Microbial nitrogen (N2) fixation supplies important nitrogen inputs to boreal peatlands, extremely oligotrophic ecosystems dominated by Sphagnum mosses. In this study, we coupled major and trace nutrient analyses and rate measurements to characterize interactions between N2 fixation and CH4 cycling at the S1 peat bog in Marcell Experimental Forest and the Zim bog (Minnesota, USA). Total dissolved inorganic nitrogen (NO3-+NO2-+NH4+) and phosphate were both consistently < 2 μM in the porewater of surface peat, indicating severe nutrient limitation. While dissolved Fe was fairly abundant (18-35 mM), Mo, V and Cu were scarce (2-40 nM), suggesting that alternative metalloenzymes containing Fe in place of other metals may be favored. Rates of diazotrophy measured by both 15N2 incorporation and the acetylene (C2H2) reduction assay (ARA) were 7-fold higher under anoxic vs. oxic incubations conducted at both 4°C and 25°C. No significant difference in N2 fixation rates measured by either method was observed with or without the amendment of 1% CH4 at 25 °C; however, a significant inhibitory effect by methane was seen at 4°C in material from the S1 bog hollows. Anoxic 15N2 incorporation was 3-4x higher in treatments lacking acetylene, suggesting that the ARA likely underestimates N2 fixation by inhibiting diazotrophs sensitive to C2H2. Aerobic methanotrophy was also inhibited by 1% C2H2 when incubated under oxic conditions. No observations for the production of ethane (C2H6) were detected during the ARA, a biomarker for alternative nitrogenase activity. Major differences in ARA rates were observed to vary locally within microhabitats and between two bogs. In June 2014, peat sampled from hollows incubated under anoxic conditions showed the highest ARA rates (94.9 ± 11.0 nmol C2H4 g-1 moss dry mass hr-1), while the lowest rates were observed in ix hummock samples incubated under oxic conditions (5.1 ± 0.8 nmol C2H4 g-1 moss dry mass hr-1) in the S1 bog (T3 site). Observed rates have the potential to be a function of oxygen concentrations and or water content. ARA rates in all microcosm treatments were significantly lower at Zim bog compared to the S1 bog. The developed conversion factor between the regression of 15N2 and ARA in this study was 3.9 and agrees with the theoretical conversion factor as well as previous studies of soils and forest mosses.

abstract: Evaluations of chemical energy supplies for redox reactions used by chemotrophs in water-rock hosted ecosystems are often done separately from evaluations of chemotroph diversity. However, given that energy is a fundamental and unifying parameter for life, much can be gained by evaluating chemical energy as an ecological parameter of water-rock hosted ecosystems. Therefore, I developed an approach that combines evaluation of chemical energy supplies with 16S and 18S rRNA gene amplicon sequencing. I used this approach to assess drivers of microbial distribution, diversity and activity in serpentinized fluids of the Samail Ophiolite of Oman and in hot springs in Yellowstone National Park. Through the application of the approach, microbiological interactions in serpentinized fluids were found to be more complex than anticipated. Serpentinized fluids are hyperalkaline and pH is often considered the driving parameter of microbial diversity, however hydrogenotrophic community composition varies in hyperalkaline fluids with similar pH. The composition of hydrogenotrophic communities in serpentinized fluids were found to correspond to the availability of the electron acceptor for hydrogenotrophic redox reactions. Specifically, hydrogenotrophic community composition transitions from being dominated by the hydrogenotrophic methanogen genus, Methanobacterium, when the concentration of sulfate is less than ~10 μm. Above ~10 μm, sulfate reducers are most abundant. Additionally, Methanobacterium was found to co-occur with the protist genus, Cyclidium, in serpentinized fluids. Species of Cyclidium are anaerobic and known to have methanogen endosymbionts. Therefore, Cyclidium may supply inorganic carbon evolved from fermentation to Methanobacterium, thereby mitigating pH dependent inorganic carbon limitation. This approach also revealed possible biological mechanisms for methane oxidation in Yellowstone hot springs. Measurable rates of biological methane oxidation in hot spring sediments are likely associated with methanotrophs of the phylum, Verrucomicrobia, and the class, Alphaproteobacteria. Additionally, rates were measurable where known methanotrophs were not detected. At some of these sites, archaeal ammonia oxidizer taxa were detected. Ammonia oxidizers have been shown to be capable of methane oxidation in other systems and may be an alternative mechanism for methanotrophy in Yellowstone hot springs. At the remaining sites, uncharacterized microbial lineages may be capable of carrying out methane oxidation in Yellowstone hot springs. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Microbiology 2020

