Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmalonic acidemia is an inborn error of metabolism characterized clinically and biochemically by tissue accumulation of methylmalonic acid (MMA) and neurological dysfunction, including convulsion. Furthermore, clinical data suggest that infections conditions can precipitate metabolic crisis and cause neurological changes observed in patients of acidemia. Provided that the MMA cause neurological complications, and that the inflammation can contribute to the occurrence of convulsions and cognitive deficit in several animal models, it is possible to suggest that inflammatory mediators, such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), facilitate MMA-induced convulsions. The iNOS is one of three isoforms of nitric oxide synthase (NOS), which generates nitric oxide (NO), a simple gaseous signaling molecule and free radical. The iNOS is induced at injury/inflammation sites, but is also constitutively expressed on some cells, such as in neurons. Studies in experimental models have already demonstrated that NO generated in the central nervous system (CNS), by endothelial and neuronal isoforms of NOS, is involved in MMA-induced convulsions. However, until the present moment are scarce the data in the literature evaluating the relationship of iNOS in experimental models of Methylmalonic Acidemia. The results published in the article has shown that iNOS knock-out C57BL/6 mice, when injected acutely with MMA (2 μmols/2 μl, intracerebroventricularly), have a shorter duration of seizures, no significant change in the mean amplitude of electroencephalographic waves (EEG); not increase the levels of nitrite and nitrate (NOx) compared to animals injected with saline, but have a partial reduction in the levels of 3-nitrotyrosine (3-NT) compared to wild animals that were also treated with MMA; similarly, show a partially lower inhibition of Na+,K+-ATPase, but exhibit no difference in succinate dehydrogenase (SDH) inhibition on cerebral cortex compared to wild mice which also received MMA. The results submitted in the manuscript has shown that Wistar rats, after being injected chronically with MMA (from 5th to 28th day of life, twice daily, with doses ranging from 0.76 to 1.67 mmol/g depending on the age of the animal, via subcutaneous) showed a reduced index of recognition in spatial learning/memory test, but show no anxiety at elevated plus maze test; they have a reduction in neutrophils, but an increase in the number of mononuclear leukocytes in the blood; and in addition show increased levels of interleukin-1beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), iNOS and 3-NT in the cerebral cortex. Considering the data presented in both studies, it was concluded that the MMA can cause seizures, nitrosative stress and inhibition of Na+,K+-ATPase activity in cerebral cortex of mice by mechanisms related to NO production via iNOS; and that the MMA can also cause neurocognitive deficits, altered immune system in blood and increase of pro-inflammatory cytokines, leading to increased expression of iNOS and nitrosative stress. / A Acidemia Metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado bioquimicamente e clinicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e disfunção neurológica, incluindo convulsões e déficit cognitivo. Além disso, dados clínicos sugerem que quadros infecciosos podem precipitar crises metabólicas e causar as alterações neurológicas observadas nos pacientes com essa acidemia. Desde que o MMA causa complicações neurológicas, e que a inflamação pode contribuir para a ocorrência de convulsões e déficits cognitivos em vários modelos animais, é possível sugerir que mediadores inflamatórios, como a enzima Óxido Nítrico Sintase Induzível (iNOS), facilitem as convulsões induzidas por MMA. A iNOS é uma das três isoformas da enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS), que gera o óxido nítrico (NO), uma molécula gasosa simples, sinalizadora e um radical livre. A iNOS é induzida em sítios de lesão/inflamação, mas também se expressa constitutivamente em algumas células, como nos neurônios. Estudos em modelos experimentais já demonstraram que o NO gerado no sistema nervos central (SNC), pelas isoformas endotelial e neuronal da NOS, tem envolvimento nas convulsões induzidas por MMA. Contudo, até o presente momento são escassos os dados na literatura avaliando a relação da iNOS em modelos experimentais da Acidemia Metilmalônica. Os resultados publicados no artigo mostraram que camundongos C57BL/6 nocaute para iNOS, ao serem