Objetivo: O presente estudo teve como objetivo verificar os efeitos do tratamento com altas e baixas doses de metotrexato (MTX) na reparação de fraturas mandibulares, num modelo experimental com ratos. Métodos: O modelo experimental empregado consiste na criação de um defeito ósseo na mandíbula do rato, semelhante a uma fratura. Oitenta ratos foram distribuídos em 4 grupos de 20 animais que receberam, por via intraperitoneal: soro fisiológico (controle) (1 ml, após a cirurgia); dexametasona (DX) (0,15 mg / kg, dose única após a cirurgia); alta dose MTX (1,6 mg / kg, semanalmente); baixa dose MTX, (0,25 mg / kg, semanalmente). Os animais foram sacrificados no dia 1º, 7º, 15º e 30º dia após a cirurgia. As mandíbulas foram submetidas à análise radiográfica para medir a distância entre os cotos ósseos e a área de osteotomia. Avaliação histomorfométrica foi realizada usando um software analisador de imagens digitalizadas para verificar a formação de cartilagem e óssea. Resultados: Os resultados revelaram não haver alterações significantes entre os tratamentos nos parâmetros avaliados nos 10 e 70 dias após a cirurgia. Animais do grupo controle sacrificados no 15º dia após a cirurgia tiveram uma redução da distância entre as extremidades ósseas e na área da osteotomia, bem como um grande aumento na formação de cartilagem. O padrão desses parâmetros nos animais tratados com baixas doses de MTX e DX não foram significativamente diferentes do grupo controle neste período. No entanto, os animais tratados com alta dose de MTX tiveram aumento da distância entre os cotos ósseos e da área da osteotomia, bem como foi praticamente nulo o aumento da formação de cartilagem. Sobre o 30º dia após a cirurgia, os animais do grupo controle tinham praticamente recuperado a região da fratura, bem como aqueles tratados com doses baixas de MTX. Os grupos tratados com a alta dose de MTX e DX mantiveram abertos os defeitos ósseos. Conclusões: Este estudo mostra claramente que a baixa dose de MTX não afetou a reparação óssea de fraturas mandibulares em ratos, em contraste com a alta dose de MTX, que afeta desfavoravelmente a regeneração óssea. / Purpose: The present study aims to verify the effect of high and low dose of methotrexate (MTX) treatment on bone repair of mandibular fractures in rats. Methods: The experimental model employed consists in creating a defect in rat mandible, similar to a fracture. Eighty rats were distributed in 4 groups of 20 animals that received, intraperitoneally: saline (1 ml, after surgery); dexametazone (DX, 0.15 mg/Kg, one dose at surgery); high dose MTX (1.6 mg/Kg, weekly); low dose MTX, (0.25 mg/Kg, weekly). Groups of five animals were sacrificed on the 1st, 7th, 15th and 30th day after surgery. Mandibles were submitted to radiographic analysis to measure the distance between bony edges and the area of osteotomy. Histopathological evaluation was performed in digitalized images using an analyzer software to examine cartilage and bone formation. Results: The treatments did not alter any evaluated parameters on days 1 and 7 after surgery. Control animals sacrificed on the 15th day after surgery had a reduction of the distance between bony ends and in the area of osteotomy, as well as a great increase in cartilage formation. The pattern of these parameters in animals treated with low dose MTX and DX did not differ from control group. However, animals treated with higher dose of MTX kept increasing the distance between bony ends and the area of osteotomy, and the increase in cartilage formation was practically inexistent. On the 30th day after surgery, control animals had pratically recovered the fracture region, as well as those treated with low dose MTX. The group treated with higher dose MTX and DX still had an open bone defect. Conclusions: This study clearly shows that low dose MTX did not affect bone healing of mandibular fractures in rats, in contrast to a higher dose, which promotes impairment of bone regeneration.

