<p>The proteasome is a multi-subunit protease complex responsible for most of the non-lysosomal protein turnover in eukaryotic cells. This degradation process can be conducted dependent or independent of ubiquitination as different isoforms with different substrate preferences coexist in the cell. Proteasomal activity declines during aging due to a decreased expression of proteasome subunits, complex disassembly, and oxidative stress. This malfunction leads to protein accumulation, subsequent aggregation, and ultimately diseased states. Considering the shared feature of aggregation and accumulation of intrinsically disordered proteins (IDPs) in age-related diseases, and the substrate preference of the 20S isoform for misfolded proteins, enhancing the proteolytic activity of the 20S proteasome has arisen as an attractive strategy to minimize the burden associated with this increased protein load. Recently, we identified the FDA-approved drug miconazole (MO) as a stimulator of the 20S isoform and validated its activity profile in biochemical and cell-based assays. Given its FDA-approved drug status, we considered that to successfully repurpose it, information regarding its binding location within the 20S and network of binding partners, as well as its value in protein homeostasis in age-related diseases are necessary. Herein, we (1) conduct SAR studies to determine MO’s key features responsible for proteasomal activation and obtain molecules with enhanced ability to activate the 20S proteasome; next, using the developed SAR model, we (2) design a diazirine-based photoreactive probe that allows for the identification of MO’s binding partners and location within the 20S proteasome. Lastly, we (3) explore the use of MO to restore the activity of impaired proteasomes by Parkinson’s disease-associated toxic oligomers. This work expands upon previous research avenues by using newer approaches to study this enzymatic complex, and describes methods that can be further used to better establish the role of the 20S proteasome in age-related diseases.</p>

O antisséptico cloreto de cetilpiridíneo (CCP) demonstrou ser eficaz como alternativa terapêutica aos antifúngicos em candidose oral, porém, apresenta baixa substantividade. Para aumentar sua biodisponibilidade surge a possibilidade de incorporá-lo num sistema de liberação lenta composto por filmes poliméricos nanofibrílicos. O objetivo deste estudo foi preparar filmes nanofibrílicos através de eletrofiação e incorporar CCP, fazer sua caracterização térmica e morfológica, além de análise microbiológica dos filmes contendo CCP frente a cepas de Candida albicans. O fármaco CCP foi adicionado a três soluções poliméricas, de álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP) e a de PVP/PM [Poli (metacrilato de metila-co-acrilato de etila-co-metacrilato de amônio)] em 5% de concentração. As soluções foram avaliadas quanto à condutividade, viscosidade e tensão superficial e, posteriormente, passaram pelo processo de eletrofiação para obtenção de filmes nanofibrílicos. Os filmes nanofibrílicos foram caracterizados através de análise morfológica (microscopia eletrônica de varredura - MEV), análise térmica (análise termogravimétrica - TGA e calorimetria exploratória diferencial - DSC) e análise química (espectro de infravermelho da transformada de Fourier - FTIR). A eficiência de encapsulação de CCP nas nanofibras, o perfil cinético de liberação das nanofibras e a permeação em mucosa suína (células de Franz) foram avaliados por espectrofotometria. Foi ainda avaliada a concentração de CCP a ser incorporada (de 0,05 a 5%) em nanofibra para que a fração liberada seja a mínima fungicida frente às cepas de C. albicans susceptíveis, pela técnica de disco-difusão, comparada ao miconazol 5% (MCZ). Nestas condições, a solução de PVA apresentou a maior condutividade, viscosidade e tensão superficial. CCP aumentou a condutividade. Ambos, CCP e PM não alteram a tensão superficial do PVP. PM reduziu a viscosidade. A solução de PVP/PM formou o filme mais uniforme e com menos beads. Os termogramas (TGA/DSC) sugerem que o processo de eletrofiação diminiu a cristalinidade de CCP. A eficiência de encapsulação de CCP alcança 99%. A taxa de liberação de CCP encapsulado foi lenta durante o período experimental de 24h. Quando em filme nanofibrílicos, a atividade fungicida de CCP 2,5% e de MCZ 5% foi similar, mas somente MCZ foi fungistático. O filme nanofibrílico contrai em contato com o meio de cultura. Pode-se concluir que filmes nanofibrílicos