injetados agudamente com MMA (2 μmols/2 μL, via intracerebroventricular), apresentam uma duração menor das convulsões, sem alteração significativa na amplitude média das ondas eletroencefalográficas (EEG); não aumentam os níveis de nitrito e nitrato (NOx) comparado aos animais injetados com solução salina, mas têm uma redução parcial nos níveis de 3-nitrotirosina (3-NT) comparado aos animais selvagens que também foram tratados com MMA; semelhantemente, mostram uma inibição parcialmente menor na atividade da enzima Na+,K+-ATPase; mas não exibem diferença na inibição da atividade da succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral quando comparados aos camundongos selvagens que também receberam MMA. Os resultados apresentados no manuscrito submetido mostram que ratos Wistar, após serem injetados cronicamente com MMA (do 5º ao 28º dia de vida, duas vezes ao dia, com doses variando de 0,76 à 1,67 mmol/g em função da idade do animal, via subcutânea), apresentam um reduzido índice de reconhecimento em teste de memória/aprendizado espacial, mas não demonstram ansiedade no teste do labirinto em cruz elevado; têm uma redução no número de neutrófilos, mas um aumento no número de leucócitos mononucleares no sangue; e além disso mostram aumento nos níveis de interleucina-1beta (IL-1β), do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), de iNOS e de 3-NT no córtex cerebral. Considerando os dados apresentados nos dois estudos, concluiu-se que o MMA pode causar convulsões, estresse nitrosativo e inibição da enzima Na+,K+-ATPase no córtex cerebral de camundongos por mecanismos relacionados à produção de NO via iNOS; e que o MMA também pode causar déficit neurocognitivo, alteração do sistema imunológico no sangue, e aumento de citocinas pró-inflamatórias, levando ao aumento na expressão da iNOS e estresse nitrosativo.

Orientador: Roger Frigerio Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T10:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirandola_SandraRegina_D.pdf: 3705031 bytes, checksum: e1e34dd5e1b3949d9c308b3c20a19787 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A acidemia metilmalônica (MMAemia) é uma desordem metabólica hereditária do metabolismo de aminoácidos com cadeia ramificada e de ácidos graxos com cadeia ímpar, envolvendo um defeito na conversão de metilmalonil-CoA a succinil-CoA. Manifestações sistêmicas e neurológicas nesta doença são relacionadas com o acúmulo de metilmalonato (MMA) em tecidos e fluidos biológicos e com o comprometimento do metabolismo energético. Neste trabalho, verificou-se que o MMA inibiu com grande intensidade a conversão de lactato a piruvato catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) em homogenatos de fígado e cérebro de rato. A conversão de piruvato a lactato, catalisada pela LDH, foi menos sensível à inibição por MMA. Estudos de cinética enzimática sobre a inibição da LDH de cérebro, utilizando-se lactato como substrato, indicaram que o MMA inibe esta enzima competitivamente (Ki = 3,02 ± 0,59 mM). Propôs-se que a inibição da conversão lactato/piruvato por MMA contribui para a fisiopatologia da MMAemia, resultando, dentre outras alterações, em acúmulo de lactato e acidemia metabólica. Mostrou-se que, em mitocôndrias isoladas de cérebro e músculo de rato, concentrações milimolares de MMA inibiram o consumo de O2 mantido por succinato, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado quando substratos para os complexos I ou IV foram utilizados. Notadamente, o efeito inibitório de MMA, mas não de malonato, no consumo mitocondrial de O2 mantido por succinato foi minimizado quando uma permeabilização não-seletiva das mitocôndrias foi induzida por alameticina. Em adição, o MMA apresentou apenas um pequeno efeito inibitório no consumo de O2 por partículas submitocondriais invertidas na presença de succinato. Não se obteve evidência de produção de malonato nas mitocôndrias tratadas com MMA. Conclui-se que o MMA inibe o consumo mitocondrial de O2 na presença de succinato por interferir na captação deste substrato pela mitocôndria. A inibição do transporte mitocondrial de substratos, induzida pelo MMA, através do carreador de dicarboxilatos, pode ter importantes implicações fisiopatológicas na MMAemia. Comparou-se a suscetibilidade de mitocôndrias isoladas de fígado, rim e coração de rato, assim como de diferentes subregiões cerebrais quanto à transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) induzida por 3-nitropropionato (3-NP) e Ca2+. A MPT foi estimada pela queda do potencial elétrico transmembrana e inchamento mitocondrial