Foram estudados a composição e o pH do meio de cultivo para a produção do fragmento de anticorpo (scFv) anti-LDL(-), expresso em Pichia pastoris recombinante. Os experimentos que definiram a composição e pH do meio assim como a concentração inicial de células na fase de indução foram realizados em agitador orbital a 250 rpm, com temperatura de 30 ºC na fase de crescimento e 20 ºC na fase de indução, durante 72 horas, com adição diária de 1% (v/v) de metanol. Para modificação do meio foi realizado um planejamento experimental empregando como variáveis independentes: extrato de soja, casaminoácidos e ureia, os quais substituíram o YNB e a biotina presentes no meio padrão (BMMY). Apesar de haver maior produção no meio com extrato de soja, o meio contendo 10 g.L-1 de casaminoácidos foi selecionado, uma vez que este favoreceu a etapa de purificação. A partir da faixa de pH estudada entre 3,0 e 8,0, determinou-se que o pH 8,0 no início da fase de indução favorece a maior produção. Finalmente, o meio BMMY-CA (pH 8,0) foi utilizado para cultivo em biorreator com volume de trabalho de 10L e a partir deste cultivo foram calculados os parâmetro cinéticos (velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de produção, bem como produtividade). Diante do conjunto de experimentos realizados, foi possível otimizar a composição do meio de cultivo e as condições operacionais, que possibilitaram um aumento do rendimento bem como aumento do volume de produção do scFv anti-LDL(-) em biorreator. / Composition and pH culture medium for the production of anti- LDL(-) antibody fragment (scFv) were studied in recombinant yeast Pichia pastoris. The experiments that defined medium composition, pH and the initial cell concentration in the induction phase were carried out in baffled shaker flasks at 250 rpm, with temperature at 30°C for growth phase and 20°C for induction phase, during 72 hours with daily addition of 1% (v/v) methanol. A design of experiments employing for medium modification with independent variables: soy extract, casamino acids and urea, which replaced the YNB and biotin present in the standard medium (BMMY) was conducted for medium formulation. Even though, there was an increase in medium production with soy extract, the medium containing 10 g.L-1 casamino acids was selected since it favors the purification step. Through a pH range study (3.0 to 8.0), it was determined that pH 8.0 during induction phase offered higher levels. Then, the best results from shaker flask cultivation (BMMY-CA with casamino acids and pH 8.0) were carried out in 1L bioreactor, showing a biomass and a scFv production increase compared to the standard, BMMY (pH 6.0). Finally, the medium BMMY-CA (pH 8,0) was submitted to a volume scale-up into a 10L bioreactor, which was also used to evaluate kinetic parameters (rates of growth, substrate consumption and production as well as productivity). In conclusion, by optimizing culture medium and operating conditions it was possible to increase yield and scale-up the production of scFv anti-LDL(-) in bioreactor.

Foram estudados a composição e o pH do meio de cultivo para a produção do fragmento de anticorpo (scFv) anti-LDL(-), expresso em Pichia pastoris recombinante. Os experimentos que definiram a composição e pH do meio assim como a concentração inicial de células na fase de indução foram realizados em agitador orbital a 250 rpm, com temperatura de 30 ºC na fase de crescimento e 20 ºC na fase de indução, durante 72 horas, com adição diária de 1% (v/v) de metanol. Para modificação do meio foi realizado um planejamento experimental empregando como variáveis independentes: extrato de soja, casaminoácidos e ureia, os quais substituíram o YNB e a biotina presentes no meio padrão (BMMY). Apesar de haver maior produção no meio com extrato de soja, o meio contendo 10 g.L-1 de casaminoácidos foi selecionado, uma vez que este favoreceu a etapa de purificação. A partir da faixa de pH estudada entre 3,0 e 8,0, determinou-se que o pH 8,0 no início da fase de indução favorece a maior produção. Finalmente, o meio BMMY-CA (pH 8,0) foi utilizado para cultivo em biorreator com volume de trabalho de 10L e a partir deste cultivo foram calculados os parâmetro cinéticos (velocidades de crescimento, de consumo de substrato e de produção, bem como produtividade). Diante do conjunto de experimentos realizados, foi possível otimizar a composição do meio de cultivo e as condições operacionais, que possibilitaram um aumento do rendimento bem como aumento do volume de produção do scFv anti-LDL(-) em biorreator. / Composition and pH culture medium for the production of anti- LDL(-) antibody fragment (scFv) were studied in recombinant yeast Pichia pastoris. The experiments that defined medium composition, pH and the initial cell concentration in the induction phase were carried out in baffled shaker flasks at 250 rpm, with temperature at 30°C for growth phase and 20°C for induction phase, during 72 hours with daily addition of 1% (v/v) methanol. A design of experiments employing for medium modification with independent variables: soy extract, casamino acids and urea, which replaced the YNB and biotin present in the standard medium (BMMY) was conducted for medium formulation. Even though, there was an increase in medium production with soy extract, the medium containing 10 g.L-1 casamino acids was selected since it favors the purification step. Through a pH range study (3.0 to 8.0), it was determined that pH 8.0 during induction phase offered higher levels. Then, the best results from shaker flask cultivation (BMMY-CA with casamino acids and pH 8.0) were carried out in 1L bioreactor, showing a biomass and a scFv production increase compared to the standard, BMMY (pH 6.0). Finally, the medium BMMY-CA (pH 8,0) was submitted to a volume scale-up into a 10L bioreactor, which was also used to evaluate kinetic parameters (rates of growth, substrate consumption and production as well as productivity). In conclusion, by optimizing culture medium and operating conditions it was possible to increase yield and scale-up the production of scFv anti-LDL(-) in bioreactor.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas e que podem colonizar endofiticamente a planta. Algumas espécies deste gênero são capazes de promover o crescimento vegetal e reduzir o ataque de fitopatógenos. A linhagem de M. mesophilicum SR1.6/6 foi isolada de ramos de citros e devido a sua interação com a planta hospedeira e com patógenos associados a planta, tem sido foco vários trabalhos. Os sistemas de secreção e as bombas de efluxo podem estar envolvidos na modulação das interações de bactérias endofíticas com seus ambientes. Assim, neste estudo foi analisada a composição dos exsudatos produzidos pelas plantas de milho e citros na interação com a SR1.6/6 por GC-MS, foi realizada a reanotação de genes relacionados ao sistema de secreção e bombas de efluxo e foi avaliada a expressão de alguns genes destes sistemas na interação com Zea mays e Citrus sinensis por qPCR. Foram encontrados sistemas de secreção tipo I, II e V, vias SEC e TAT e bombas de efluxo, principalmente super-expressos durante a interação com a planta hospedeira. / Methylobacterium genus is composed by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Some species of this genus are able to promote plant growth and reduce the incidence of pathogens. The SR1.6/6 strain of Methylobacterium mesophilicum is a bacterium isolated from citrus and due to its interaction with the plant has been the focus of several studies. Multidrug efflux pumps and secretion system can be involved modulating the interactions of bacteria with their environments. In this work was analised the root exsudates composition from two host plants citrus and corn interacting with SR1.6/6 by GC-MS technique, additionally was searched and reannotated genes related to secretion system and some multidrug efflux pumps and finally evaluated the gene expression of some of this genes during the interaction with Zea mays and Citrus sinensis by qPCR. Type I, II and V secretion system, SEC and TAT pathway and some multidrug efllux pumps were found in this strain according gene expression. This systems were up-regulated mainly during interaction with host plant.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas e que podem colonizar endofiticamente a planta. Algumas espécies deste gênero são capazes de promover o crescimento vegetal e reduzir o ataque de fitopatógenos. A linhagem de M. mesophilicum SR1.6/6 foi isolada de ramos de citros e devido a sua interação com a planta hospedeira e com patógenos associados a planta, tem sido foco vários trabalhos. Os sistemas de secreção e as bombas de efluxo podem estar envolvidos na modulação das interações de bactérias endofíticas com seus ambientes. Assim, neste estudo foi analisada a composição dos exsudatos produzidos pelas plantas de milho e citros na interação com a SR1.6/6 por GC-MS, foi realizada a reanotação de genes relacionados ao sistema de secreção e bombas de efluxo e foi avaliada a expressão de alguns genes destes sistemas na interação com Zea mays e Citrus sinensis por qPCR. Foram encontrados sistemas de secreção tipo I, II e V, vias SEC e TAT e bombas de efluxo, principalmente super-expressos durante a interação com a planta hospedeira. / Methylobacterium genus is composed by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Some species of this genus are able to promote plant growth and reduce the incidence of pathogens. The SR1.6/6 strain of Methylobacterium mesophilicum is a bacterium isolated from citrus and due to its interaction with the plant has been the focus of several studies. Multidrug efflux pumps and secretion system can be involved modulating the interactions of bacteria with their environments. In this work was analised the root exsudates composition from two host plants citrus and corn interacting with SR1.6/6 by GC-MS technique, additionally was searched and reannotated genes related to secretion system and some multidrug efflux pumps and finally evaluated the gene expression of some of this genes during the interaction with Zea mays and Citrus sinensis by qPCR. Type I, II and V secretion system, SEC and TAT pathway and some multidrug efllux pumps were found in this strain according gene expression. This systems were up-regulated mainly during interaction with host plant.