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As áreas alagáveis naturais representam a mais importante fonte não-antropogênica de metano (CH4), com emissões estimadas entre 177 a 284 Tg ano-1, representando de 26 a 42% das emissões globais de CH4. A bacia do Rio Amazonas cobre uma grande porção dos trópicos úmidos, e a rede de drenagem deste rio excede a extensão de mais de um milhão de quilômetros quadrados. As grandes várzeas da bacia Amazônica são as maiores fontes naturais de CH4 desta região e estima-se que sua contribuição para as emissões totais de áreas alagadas no mundo seja na ordem de 5%. O CH4 produzido nas zonas anaeróbicas dos sedimentos por arquéias metanogênicas pode ser oxidado a CO2 pelos microrganismos metanotróficos. Com base na hipótese de que o fluxo de CH4 se altera sazonalmente em áreas alagáveis e que a microbiota presente está diretamente relacionada a esse processo, o presente estudo teve como objetivo geral avaliar a dinâmica dos genes funcionais envolvidos no ciclo do CH4 em épocas contrastantes, correlacionando com o fluxo do gás, variáveis ambientais e perfil taxonômico de Bacteria e Archaea em sedimentos de três áreas alagáveis e solo de floresta primária, da Amazônia Oriental (Belterra e Santarém-PA). Foram realizadas amostragem de gases, sedimentos e solo em duas épocas contrastantes (maio e outubro de 2016 - cheia e seca), para determinação da concentração de CH4 retido no sedimento durante a época cheia, cálculo do fluxo de CH4 durante a época seca, análises físico-químicas e extração de DNA dos sedimentos e solo para realização da qPCR dos genes funcionais mcrA e pmoA e dos genes marcadores filogenéticos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, e sequenciamento do gene 16S rRNA de Bacteria e Archaea. A partir das amostragens de gases, foi possível observar que as áreas alagáveis possuem potencial de atuarem como fonte de CH4 durante a época cheia, e como fonte ou dreno de metano durante a época seca, confirmado pelas análises de qPCR, uma vez que a abundância do gene pmoA aumenta durante a época seca. Já no solo de floresta, o gene mcrA foi considerado como não detectado, portanto, a floresta pode ser considerada somente como potencial dreno de CH4. O estimador ACE e o índice Shannon mostraram que os sedimentos de áreas alagáveis possuem maior riqueza e diversidade de Bacteria e Archaea quando comparados ao solo de floresta. Todas as áreas apresentaram perfis taxonômicos do domínio Bacteria semelhantes, porém, a grande diferença entre as comunidades está relacionada ao domínio Archaea. A comunidade de arqueias no solo de floresta é majoritariamente composta por representantes do filo Thaumarchaeota. O solo de floresta apresentou baixa abundância dos filos potencialmente produtores de CH4, Bathyarchaeota e Euryarchaeota, e o contrário foi observado nas áreas alagáveis. Os dados gerados no presente estudo incentivam a continuidade de trabalhos relacionados ao ciclo do CH4 em áreas alagáveis da bacia Amazônica, incluindo investigações acerca do papel do filo Bathyarchaeota nessas áreas, principalmente em relação ao ciclo do CH4 / Natural wetlands represent the most important non-anthropogenic source of methane (CH4), with emissions estimated of 177-284 Tg year-1, accounting for 26-42% of global CH4 emissions. The Amazon basin covers a large portion of the humid tropics, and the drainage network of this river exceeds the extent of more than one million square kilometers. The wetlands of the Amazon basin are the largest natural sources of CH4 in this region and it is estimated that their contribution to the total emissions of wetlands in the world is around 5%. The CH4 produced in the anaerobic zones of the sediments by methanogenic archaea can be oxidized to CO2 by the methanotrophic microorganisms. Based on the hypothesis that methane flux changes seasonally in wetlands and its microbiota is directly related to this process, this research has the main objective to evaluate the dynamics of the functional genes involved in the CH4 cycle in contrasting seasons, correlating with the CH4 flux, environmental variables and taxonomic profile of Bacteria and Archaea in three wetlands and one primary forest of the Eastern Amazon (Belterra and Santarém-PA). The sampling of gas, sediments and soil was performed in May and October 2016 (wet and dry seasons) to determine the concentration of CH4 retained in the sediment in the wet season, measurement of CH4 flux in the dry season, physicochemical properties and molecular analysis (qPCR of the mcrA, pmoA functional genes and phylogenetic marker genes 16S rRNA of Bacteria and Archaea and