INTRODUÇÃO: A Artrite Reumatóide (AR) é caracterizada pelo aspecto inflamatório crônico articular e é a doença autoimune mais comum em todo o mundo. A categoria de medicamentos modificadores do curso da doença (MMCD) é dividido em dois grupos, sintéticos e biológicos. Há controversos estudos em relação a comparação entre estas alternativas, principalmente, devido ao elevado custo dos biológicos. O objetivo deste estudo foi realizar uma avaliação econômica do tratamento da AR, comparando a terapia combinada de MMCD sintéticos versus MMCD biológicos, utilizando de dados da literatura e de custo na perspectiva do SUS. MÉTODOS: Foi realizado uma revisão sistemática com metanálise das bases Medline e Embase os ensaios clínicos randomizados(ECR) que fizeram comparação direta entre o uso de MMCD sintéticos versus os MMCD biológicos. A remissão foi considerada para DAS28 < 2,6. Os itens que compõe o custo seguiram a diretrizes do Ministério da Saúde do Brasil e os valores foram recuperados da tabela do Sistema de Informação Ambulatorial do SUS, e do Sistema de Gerenciamento da Tabela de Procedimentos, Medicamentos e OPM do SUS, dados do ano 2016/2017. RESULTADOS: Foram incluídos 6 ECR. No seguimento de até 6 meses o RR=0,70 (IC95% 0,57 a 0,85) a favor dos biológicos. No seguimento entre 12 a 24 meses não houve diferença estatisticamente significante, RR=0,91 (IC95% 0,80 a 1,05). Um ano do tratamento com MMCDs combinado custa R$2445,60 e os Anti-TNF custa R$ 52.821,57. CONCLUSÃO: A remissão da atividade clínica da AR pode ser obtida pelo uso de DMARD sintéticos ou por Agentes Biológicos. Análise de custo-minimização mostrou que uma economia substancial a cada mês evitado de uso dos MMCD biológicos / INTRODUCTION: Rheumatoid arthritis (RA) is the most common autoimmune disease in the world, which leads to a chronic joint inflammation. There are two types of disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARD): synthetical and biological. The comparison between both drugs is controversial, mostly because of the high cost of the biological ones. The aim of this study was to develop an economic evaluation of RA treatments, comparing combined therapy with synthetic DMARD versus biological DMARD, based on literature review and cost analysis on SUS data. METHODS: Systematic review with meta-analysis of randomized clinical trials (RCT) was conducted on Medline and Embase database about direct comparisons of synthetic DMARD and biological DMARD. Remission was set for DAS28 < 2.6. Cost analysis was based on the guidelines of the Brazilian Ministry of Health and cost values were extracted from the SUS\'s Ambulatory Information System table, Management System of Procedures Table, and Medicine and OPM table, for 2016/2017. RESULTS: Six RCT were included. For six months follow-up, RR=0.70 (IC95% 0.57 to 0.85) in favour of biologicals. For 12-24 months follow-up, both DMARD were similar, RR=0.91 (IC95% 0.80 to 1.05). One-year treatment with DMARD costs R$2445,60 e Anti-TNF costs R$ 52.821,57. CONCLUSION: Remission of clinical activity of RA can be reached with synthetic or biologic DMARD. Minimizing-cost analysis showed a monthly expressive saving avoinding the biologic DMARD

Le méthotrexate (MTX), un agent anti-cancéreux fréquemment utilisé en chimiothérapie, requiert généralement un suivi thérapeutique de la médication (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) pour surveiller son niveau sanguin chez le patient afin de maximiser son efficacité tout en limitant ses effets secondaires. Malgré la fenêtre thérapeutique étroite entre l’efficacité et la toxicité, le MTX reste, à ce jour, un des agents anti-cancéreux les plus utilisés au monde. Les techniques analytiques existantes pour le TDM du MTX sont coûteuses, requièrent temps et efforts, sans nécessairement fournir promptement les résultats dans le délai requis. Afin d’accélérer le processus de dosage du MTX en TDM, une stratégie a été proposée basée sur un essai compétitif caractérisé principalement par le couplage plasmonique d’une surface métallique et de nanoparticules d’or. Plus précisément, l’essai quantitatif exploite la réaction de compétition entre le MTX et une nanoparticule d’or fonctionnalisée avec l’acide folique (FA-AuNP) ayant une affinité pour un récepteur moléculaire, la réductase humaine de dihydrofolate (hDHFR), une enzyme associée aux maladies prolifératives. Le MTX libre mixé avec les FA-AuNP, entre en compétition pour les sites de liaison de hDHFR immobilisés sur une surface active en SPR ou libres en solution. Par la suite, les FA-AuNP liées au hDHFR fournissent une amplification du signal qui est inversement proportionnelle à la concentration de MTX. La résonance des plasmons de surface (SPR) est généralement utilisée comme une technique spectroscopique pour l’interrogation des interactions biomoléculaires. Les instruments SPR commerciaux