Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Gabriel Padilla / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Resumo: Neste trabalho foi realizada a prospecção de novos genes de interesse biotecnológico em bibliotecas metagenômicas e em linhagens de Burkholderia através da técnica de reação em cadeia da polimerase. Nas bibliotecas metagenômicas, foi possível identificar genes que codificam álcool desidrogenase, oxirredutase, acil-CoA desidrogenase, luciferase, transportadores de membrana, thiolase, aminoglicosídeo fosfotransferase, desidrogenase de cadeia curta, proteínas repressoras TetR, enoil-CoA hidratase/isomerase, entre outras. Nas treze linhagens de Burkholderia testadas, seis apresentaram amplificação positiva para o gene de xilose isomerase. Estes genes foram completamente sequenciados e as sequências foram utilizadas em análises computacionais, que permitiram estabelecer a identidade entre as sequências e a dedução da função das proteínas baseado em similaridades. Foi realizada a medida do índice de adaptação de códons, com a finalidade de se encontrar um hospedeiro onde a expressão seja maximizada, baseando-se na presença de códons preferenciais e raros. Está análise mostrou que os genes encontrados possuem boas possibilidades de expressão em Escherichia coli, mas que podem apresentar uma taxa de expressão ineficiente em Saccharomyces cerevisiae. Foi realizado um teste de complementação gênica utilizando um dos genes descobertos e uma linhagem de Escherichia coli que possui o gene de xilose isomerase nocauteado. Os transformantes foram capazes de crescer em meio cuja única fonte de carbono era o açúcar xilose, mostrando que o gene é funcional. Estes genes serão utilizados futuramente em ensaios de expressão para caracterização da enzima / Abstract: In this work was carried out prospection for new genes of biotechnological interest in metagenomic libraries and strains of Burkholderia through the technique of polymerase chain reaction. In metagenomics libraries, we could identify genes encoding alcohol dehydrogenase, oxidoreductase, acyl-CoA dehydrogenase, luciferase, membrane transporters, thiolase, aminoglycoside phosphotransferase, short-chain dehydrogenase, TetR repressor protein, enoyl-CoA hydratase/isomerase, among others. Of the 13 strains of Burkholderia tested, 6 showed positive amplification for the xylose isomerase gene. The genes were completely sequenced and the sequences were used in computational analysis, which allowed to establish the identity between the sequences and deducing protein function based on similarities. We evaluated the codon adaptation index, with the aim of finding a host in which the expression is maximized, based on the presence of preferred codons and rare. This analysis showed that the genes found have good possibilities of expression in Escherichia coli, but that may have an inefficient rate of expression in Saccharomyces cerevisiae. We conducted a genetic complementation test using one of the discovered genes and one strain of Escherichia coli that has the xylose isomerase gene knocked out. Transformants were able to grow in a medium whose sole source of carbon was the sugar xylose, showing that the gene is functional. These genes will be used in expression assays for characterization of new enzymes / Doutor

Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Vanderlei Rodrigues / Resumo: Metabólitos secundários são compostos bioativos, com grande importância para a indústria farmacêutica e agropecuária, produzidos por certos grupos de microrganismos e plantas. Os policetídeos, que são sintetizados por complexos enzimáticos denominados policetídeos sintases (PKSs), desatacam-se entre os metabólitos secundários conhecidos e compõe a estrutura química básica de vários antibióticos. Todos os genes envolvidos na biossíntese de um policetídeo se encontram agrupados fisicamente no cromossomo, e contém genes que são altamente conservados, comumente chamados d~ pks mínima. Os métodos tradicionais para pesquisa de novas drogas, que envolvem o cultivo de microrganismos isolados do solo, não são mais tão promissores, devido à alta taxa de redescoberta de antibióticos já conhecidos, que chega a 99,9%, e à pequena parcela de microrganismos do solo que são cultiváveis pelas técnicas padrões de cultivo, cerca de 1 %. A Metagenômica é uma abordagem promissora que permite acessar o genoma desses organismos incultiváveis, pois consiste na extração de DNA diretamente do ambiente e construção de uma biblioteca com este genoma misto. Neste trabalho descrevemos a construção de uma biblioteca feita com DNA de alto peso molecular isolado diretamente de solo coletado sob arboreto de eucaliptos no Estado de São Paulo, Brasil. A biblioteca possui 9.320 clones e foi construída em vetor cosmídeo, com insertos de tamanho variando entre 30 e 45kb...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Secondary metabolites are bioactive compounds with great importance in the pharmaceutical and agriculture industries, procuced by a few groups of microrganisms and plants. The polyketides that are synthetized by enzimatic complexes, denominated polyketides synthases, outstand among the secondary known metabolites, which are part of the main structure of many antibiotics. Ali genes involved in the biosynthesis of antibiotics are found as clusters in the chromossome. The traditional methods for the research of new drugs that are made from microrganisms cultures isolated from the soil are not so promissing, due to the high rate of rediscorevy of already known species, reaching 99.9%. The other small piece of microrganisms are culturable by standards culture methods, reaching 1 % maximum. Metagenomics is a promissing approach that allows the access to genom of these organisms that are not culturable, as it is carried out by DNA extraction directly from the environment and construction of a mixed genomic library. In this work, we describe the construction of a library made from high molecular weight DNA isolated directly form the soi! undemeath a pinus forest in the State of São Paulo, Brazil. The library shows 9.320 dones and it was constructed in a cosmideo vector, with insert size ranging from 30 to 45 kb. Digestion with difterent restriction enzymes of cosmidial DNA randomly chosen allowed to visualize evident difterences in the restriction fragments among the clones, as does the possibility to determine the average insert size. The initial evaluation of the presence of genes involved in the biosynthesis of antibiotics synthesized by the enzymatic system PKS of kind I, was accomplished by the PCR amplification of clones from the library using specific primers. We studied 4.320 clones and the results suggest a great variety of these genes. The PCR products obtained were sequenced for the determination of identity of the amplified gene. / Mestre