de PVP/PM com CCP tem potencial para uso como alternativa para tratamento de infecções orais causadas por Candida. / The aim of this study was to prepare electrospun nanofiber films cetylpyridinium chloride (CPC) incorporated test their potential use as antifungal therapy against Candida albicans. CPC was incorporated to three different polymeric solutions, one containing polyvinyl alcohol (PVA), the second containing polyvinylpyrrolidone (PVP) and the third prepared with PVP and poly (methyl methacrylate-co-ethyl acrylate-co-methacrylate ammonium) (PMMA). These polymeric solutions were evaluated as to conductivity, viscosity and surface tension, then subjected to a electrospinning process to obtain nanofiber films. The morphology and structure of nanofiber films were analyzed using scanning electron microscopy (SEM). The characterization of nanofiber films was performed by thermogravimetric analysis (TG) and differential scanning calorimetry (DSC). The encapsulation efficiency of the CPC nanofibers and the release kinetic profile of CPC and porcine mucosa permeation (Franz cells) were assessed by spectrophotometry. It was also assessed the concentration of CPC to be incorporated (from 0.05 to 5%) in nanofiber to be minimal fungicidal fraction released against strains of C. albicans by disk diffusion tests, compared to 5% miconazole (MCZ). Under these conditions, the PVA solution showed the highest conductivity, viscosity and surface tension. CPC increased conductivity. Both CPC and PMMA did not alter the surface tension of PVP. PMMA reduced viscosity. The solution of PVP/PMMA formed a more uniform film with less beads. Thermograms (TGA / DSC) suggested that the electrospinning process changes the crystallinity of CPC. The encapsulation efficiency reaches 99% of CPC. The release rate of encapsulated CPC was slow during the experimental period of 24 hours. In a nanofibrilic film, the fungicidal activity of CPC 2.5% and 5% MCZ was similar, but only MCZ proved fungistatic action. The nanofibrilic film shows contraction in contact with the culture medium. It can be concluded that nanofibrilic films PVP/PMMA with CPC has potential for use as an alternative for the treatment of oral infections caused by Candida.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:21:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andres Felipe.pdf: 3893759 bytes, checksum: fd56d743b750b678334823fb1406f10a (MD5) Previous issue date: 2016-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The combination of well-fitting dentures with topical antifungals is appropriate therapeutic approach for denture stomatitis (EP). It was developed and evaluated an adhesive for removable dentures containing miconazole nitrate (NM) incorporated into mucoadhesive and/or pH dependent polymer microparticles aiming at increasing bioavailability. Initially, microparticles have been developed containing 10% and 20% of NM, spray-drying, using Gantrez MS-955 polymer (G10, G20), Eudragit L-100 (E10, E20) or both (EG10, EG20). An analytical method by high-performance liquid chromatography (HPLC) to quantify NM of the microparticles was validated. Microparticles were characterized by scanning electron microscopy (SEM), x-ray diffraction, Fourier-transformed infrared spectrometry (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC), in-vitro release studies (percentage of dissolution / time, and release profiles) and antifungal activity. An experimental denture adhesive formulation (ACT) was developed containing 10% by weight of the microparticles (AE1, AG1, AEG1, AE2, AG2, AEG2) or 2% of pure drug (ANM). For all adhesives it was determined: minimum inhibitory concentration (MIC) for Candida albicans (microdilution and agar dilution); adhesive force (FA among acrylic surfaces after 0.5, 1, 3, or 6 h immersion in water); and toxicity to brine shrimp (24 h and 48 h) by calculating lethal concentration 50 (LC50). The HPLC method was proven specific, linear (r = 0.9992), precise, accurate and robust in the range 5-90 μg.mL-1, with running and retention times of 10.0 and 5.58 minutes, respectively. All microparticles showed acceptable performance (37.22% - 55.36%) and encapsulation (over 89%) values. E10 and E20 microparticles showed spherical and smooth surface, while EG20 had similar shape, but rough surface. G10, G20 and EG20 had depressed craters and morphology. The diameters of the microparticles ranged from 1.9 to 4.3 micrometers. No chemical bond was observed between the MN and the polymers through