Genomas de vibrios ambientais ainda são pouco conhecidos. O presente trabalho de dissertação de mestrado envolveu a anotação de quatro genomas parciais de vibrios ( V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3, V. mimicus VM603 e VM573), a comparação da performance de três sistemas automáticos de anotação de genomas (SABIA, RAST, e GRC) e a determinação de genes putativos únicos de cada um dos quatro genomas. Os genomas de vibrios apresentaram entre 3.745 e 4.977 genes, dos quais em média 2.900 são válidos, 898 são conservados hipotéticos e 385 são hipotéticos. Os genomas apresentaram similaridade em termos de classes de grupos ortólogos com a maioria dos genes válidos identificados nas classes: funções gerais e desconhecidas(R e S), transporte e metabolismo de aminoácidos(E) e transcrição(K) de acordo com as classes de grupos ortólogos (COG) e a maioria das classes foram similares. A comparação entre os anotadores automáticos sugeriu que cada anotador apresenta prós e contras. O anotador SABIA apresenta uma grande interatividade com os bancos de dados biológicos, tais como o InterPro e Swiss-Prot. O anotador RAST é muito útil para comparação genômica do organismo de interesse com os diversos genomas e metagenomas presentes nos bancos públicos, enquanto que o anotador GRC pode ser utilizado localmente, sem a necessidade de acesso à internet. De acordo com as análises comparativas por meio da anotação realizada com o auxílio do BLAST e BLAST Atlas, os genomas de vibrios ( V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3, V. mimicus VM603 e VM573) também apresentaram diferenças em termos de conteúdo gênico, indicando que cada linhagem de vibrio possui sub-grupos de genes únicos. Cada um dos quatro genomas apresentaram de 289 a 1.6432 genes únicos de acordo com o as comparações pareadas com os vizinhos filogenéticos mais próximos disponíveis nos bancos de dados. Assim, a comparação entre os genomas das linhagens V. alginolyticus 40B e V. alginolyticus 12G01 resultou na descoberta de 541 genes únicos na linhagem V. alginolyticus 40B. A comparação entre os genomas de V. communis 1DA3 e V. campbellii ATTC BAA-1116 resultou na descoberta de 1.432 genes únicos na linhagem V. communis 1DA3 e a comparação entre os genomas de V. mimicus VM603 e VM573 resultou na descoberta de 334 e 289 genes únicos, em cada uma destas linhagens. Há um predomínio de genes únicos, sobretudo, pertencentes as classes relacionadas com carboidratos, resposta ao estresse, virulência, aminoácidos e derivados, parede celular e cápsula, sugerindo que estes genes estariam associados com a adaptação das linhagens à diferentes condições ambientais e diferentes nichos ecológicos. / Vibrios genomes are not fully known. This thesis focused on the annotation of four draft genomes ( V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3, V. mimicus VM603 e VM573), the performance comparison of three automated genome annotations (SABIA, RAST and GRC) and the identification of putative unique genes (strain specific genes) in the genomes. The genomes of Vibrios contained between 3,745 and 4,977 genes, of which 2,900 were real genes, 898 were hypothetic conserved genes and 385 were hypothetic genes. The majority of known gene products were related to general functions and unknown functions (R and S), metabolism and amino acid transport (E) and transcription (K) on the basis of the COG (clusters of ortologs group). The comparison of three automated genome annotation systems indicated that each system had advantages and disadvantagens. The SABIA Server revealed interactivity with many biologic databases, such as InterPro and Swiss-Prot. The RAST server was useful for comparative genomics of specific genomes and metagenomes. The GRC server was useful annotation offline as it can be installed and run on a local computer. The genomes of Vibrios showed differences in the genic content revealled by BLAST atlas and BLAST. Each genome showed 289 to 1,432 unique genes, resulting of comparisons with organisms phylogenetically closest related. The comparison of the genomes of V. alginolyticus 40B and V. alginolyticus 12G01 revealed that 40B has 541 unique genes. The comparison of V. communis 1DA3 and V. campbellii ATTC genome revealed 1,432 unique genes in 1DA3. V. mimicus VM573 and VM603 genomes showed 334 and 289 unique genes, respectively. The vast majority of unique genes were related with carbohidrates, stress response, virulence, cell wall and capsule, indicating that this sub-group of genes may be associated with adaptation of strains to differents habitats and ecologic niches.