sont généralement retrouvés dans les grands laboratoires d’analyse. Ils sont également encombrants, coûteux et manquent de sélectivité dans les analyses en matrice complexe. De plus, ceux-ci n’ont pas encore démontré de l’adaptabilité en milieu clinique. Par ailleurs, les analyses SPR des petites molécules comme les médicaments n’ont pas été explorés de manière intensive dû au défi posé par le manque de la sensibilité de la technique pour cette classe de molécules. Les développements récents en science des matériaux et chimie de surfaces exploitant l’intégration des nanoparticules d’or pour l’amplification de la réponse SPR et la chimie de surface peptidique ont démontré le potentiel de franchir les limites posées par le manque de sensibilité et l’adsorption non-spécifique pour les analyses directes dans les milieux biologiques. Ces nouveaux concepts de la technologie SPR seront incorporés à un système SPR miniaturisé et compact pour exécuter des analyses rapides, fiables et sensibles pour le suivi du niveau du MTX dans le sérum de patients durant les traitements de chimiothérapie. L’objectif de cette thèse est d’explorer différentes stratégies pour améliorer l’analyse des médicaments dans les milieux complexes par les biocapteurs SPR et de mettre en perspective le potentiel des biocapteurs SPR comme un outil utile pour le TDM dans le laboratoire clinique ou au chevet du patient. Pour atteindre ces objectifs, un essai compétitif colorimétrique basé sur la résonance des plasmons de surface localisée (LSPR) pour le MTX fut établi avec des nanoparticules d’or marquées avec du FA. Ensuite, cet essai compétitif colorimétrique en solution fut adapté à une plateforme SPR. Pour les deux essais développés, la sensibilité, sélectivité, limite de détection, l’optimisation de la gamme dynamique et l’analyse du MTX dans les milieux complexes ont été inspectés. De plus, le prototype de la plateforme SPR miniaturisée fut validé par sa performance équivalente aux systèmes SPR existants ainsi que son utilité pour analyser les échantillons cliniques des patients sous chimiothérapie du MTX. Les concentrations de MTX obtenues par le prototype furent comparées avec des techniques standards, soit un essai immunologique basé sur la polarisation en fluorescence (FPIA) et la chromatographie liquide couplée avec de la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour valider l’utilité du prototype comme un outil clinique pour les tests rapides de quantification du MTX. En dernier lieu, le déploiement du prototype à un laboratoire de biochimie dans un hôpital démontre l’énorme potentiel des biocapteurs SPR pour utilisation en milieux clinique. / Methotrexate (MTX) cancer therapy requires therapeutic drug monitoring (TDM) for following its levels in a patient during the course of treatment in order to maximize efficacy while minimizing side effects. Despite its narrow therapeutic window, MTX remains until this date, one of the most employed chemotherapy agents. Existing TDM analytical techniques for MTX are costly, time-consuming and labor intensive which are not suitable to promptly generate results within the therapy timeframe. To provide rapid MTX quantification for TDM, a strategy is proposed based on a competitive assay featuring gold nanoparticles and surface plasmonic coupling. More specifically, the inhibition of MTX with its molecular receptor, human dihydrofolate reductase (hDHFR), an enzyme associated with proliferative diseases, is explored. Free MTX mixed with folic acid-functionalized gold nanoparticles (FA-AuNP) are in competition for hDHFR binding sites immobilized on a SPR active surface or free in solution. FA-AuNP binding to hDHFR provides signal amplification which is inversely proportional to the concentration of MTX. Surface plasmon resonance (SPR) is commonly used as a spectroscopic technique for the interrogation of biomolecular interactions. Current commercial SPR instruments are laboratory-based, bulky, expensive, lack sensitivity in complex matrix and have not shown adaptability in clinical settings. In addition, SPR analysis of small molecules such as drugs has not been extensively explored due to lack of sensitivity. The recent advances in materials science and surface chemistry exploiting gold nanoparticle integration for SPR response enhancement and peptide surface chemistry have shown potential in overcoming the poor sensitivity and surface-fouling limitations for crude biofluids analysis. These novel concepts of SPR technology are incorporated with a miniaturized fully integrated SPR prototype to conduct fast, reliable and sensitive analysis to monitor MTX levels of a patient undergoing chemotherapy. The objective of the thesis is to explore different strategies in improving drug analysis in a complex matrix using SPR biosensors and to put in perspective of the potential of SPR biosensors as a useful TDM tool in clinical laboratories or at a point-of-care situation. To achieve these objectives, a colorimetric solution-based MTX competitive assay is first established with FA-AuNP. Then, the solution-based MTX competitive assay is translated onto a SPR platform. For both developed assays, sensitivity, selectivity, detection limit, dynamic range optimization as well as analysis of methotrexate in complex matrix are inspected. Furthermore, the SPR prototype is validated by its equivalent performance to existing SPR systems and by its utility in executing MTX analysis in actual serum samples from patients undergoing chemotherapy. The concentrations of MTX obtained by SPR biosensing are compared to standard techniques: fluorescence polarization immunoassay (FPIA) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in order to confirm the feasibility of SPR biosensors as a useful clinical tool for performing rapid MTX concentration evaluation. Finally, the successful deployment of the prototype to a hospital laboratory demonstrates enormous prospective of SPR biosensors in clinical use.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire. Elle réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate, un co-facteur impliqué dans la biosynthèse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothérapie comme le méthotrexate (MTX), inhibant spécifiquement l’enzyme ce qui mène à un arrêt de la prolifération et ultimement à la mort cellulaire. Le MTX est utilisé pour le traitement de plusieurs maladies prolifératives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a mené au développement de mécanismes de résistance, qui réduisent l’efficacité de traitement. La présente étude se penche sur l’un des mécanismes de résistance, soit des mutations dans la DHFRh qui réduisent son affinité pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les éléments moléculaires requis pour la reconnaissance de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme. En parallèle, nous visons à identifier des variantes plus résistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de sélection en culture cellulaire pour des systèmes particuliers, tel que la culture de cellules hématopoïétiques souches (CHS), qui offrent des possibilités intéressantes dans le domaine de la thérapie cellulaire. Pour étudier le rôle des différentes régions du site actif, et pour vérifier la présence d’une corrélation entre des mutations à ces régions et une augmentation de la résistance au MTX, une stratégie combinatoire a été dévelopée pour la création de plusieurs banques de variantes à des résidus du site actif à proximité du MTX lié. Les banques ont été sélectionnées in vivo dans un système bactérien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 généra un nombre considérable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement résistantes au MTX. Les variantes les plus intéressantes ont été testées pour leur potentiel en tant que marqueur de sélection dans plusieurs lignées cellulaires, dont les cellules hématopoïétiques transduites. Une protection complète contre les effets cytotoxiques du MTX a été observée chez ces cellules suite à leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes moléculaires reliées à la résistance au MTX, des études de structure tridimensionnelle de variantes liées au MTX ont été entreprises. La résolution de la structure de la double variante F31R/Q35E lié au MTX a révélé que le phénotype de résistance était attribuable à d’importantes différences entre le site actif de la double variante et de l’enzyme native, possiblement dû à un phénomème dynamique. Une compréhension plus générale de la reconnaissance et la résistance aux antifolates a été réalisée en comparant des séquences et des structures de variantes de la DHFR résistants aux antifolates et provenant de différentes espèces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux éléments pour la comprehension des intéractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au développement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont généré de nouveaux gènes de résistance pouvant être utilisés en tant que marqueurs de sélection en biologie cellulaire. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an enzyme that is essential to cell proliferation. It reduces dihydrofolate to tetrahydrofolate, an important cofactor involved in purine and thymidylate biosynthesis. hDHFR is a choice target for chemotherapeutic drugs like methotrexate (MTX), which specifically inhibits the enzyme, stopping cell proliferation and leading to cellular death. MTX is used for the treatment of many proliferative diseases, including cancers. Widespread use of MTX has lead to the development of resistance mechanisms appear which impair treatment efficiency. The present work focuses on a mechanism of resistance, namely mutations in hDHFR that reduce its affinity for MTX, to better understand the underlying mechanisms of inhibitor recognition at the active site of the enzyme. In parallel, we aim at identifying the most MTX-resistant variants to offer novel selectable markers for particular cell culture systems, such as hematopoietic cell culture, which offer important perspectives for cellular therapy. To study the role of different regions of the hDHFR active site, and to verify if a correlation exists between mutations in these regions and increased resistance to MTX, a combinatorial strategy was developed enabling the creation of several hDHFR variant libraries at active site residues located in proximity to bound MTX. The libraries were selected in vivo in a bacterial system using culture media containing high concentration of the inhibitor. One library in particular, hDHFR 31/34/35, yielded a considerable number of highly MTX-resistant combinatorial hDHFR variants. The most interesting candidates were tested for their potential as selectable markers in various cell lines, including transduced hematopoietic cells. Complete protection from MTX-cytotoxicity was obtained for these cells following infection with the combinatorial variants. To better understand the molecular causes of MTX resistance, resolution of the crystal structures of variant proteins in presence of MTX was attempted. Resolution of the F31R/Q35E double variant revealed that the resistance phenotype was related to important differences in the active site relative to WT, possibly attributable to a dynamic motion effect. A more general comprehension of antifolate recognition and resistance was achieved by sequence and structural comparison of antifolate-resistant DHFR variants from different species. Overall, our work contributes to the better understanding of enzyme-inhibitor interactions, which could provide new insights into the development of more efficient clinical therapies. In addition, this work has yielded novel drug-resistance genes useful as selectable markers for cellular biology.

Le méthotrexate (MTX), un agent anti-cancéreux fréquemment utilisé en chimiothérapie, requiert généralement un suivi thérapeutique de la médication (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) pour surveiller son niveau sanguin chez le patient afin de maximiser son efficacité tout en limitant ses effets secondaires. Malgré la fenêtre thérapeutique étroite entre l’efficacité et la toxicité, le MTX reste, à ce jour, un des agents anti-cancéreux les plus utilisés au monde. Les techniques analytiques existantes pour le TDM du MTX sont coûteuses, requièrent temps et efforts, sans nécessairement fournir promptement les résultats dans le délai requis. Afin d’accélérer le processus de dosage du MTX en TDM, une stratégie a été proposée basée sur un essai compétitif caractérisé principalement par le couplage plasmonique d’une surface métallique et de nanoparticules d’or. Plus précisément, l’essai quantitatif exploite la réaction de compétition entre le MTX et une nanoparticule d’or fonctionnalisée avec l’acide folique (FA-AuNP) ayant une affinité pour un récepteur moléculaire, la réductase humaine de dihydrofolate (hDHFR), une enzyme associée aux maladies prolifératives. Le MTX libre mixé avec les FA-AuNP, entre en compétition pour les sites de liaison de hDHFR immobilisés sur une surface active en SPR ou libres en solution. Par la suite, les FA-AuNP liées au hDHFR fournissent une amplification du signal qui est inversement proportionnelle à la concentration de MTX. La résonance des plasmons de surface (SPR) est généralement utilisée comme une technique spectroscopique pour l’interrogation des interactions biomoléculaires. Les instruments SPR commerciaux sont généralement retrouvés dans les grands laboratoires d’analyse. Ils sont également encombrants, coûteux et manquent de sélectivité dans les analyses en matrice complexe. De plus, ceux-ci n’ont pas encore démontré de l’adaptabilité en milieu clinique. Par ailleurs, les analyses SPR des petites molécules comme les médicaments n’ont pas été explorés de manière intensive dû au défi posé par le manque de la sensibilité de la technique pour cette classe de molécules. Les développements récents en science des matériaux et chimie de surfaces exploitant l’intégration des nanoparticules d’or pour l’amplification de la réponse SPR et la chimie de surface peptidique ont démontré le potentiel de franchir les limites posées par le manque de sensibilité et l’adsorption non-spécifique pour les analyses directes dans les milieux biologiques. Ces nouveaux concepts de la technologie SPR seront incorporés à un système SPR miniaturisé et compact pour exécuter des analyses rapides, fiables et sensibles pour le suivi du niveau du MTX dans le sérum de patients durant les traitements de chimiothérapie. L’objectif de cette thèse est d’explorer différentes stratégies