the FTIR spectra. Microencapsulation contributed to the drug amorphization, according to thermal analysis and X-ray diffraction, reducing the release time. NM and the G10, G20 and EG20 microparticles fitted the biexponential release kinetic model and the microparticles E10, E20 and EG10 fitted to mono-exponential model. The microparticles showed antifungal efficiency similar to pure drug. Extracts of the adhesives containing the microparticles and ANM showed MIC of 1.25 to 5 μg.mL-1 (comparable to Daktarin®, 2.5 μg.mL-1). Significant differences in AF for adhesive formulations evaluated as a function of immersion time in water were observed (p <0.001), with an upward trend between 1 h and 3 h, followed by reduction or stabilization up to 6 h. The incorporation of NM and polymeric microparticles did not affect the FA of the experimental adhesive and AEG20 showed the best results, with high initial values, and holding them for 6 h. All adhesive formulations showed low or no toxicity (LC50 349.53 to 931.00 μg.mL-1). The proposed denture adhesive formulation was proven compatible with the incorporation of polymeric microparticles containing NM. / A associação de próteses bem adaptadas com a presença tópica de antifúngicos é adequada abordagem terapêutica para estomatite protética (EP). Foi desenvolvido e avaliado um adesivo para prótese removível contendo nitrato de miconazol (NM) incorporado a micropartículas poliméricas muco-adesivas e/ou pH dependentes visando aumento de biodisponibilidade. Inicialmente, foram desenvolvidas micropartículas contendo 10% e 20% de NM, por spray-drying, utilizando os polímeros Gantrez MS-955 (G10, G20), Eudragit L-100 (E10, E20) ou ambos (EG10, EG20). Foi validado um método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para se quantificar NM das micropartículas. Estas foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de raios x, espectrometria de infravermelho por transformada em Fourier (FTIR), calorimetria exploratória diferencial (CED), estudos de liberação in-vitro (porcentagem de dissolução/tempo e perfis de liberação) e atividade antifúngica. A seguir foram desenvolvidas formulações de um adesivo experimental para prótese (ACT) acrescido de 10% em peso das micropartículas (AE1, AG1, AEG1, AE2, AG2, AEG2) ou 2% do fármaco puro (AMN). Para todos adesivos determinou-se: concentração inibitória mínima (CMI) em Candida albicans (microdiluição em caldo e diluição em ágar); força adesiva (FA, entre superfícies acrílicas após 0,5, 1, 3, ou 6 h de imersão em água); e toxicidade em Artemia salina (24 h e 48 h), calculando-se concentração letal 50 (CL50). O método de CLAE apresentou-se específico, linear (r = 0,9992), preciso, exato e robusto na faixa de 5 a 90 μg.mL-1, com tempos de corrida e de retenção de 10,0 e 5,58 minutos, respectivamente. Todas as micropartículas mostraram aceitáveis valores de rendimento (37,22% – 55,36%) e de encapsulação (superiores a 89%). As micropartículas E10 e E20 apresentaram forma esférica e superfície lisa, enquanto EG20 possuíam a mesma forma, porém superfície rugosa. As micropartículas G10, G20 e EG20 apresentaram morfologia deprimida e crateras. Os diâmetros das micropartículas variaram entre 1,9 a 4,3 μm. Nenhuma ligação química foi observada entre o NM e os polímeros, através dos espectros de FTIR. A microencapsulação contribuiu para amorfizar o fármaco, segundo as análises térmicas e difração de raios X, reduzindo seu tempo de liberação. Ajustaram-se ao modelo cinético de liberação biexponencial o NM e as micropartículas G10, G20 e EG20, e ao modelo monoexponencial, as micropartículas E10, E20 e EG10. As micropartículas apresentaram eficiência antifúngica similar ao fármaco puro. Extratos dos adesivos contendo micropartículas e a formulação AMN apresentaram CMI entre 1,25 a 5 μg.mL-1 (comparável a Daktarin®, 2,5 μg.mL-1). Foram verificadas diferenças significativas na FA para as formulações de adesivos avaliadas em função do tempo de imersão na água (p<0,001), com tendência de aumento entre 1 h e 3 h, seguido de decréscimo ou estabilização até 6 h. A incorporação do NM e de micropartículas poliméricas não prejudicou a FA do adesivo experimental e AEG20 exibiu os melhores resultados, apresentando elevados valores iniciais, e mantendo-os por 6 h. Todas as formulações de adesivos apresentaram baixa ou nenhuma toxicidade (CL50 de 349,53 a 931,00 μg.mL-1). A formulação de adesivo para prótese removível proposta foi compatível com a incorporação de micropartículas poliméricas contendo NM.