sensíveis à ciclosporina A. Mitocôndrias de cérebro e coração foram mais suscetíveis à MPT induzida por 3-NP e Ca2+ que organelas isoladas de fígado e rim. A comparação de mitocôndrias de diferentes regiões cerebrais indicou que uma inibição parcial da respiração por 3-NP resultou em MPT mais rapidamente em organelas estriatais que corticais ou cerebelares. Em ratos tratados sistemicamente com 3-NP, verificou-se uma inibição de mesma magnitude da succinato desidrogenase em todos os tecidos estudados. Notadamente, mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados sistemicamente com 3-NP apresentaram uma maior suscetibilidade à MPT induzida por Ca2+ quanto comparadas a controles. Propôs-se que a maior suscetibilidade do estriado à neurodegeneração induzida por 3-NP pode ser, pelo menos em parte, explicada por uma maior vulnerabilidade desta região cerebral à MPT, juntamente com a vulnerabilidade desta região ao influxo de Ca2+ citosólico mediado pelo estímulo de receptores de glutamato / Abstract: Methylmalonic acidemia (MMAemia) is an inherited metabolic disorder of branched amino acid and odd-chain fatty acid metabolism, involving a defect in the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A. Systemic and neurological manifestations in this disease are thought to be associated with the accumulation of methylmalonate (MMA) in tissues and biological fluids with consequent impairment of energy metabolism. In the present work it was observed that MMA potently inhibited lactate dehydrogenase (LDH)-catalyzed conversion of lactate to pyruvate in liver and brain homogenates. LDH was about one order of magnitude less sensitive to inhibition by MMA when catalyzing the conversion of pyruvate to lactate. Kinetic studies on the inhibition of brain LDH indicated that MMA inhibits this enzyme competitively with lactate as a substrate (Ki = 3.02 ± ?0.59 mM). We proposed that inhibition of the lactate/pyruvate conversion by MMA contributes to the MMAemia physiophatology, leading to lactate accumulation and metabolic acidemia. While millimolar concentrations of MMA inhibit succinate-supported O2 consumption by isolated rat brain or muscle mitochondria, there is no effect when either a pool of NADH-linked substrates or N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamine (TMPD)/ascorbate were used as electron donors. Interestingly, the inhibitory effect of MMA, but not of malonate, on succinate-supported brain mitochondrial O2 consumption was minimized when nonselective permeabilization of mitochondrial membranes was induced by alamethicin. In addition, only a slight inhibitory effect of MMA was observed on succinate-supported O2 consumption by inside-out submitochondrial particles. Under our experimental conditions, there was no evidence of malonate production in MMA-treated mitochondria. We conclude that MMA inhibits succinate-supported mitochondrial O2 consumption by interfering with the uptake of this substrate. MMA-induced inhibition of substrate transport by the mitochondrial dicarboxylate carrier may have important physiopatological implications. The susceptibility of isolated mitochondria from liver, kidney and heart and different rat brain regions (striatum, cortex and cerebellum) was compared regarding to mitochondrial permeability transition (MPT) evoked by 3-nitropropionate (3-NP) and Ca2+ ions. In general, isolated brain mitochondria from different regions were more sensitive to 3-NP and Ca2+ toxicity than mitochondria from liver and kidney as estimated by decrease in the transmembrane electrical potential and mitochondrial swelling. The comparision of different brain regions revealed that the inhibition of 50% of the mitochondrial succinate-supported respiration elicited by 3-NP resulted in a Ca2+-induced MPT pore opening, inhibited by cyclosporin A, faster in striatal than in cortical and cerebellar mitochondria. It was verified an inhibition of succinate dehydrogenase activity from the same magnitude in all tissues studied after a 3-NP systemic treatment. Interestingly, isolated forebrain mitochondria obtained from rats systemically treated with 3-NP showed a more pronounced susceptibility to Ca2+-induced MPT pore opening when compared to control rats. We proposed that the increased susceptibility of rat striatum to 3-NP-induced neurodegeneration could be in part explain by a region-specific susceptibility to MPT together with increase vulnerability of this brain region to glutamate receptors-mediated cytosolic Ca2+ influx / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica