλαγή φυσιολογίας συνδεόμενη με συγκεκριμένα μεταβολικά μονοπάτια τα οποία υποδηλώνουν έντονο μεταβολικό στρες. Για να διερευνήσουμε την συσχέτιση της υπερέκφρασης της DGCR14 με τον παραπάνω μεταβολικό φαινότυπο, χρησιμοποιήσαμε το ανακατασκευασμένο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματιδίου συναρμογής στον άνθρωπο και το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων στον άνθρωπο από την μετα-βάση δεδομένων PICKLE, προκειμένου να αντλήσουμε επιπλέον πληροφορίες για τον ρόλο της DGCR14 βάσει της θέσης της σε σχέση με άλλους κόμβους και υπερ-κόμβους. Μια πιθανή λειτουργική συσχέτιση της DGCR14 με αυτοφαγικούς και λυσοσωμικούς μηχανισμούς βρέθηκε, η οποία θα αξιολογηθεί και μελλοντικά μέσω της ανάλυσης, ξεχωριστά και συνδυαστικά, των μοριακών συνεπειών της υπερ- και υπο-έκφρασης σε όλα τα μοριακά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας. / In the post-genomic, systems biology era, developing a systems level understanding of a physiological process requires the analysis of biomolecular network dynamics at all molecular levels of cellular function. Likewise, functional genomics, an essential foundation of systems biology research, aims to define and analyze gene function at a global level by integrating data obtained from multiple high-throughput technologies. It is the integration of all the molecular profiles for a systematically perturbed system that can provide insight about the function of unknown genes. Along these lines, the present study is part of the systematic functional analysis of two interacting, but yet of unknown biological role, spliceosomal proteins, DGCR14 and FRA10AC1, that have both been implicated in neurological diseases. The present work focuses on studying the molecular consequences of DGCR14 overexpression in a human cell model, HeLa cells, at the metabolic level using Gas Chromatography-(ion trap) Mass Spectrometry. However, to succeed in this, issues regarding the quantification capabilities of the multistep omic analysis procedures needed to be resolved. A major concern refers to the fast quenching of any enzymatic processes, so that the acquired measurements indeed reflect the cellular physiology in vivo. To this end, the experimental design should be appropriately adjusted so that any required sample handling actions before quenching have a minimal effect on cellular physiology. Thus, we investigated the effect of four cell collection protocols and two different washing solutions on the intracellular metabolic profile measurements of a HeLa cell culture. The measurements were interpreted in the context of the known cancer cell metabolic physiology and the protocol with the minimum possible effect on cellular physiology was specified. Among the results of this study, valuable information about the metabolic physiology of the immortal cell line arise, which improved our knowledge about cancer metabolism under steady or varying environmental conditions. Subsequently, the optimization of the collection procedure enabled us to establish a representative metabolic profile of HeLa cells against which the overexpression of DGCR14 was evaluated without being obscured by the effect of the sample handling. Regarding the overexpressing cells, the metabolomic analysis detected a trend of physiological change connected to specific metabolic pathways indicating strong metabolic stress. To understand how DGCR14 overexpression generates this particular metabolic phenotype, we used the human spliceosomal complex protein-protein interaction (PPI) network and the integrated human PPI meta-database PICKLE to extract additional information about DGCR14 role based on its location with respect to other nodes and hubs. A possible functional correlation of DGCR14 to autophagic and lysosomal mechanisms was established, that will be further evaluated in the future through the analysis, separately and in combination, of the consequences of DGCR14 over- and under-expression at all molecular levels of cellular function.