O antisséptico cloreto de cetilpiridíneo (CCP) demonstrou ser eficaz como alternativa terapêutica aos antifúngicos em candidose oral, porém, apresenta baixa substantividade. Para aumentar sua biodisponibilidade surge a possibilidade de incorporá-lo num sistema de liberação lenta composto por filmes poliméricos nanofibrílicos. O objetivo deste estudo foi preparar filmes nanofibrílicos através de eletrofiação e incorporar CCP, fazer sua caracterização térmica e morfológica, além de análise microbiológica dos filmes contendo CCP frente a cepas de Candida albicans. O fármaco CCP foi adicionado a três soluções poliméricas, de álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP) e a de PVP/PM [Poli (metacrilato de metila-co-acrilato de etila-co-metacrilato de amônio)] em 5% de concentração. As soluções foram avaliadas quanto à condutividade, viscosidade e tensão superficial e, posteriormente, passaram pelo processo de eletrofiação para obtenção de filmes nanofibrílicos. Os filmes nanofibrílicos foram caracterizados através de análise morfológica (microscopia eletrônica de varredura - MEV), análise térmica (análise termogravimétrica - TGA e calorimetria exploratória diferencial - DSC) e análise química (espectro de infravermelho da transformada de Fourier - FTIR). A eficiência de encapsulação de CCP nas nanofibras, o perfil cinético de liberação das nanofibras e a permeação em mucosa suína (células de Franz) foram avaliados por espectrofotometria. Foi ainda avaliada a concentração de CCP a ser incorporada (de 0,05 a 5%) em nanofibra para que a fração liberada seja a mínima fungicida frente às cepas de C. albicans susceptíveis, pela técnica de disco-difusão, comparada ao miconazol 5% (MCZ). Nestas condições, a solução de PVA apresentou a maior condutividade, viscosidade e tensão superficial. CCP aumentou a condutividade. Ambos, CCP e PM não alteram a tensão superficial do PVP. PM reduziu a viscosidade. A solução de PVP/PM formou o filme mais uniforme e com menos beads. Os termogramas (TGA/DSC) sugerem que o processo de eletrofiação diminiu a cristalinidade de CCP. A eficiência de encapsulação de CCP alcança 99%. A taxa de liberação de CCP encapsulado foi lenta durante o período experimental de 24h. Quando em filme nanofibrílicos, a atividade fungicida de CCP 2,5% e de MCZ 5% foi similar, mas somente MCZ foi fungistático. O filme nanofibrílico contrai em contato com o meio de cultura. Pode-se concluir que filmes nanofibrílicos de PVP/PM com CCP tem potencial para uso como alternativa para tratamento de infecções orais causadas por Candida. / The aim of this study was to prepare electrospun nanofiber films cetylpyridinium chloride (CPC) incorporated test their potential use as antifungal therapy against Candida albicans. CPC was incorporated to three different polymeric solutions, one containing polyvinyl alcohol (PVA), the second containing polyvinylpyrrolidone (PVP) and the third prepared with PVP and poly (methyl methacrylate-co-ethyl acrylate-co-methacrylate ammonium) (PMMA). These polymeric solutions were evaluated as to conductivity, viscosity and surface tension, then subjected to a electrospinning process to obtain nanofiber films. The morphology and structure of nanofiber films were analyzed using scanning electron microscopy (SEM). The characterization of nanofiber films was performed by thermogravimetric analysis (TG) and differential scanning calorimetry (DSC). The encapsulation efficiency of the CPC nanofibers and the release kinetic profile of CPC and porcine mucosa permeation (Franz cells) were assessed by spectrophotometry. It was also assessed the concentration of CPC to be incorporated (from 0.05 to 5%) in nanofiber to be minimal fungicidal fraction released against strains of C. albicans by disk diffusion tests, compared to 5% miconazole (MCZ). Under these conditions, the PVA solution showed the highest conductivity, viscosity and surface tension. CPC increased conductivity. Both CPC and PMMA did not alter the surface tension of PVP. PMMA reduced viscosity. The solution of PVP/PMMA formed a more uniform film with less beads. Thermograms (TGA / DSC) suggested that the electrospinning process changes the crystallinity of CPC. The encapsulation efficiency reaches 99% of CPC. The release rate of encapsulated CPC was slow during the experimental period of 24 hours. In a nanofibrilic film, the fungicidal activity of CPC 2.5% and 5% MCZ was similar, but only MCZ proved fungistatic action. The nanofibrilic film shows contraction in contact with the culture medium. It can be concluded that nanofibrilic films PVP/PMMA with CPC has potential for use as an alternative for the treatment of oral infections caused by Candida.