sequencing of the 16S rRNA gene of Bacteria and Archaea). From gas samplings, it was possible to observe that wetlands have the potential to act as source of CH4 during the wet season, and as a source or drain of CH4 during the dry season, confirmed by qPCR analyzes, due the abundance increases of the pmoA gene during the dry season. In the forest soil, the mcrA gene was not detected, therefore, the forest could be considered only as CH4 drain potential. The ACE estimator and the Shannon index showed that the sediments of wetlands have higher richness and diversity of Bacteria and Archaea when compared to the forest soil. All areas presented similar taxonomic profiles of Bacteria, however, the main difference between the communities is related to the Archaea. The archaeal community in the forest soil is mostly composed of representatives of the phylum Thaumarchaeota. The forest soil presented low abundance of the phyla with potential CH4 producers, Bathyarchaeota and Euryarchaeota, however the opposite was observed in the wetlands. The data generated in the present study encourage the continuity of work related to the CH4 cycle in wetlands of the Amazon basin, including investigations about the role of the Bathyarchaeota phylum in these areas, especially in relation to the CH4 cycle

Foi apresentado um sistema automatizado para monitorar fluxos de metano (CH4) e do dióxido de carbono (CO2) na relação da água/ar de ecossistemas aquáticos. Consiste em uma série de câmaras flutuantes dinâmicas acopladas a um analisador photo acústico infravermelho de gás. Associado os outros sensores atmosféricos e de qualidade da água, foi possível identificar os fatores atmosféricos, hidrológico e biológico que afetam emissões de CH4 e de CO2 no reservatório de Corumbá (estado de Goiás), uma terra inundada antropogenica de savana. O estudo realizado em novembro 2004 e em março/agosto 2005 permitiu uma inter-correlação desobstruídos de estabelecimento da câmara, embora relações ligadas da profundidade-fluxo. Os fluxos de CH4 borbulhando médios em novembro 2004, em março e em agosto 2005 eram respectivamente 0.05 ± 2.19, 4 ± 45 e 505 o ± 1192 mg/m2/d. Para os mesmos meses, as emissões de CH4 difusivo médias foram 17 o ± 6, 37 ± 9 e 69 o ± 28 mg/m2/d, visto que os fluxos difusivo do CO2 foram respectivamente 59 o ± 398, 385 ± 629 e o ± 1466 1223 mg/m2/d. Um aspecto interessante de bolhas de CH4 é a liberação repentina e grande em locais rasos e liberação do escoamento em locais profundos. Em uma base diária, a freqüência e o valor de bolhas de CH4 são condicionados à oxidação durante períodos da flutuação do lago, e às mudanças totais da pressão exercidas no sedimento. Em escalas de tempo sazonal, a intensidade de bolhas de CH4 é condicionada principalmente pela disponibilidade da carcaça ao metanogeneses. As frentes frias são responsáveis pela a ruptura da estratificação (misturar), favorecendo emissões do CO2 depois da oxidação CH4. As emissões do CO2 puderam também ser acopladas ao diel metanotrófico. Nossos resultados sugerem que as emissões de gás do efeito estufa de Corumbá estão controladas pela maior parte pelo nível de água e pela luz solar. / It was present an automated system for monitoring methane (CH4) and carbon dioxide (CO2) fluxes at the water/air interface of aquatic ecosystems. It consists of a series of floating dynamic chambers coupled to an infrared photo acoustic gas analyzer. Associated to other atmospheric and water quality sensors, it was possible to identify atmospheric, hydrologic and biological factors affecting CH4 and CO2 emissions at Corumbá reservoir (State of Goiás), a savanna anthropogenic flooded land. The study carried out in November 2004 and March/August 2005 allowed establishing clear chamber inter-correlations, although intricate depth-flux relations. Mean CH4 bubbling fluxes in November 2004, March and August 2005 were respectively 0.05 ± 2.19, 4 ± 45 and 505 ± 1192 mg/m2/d. For the same months, mean CH4 diffusive emissions were 17 ± 6, 37 ± 9 and 69 ± 28 mg/m2/d, whereas CO2 diffusive fluxes were respectively 59 ± 398, 385 ± 629 and 1466 ± 1223 mg/m2/d. An interesting aspect of CH4 bubbling is the sudden and large release at shallow sites and seepage release at deep sites. On a daily basis, the frequency and magnitude of CH4 bubbling is conditioned to oxidation during overturn periods, and to the total pressure changes exerted on the sediment. At seasonal time scales, CH4 bubbling intensity is mainly conditioned by substrate availability to methanogenesis. Cold fronts are responsible for stratification rupture (mixing), favoring CO2 emissions following CH4 oxidation. CO2 emissions might also be coupled to diel methanotrophy. Our results suggest that greenhouse gas emissions from Corumbá are largely controlled by water level and sunlight.