pour améliorer l’analyse des médicaments dans les milieux complexes par les biocapteurs SPR et de mettre en perspective le potentiel des biocapteurs SPR comme un outil utile pour le TDM dans le laboratoire clinique ou au chevet du patient. Pour atteindre ces objectifs, un essai compétitif colorimétrique basé sur la résonance des plasmons de surface localisée (LSPR) pour le MTX fut établi avec des nanoparticules d’or marquées avec du FA. Ensuite, cet essai compétitif colorimétrique en solution fut adapté à une plateforme SPR. Pour les deux essais développés, la sensibilité, sélectivité, limite de détection, l’optimisation de la gamme dynamique et l’analyse du MTX dans les milieux complexes ont été inspectés. De plus, le prototype de la plateforme SPR miniaturisée fut validé par sa performance équivalente aux systèmes SPR existants ainsi que son utilité pour analyser les échantillons cliniques des patients sous chimiothérapie du MTX. Les concentrations de MTX obtenues par le prototype furent comparées avec des techniques standards, soit un essai immunologique basé sur la polarisation en fluorescence (FPIA) et la chromatographie liquide couplée avec de la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour valider l’utilité du prototype comme un outil clinique pour les tests rapides de quantification du MTX. En dernier lieu, le déploiement du prototype à un laboratoire de biochimie dans un hôpital démontre l’énorme potentiel des biocapteurs SPR pour utilisation en milieux clinique. / Methotrexate (MTX) cancer therapy requires therapeutic drug monitoring (TDM) for following its levels in a patient during the course of treatment in order to maximize efficacy while minimizing side effects. Despite its narrow therapeutic window, MTX remains until this date, one of the most employed chemotherapy agents. Existing TDM analytical techniques for MTX are costly, time-consuming and labor intensive which are not suitable to promptly generate results within the therapy timeframe. To provide rapid MTX quantification for TDM, a strategy is proposed based on a competitive assay featuring gold nanoparticles and surface plasmonic coupling. More specifically, the inhibition of MTX with its molecular receptor, human dihydrofolate reductase (hDHFR), an enzyme associated with proliferative diseases, is explored. Free MTX mixed with folic acid-functionalized gold nanoparticles (FA-AuNP) are in competition for hDHFR binding sites immobilized on a SPR active surface or free in solution. FA-AuNP binding to hDHFR provides signal amplification which is inversely proportional to the concentration of MTX. Surface plasmon resonance (SPR) is commonly used as a spectroscopic technique for the interrogation of biomolecular interactions. Current commercial SPR instruments are laboratory-based, bulky, expensive, lack sensitivity in complex matrix and have not shown adaptability in clinical settings. In addition, SPR analysis of small molecules such as drugs has not been extensively explored due to lack of sensitivity. The recent advances in materials science and surface chemistry exploiting gold nanoparticle integration for SPR response enhancement and peptide surface chemistry have shown potential in overcoming the poor sensitivity and surface-fouling limitations for crude biofluids analysis. These novel concepts of SPR technology are incorporated with a miniaturized fully integrated SPR prototype to conduct fast, reliable and sensitive analysis to monitor MTX levels of a patient undergoing chemotherapy. The objective of the thesis is to explore different strategies in improving drug analysis in a complex matrix using SPR biosensors and to put in perspective of the potential of SPR biosensors as a useful TDM tool in clinical laboratories or at a point-of-care situation. To achieve these objectives, a colorimetric solution-based MTX competitive assay is first established with FA-AuNP. Then, the solution-based MTX competitive assay is translated onto a SPR platform. For both developed assays, sensitivity, selectivity, detection limit, dynamic range optimization as well as analysis of methotrexate in complex matrix are inspected. Furthermore, the SPR prototype is validated by its equivalent performance to existing SPR systems and by its utility in executing MTX analysis in actual serum samples from patients undergoing chemotherapy. The concentrations of MTX obtained by SPR biosensing are compared to standard techniques: fluorescence polarization immunoassay (FPIA) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in order to confirm the feasibility of SPR biosensors as a useful clinical tool for performing rapid MTX concentration evaluation. Finally, the successful deployment of the prototype to a hospital laboratory demonstrates enormous prospective of SPR biosensors in clinical use.

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