As áreas alagáveis naturais representam a mais importante fonte não-antropogênica de metano (CH4), com emissões estimadas entre 177 a 284 Tg ano-1, representando de 26 a 42% das emissões globais de CH4. A bacia do Rio Amazonas cobre uma grande porção dos trópicos úmidos, e a rede de drenagem deste rio excede a extensão de mais de um milhão de quilômetros quadrados. As grandes várzeas da bacia Amazônica são as maiores fontes naturais de CH4 desta região e estima-se que sua contribuição para as emissões totais de áreas alagadas no mundo seja na ordem de 5%. O CH4 produzido nas zonas anaeróbicas dos sedimentos por arquéias metanogênicas pode ser oxidado a CO2 pelos microrganismos metanotróficos. Com base na hipótese de que o fluxo de CH4 se altera sazonalmente em áreas alagáveis e que a microbiota presente está diretamente relacionada a esse processo, o presente estudo teve como objetivo geral avaliar a dinâmica dos genes funcionais envolvidos no ciclo do CH4 em épocas contrastantes, correlacionando com o fluxo do gás, variáveis ambientais e perfil taxonômico de Bacteria e Archaea em sedimentos de três áreas alagáveis e solo de floresta primária, da Amazônia Oriental (Belterra e Santarém-PA). Foram realizadas amostragem de gases, sedimentos e solo em duas épocas contrastantes (maio e outubro de 2016 - cheia e seca), para determinação da concentração de CH4 retido no sedimento durante a época cheia, cálculo do fluxo de CH4 durante a época seca, análises físico-químicas e extração de DNA dos sedimentos e solo para realização da qPCR dos genes funcionais mcrA e pmoA e dos genes marcadores filogenéticos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, e sequenciamento do gene 16S rRNA de Bacteria e Archaea. A partir das amostragens de gases, foi possível observar que as áreas alagáveis possuem potencial de atuarem como fonte de CH4 durante a época cheia, e como fonte ou dreno de metano durante a época seca, confirmado pelas análises de qPCR, uma vez que a abundância do gene pmoA aumenta durante a época seca. Já no solo de floresta, o gene mcrA foi considerado como não detectado, portanto, a floresta pode ser considerada somente como potencial dreno de CH4. O estimador ACE e o índice Shannon mostraram que os sedimentos de áreas alagáveis possuem maior riqueza e diversidade de Bacteria e Archaea quando comparados ao solo de floresta. Todas as áreas apresentaram perfis taxonômicos do domínio Bacteria semelhantes, porém, a grande diferença entre as comunidades está relacionada ao domínio Archaea. A comunidade de arqueias no solo de floresta é majoritariamente composta por representantes do filo Thaumarchaeota. O solo de floresta apresentou baixa abundância dos filos potencialmente produtores de CH4, Bathyarchaeota e Euryarchaeota, e o contrário foi observado nas áreas alagáveis. Os dados gerados no presente estudo incentivam a continuidade de trabalhos relacionados ao ciclo do CH4 em áreas alagáveis da bacia Amazônica, incluindo investigações acerca do papel do filo Bathyarchaeota nessas áreas, principalmente em relação ao ciclo do CH4 / Natural wetlands represent the most important non-anthropogenic source of methane (CH4), with emissions estimated of 177-284 Tg year-1, accounting for 26-42% of global CH4 emissions. The Amazon basin covers a large portion of the humid tropics, and the drainage network of this river exceeds the extent of more than one million square kilometers. The wetlands of the Amazon basin are the largest natural sources of CH4 in this region and it is estimated that their contribution to the total emissions of wetlands in the world is around 5%. The CH4 produced in the anaerobic zones of the sediments by methanogenic archaea can be oxidized to CO2 by the methanotrophic microorganisms. Based on the hypothesis that methane flux changes seasonally in wetlands and its microbiota is directly related to this process, this research has the main objective to evaluate the dynamics of the functional genes involved in the CH4 cycle in contrasting seasons, correlating with the CH4 flux, environmental variables and taxonomic profile of Bacteria and Archaea in three wetlands and one primary forest of the Eastern Amazon (Belterra and Santarém-PA). The sampling of gas, sediments and soil was performed in May and October 2016 (wet and dry seasons) to determine the concentration of CH4 retained in the sediment in the wet season, measurement of CH4 flux in the dry season, physicochemical properties and molecular analysis (qPCR of the mcrA, pmoA functional genes and phylogenetic marker genes 16S rRNA of Bacteria and Archaea and sequencing of the 16S rRNA gene of Bacteria and Archaea). From gas samplings, it was possible to observe that wetlands have the potential to act as source of CH4 during the wet season, and as a source or drain of CH4 during the dry season, confirmed by qPCR analyzes, due the abundance increases of the pmoA gene during the dry season. In the forest soil, the mcrA gene was not detected, therefore, the forest could be considered only as CH4 drain potential. The ACE estimator and the Shannon index showed that the sediments of wetlands have higher richness and diversity of Bacteria and Archaea when compared to the forest soil. All areas presented similar taxonomic profiles of Bacteria, however, the main difference between the communities is related to the Archaea. The archaeal community in the forest soil is mostly composed of representatives of the phylum Thaumarchaeota. The forest soil presented low abundance of the phyla with potential CH4 producers, Bathyarchaeota and Euryarchaeota, however the opposite was observed in the wetlands. The data generated in the present study encourage the continuity of work related to the CH4 cycle in wetlands of the Amazon basin, including investigations about the role of the Bathyarchaeota phylum in these areas, especially in relation to the CH4 cycle

Foi apresentado um sistema automatizado para monitorar fluxos de metano (CH4) e do dióxido de carbono (CO2) na relação da água/ar de ecossistemas aquáticos. Consiste em uma série de câmaras flutuantes dinâmicas acopladas a um analisador photo acústico infravermelho de gás. Associado os outros sensores atmosféricos e de qualidade da água, foi possível identificar os fatores atmosféricos, hidrológico e biológico que afetam emissões de CH4 e de CO2 no reservatório de Corumbá (estado de Goiás), uma terra inundada antropogenica de savana. O estudo realizado em novembro 2004 e em março/agosto 2005 permitiu uma inter-correlação desobstruídos de estabelecimento da câmara, embora relações ligadas da profundidade-fluxo. Os fluxos de CH4 borbulhando médios em novembro 2004, em março e em agosto 2005 eram respectivamente 0.05 ± 2.19, 4 ± 45 e 505 o ± 1192 mg/m2/d. Para os mesmos meses, as emissões de CH4 difusivo médias foram 17 o ± 6, 37 ± 9 e 69 o ± 28 mg/m2/d, visto que os fluxos difusivo do CO2 foram respectivamente 59 o ± 398, 385 ± 629 e o ± 1466 1223 mg/m2/d. Um aspecto interessante de bolhas de CH4 é a liberação repentina e grande em locais rasos e liberação do escoamento em locais profundos. Em uma base diária, a freqüência e o valor de bolhas de CH4 são condicionados à oxidação durante períodos da flutuação do lago, e às mudanças totais da pressão exercidas no sedimento. Em escalas de tempo sazonal, a intensidade de bolhas de CH4 é condicionada principalmente pela disponibilidade da carcaça ao metanogeneses. As frentes frias são responsáveis pela a ruptura da estratificação (misturar), favorecendo emissões do CO2 depois da oxidação CH4. As emissões do CO2 puderam também ser acopladas ao diel metanotrófico. Nossos resultados sugerem que as emissões de gás do efeito estufa de Corumbá estão controladas pela maior parte pelo nível de água e pela luz solar. / It was present an automated system for monitoring methane (CH4) and carbon dioxide (CO2) fluxes at the water/air interface of aquatic ecosystems. It consists of a series of floating dynamic chambers coupled to an infrared photo acoustic gas analyzer. Associated to other atmospheric and water quality sensors, it was possible to identify atmospheric, hydrologic and biological factors affecting CH4 and CO2 emissions at Corumbá reservoir (State of Goiás), a savanna anthropogenic flooded land. The study carried out in November 2004 and March/August 2005 allowed establishing clear chamber inter-correlations, although intricate depth-flux relations. Mean CH4 bubbling fluxes in November 2004, March and August 2005 were respectively 0.05 ± 2.19, 4 ± 45 and 505 ± 1192 mg/m2/d. For the same months, mean CH4 diffusive emissions were 17 ± 6, 37 ± 9 and 69 ± 28 mg/m2/d, whereas CO2 diffusive fluxes were respectively 59 ± 398, 385 ± 629 and 1466 ± 1223 mg/m2/d. An interesting aspect of CH4 bubbling is the sudden and large release at shallow sites and seepage release at deep sites. On a daily basis, the frequency and magnitude of CH4 bubbling is conditioned to oxidation during overturn periods, and to the total pressure changes exerted on the sediment. At seasonal time scales, CH4 bubbling intensity is mainly conditioned by substrate availability to methanogenesis. Cold fronts are responsible for stratification rupture (mixing), favoring CO2 emissions following CH4 oxidation. CO2 emissions might also be coupled to diel methanotrophy. Our results suggest that greenhouse gas emissions from Corumbá are largely controlled by water level and sunlight.