Orientador: Fernando Leite Hoffmann / Banca: Miyoko Jakabi / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Resumo: Os alimentos prontos para o consumo provenientes de escolas, conhecidos como merenda escolar, são amplamente distribuídos aos estudantes e, por este motivo, requerem um controle higiênico-sanitário satisfatório, pois o manuseio e as condições do local de preparo inadequados podem favorecer o desenvolvimento de micro-organismos, como bactérias, bolores e leveduras. Contudo, conferem maior destaque as bactérias, principalmente as patogênicas, representando um risco à saúde pública. Com isso, é imprescindível que sejam adotadas as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e uma ferramenta eficaz para avaliação destes aspectos é o checklist. Outro problema em saúde pública se refere ao surgimento de linhagens resistentes a agentes antimicrobianos, principalmente pelo uso indiscriminado na terapia humana. Considerando os fatos mencionados, este trabalho teve como objetivo avaliar os aspectos higiênico-sanitários de alimentos prontos para o consumo produzidos e servidos em cozinhas de diferentes escolas públicas de um município da região Noroeste do Estado de São Paulo. Para tanto 103 amostras, envolvendo trinta de alimentos prontos para o consumo, 32 de água, 21 de swabs de esfregaços de superfícies de utensílios (tábuas de corte, facas e colheres) e vinte das mãos de manipuladores de alimentos foram submetidas a diferentes análises: determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes, pesquisas de Escherichia coli e Salmonella spp., contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (coagulase positiva), Clostrídios sulfito-redutores, bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras. As pesquisas de Salmonella spp., B. cereus, Clostrídios sulfito-redutores, bolores e leveduras foram específicas para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ready-to-eat food from schools, known as school meal, are widely distributed to students and, therefore, require a satisfactory hygienic-sanitary control, because the inadequate handling and the conditions of the locations of food preparation may favor the development of microorganisms such as bacteria, yeasts and molds. However, provides further highlight to the bacteria especially pathogenic, featuring as risk to the public health. Thus, it is imperative to adopt the Good Manufacturing Practices (GMP), and an effective tool for assessing these aspects is the checklist. Another important trouble in public health regards to the emergence of resistant strains to antimicrobials, especially by indiscriminate use in human therapy. Considering the mentioned facts, this study aimed to evaluate the hygienic-sanitary aspects of ready-to-eat food produced and served in kitchens from different public schools of a municipality in the northwestern region of São Paulo State. For this purpose 103 samples, involving thirty ready-to-eat food, 32 of water, 21 swabs of surfaces of utensils (cutting boards, knives and spoons) and twenty from the hands of food handlers were subjected to different analysis: determining the Most Probable Number (MPN) of total and thermotolerants coliforms, researches of Escherichia coli and Salmonella spp., count of Colony Forming Units (CFU) of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (positive coagulase), Clostridium sulphite-reducers, mesophilic aerobic bacteria, molds and yeasts. The researches of Salmonella spp., B. cereus, Clostridium sulphite-reducers, yeasts and molds were specific to the ready food and S. aureus (positive coagulase) was not evaluated in water. For the evaluation of GMP from school kitchens was used a checklist developed from current laws and to verify the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

MobM relaxase from the promiscuous antibiotic resistance plasmid pMV158 is a prototype of the Mob_Pre/MOBV family of relaxases, the major family of relaxases found in Staphylococcus aureus. Staphylococcal infections cause the highest number of lethal cases among antibiotic-resistant bacterial infections. Relaxases initiate the conjugative DNA transfer, a major route for the antibiotic resistance acquisition in bacteria, by nicking their substrate DNA through formation of a covalent DNA-relaxase adduct and terminate the transfer in the recipient cells by rejoining ends of the linearized plasmid. MobM forms a DNA-histidine adduct, unique to MOBV relaxases, instead of a DNA-tyrosine adduct, thus representing a distinct category of relaxases with specialization towards the transfer of short mobile genetic elements in Gram-positive pathogenic bacteria. MobM overall fold resembles the fold of other structurally characterized relaxases, although some important structural differences are present. Molecular basis for the MobM processing of plasmid origin of transfer and active site mechanism are described herein. / La relaxasa MobM del promiscuo plásmido de resistencia a antibióticos pMV158 es un prototipo de la familia Mob_Pre/MOBV de relaxasas, la mayor familia de relaxasas se encuentran en Staphylococcu aureus. Las infecciones por estafilococos causan el mayor número de casos mortales entre las infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos. Relaxases iniciar la transferencia conjugativa de ADN, una ruta el más frecuente para la adquisición de resistencia a antibióticos por bacterias, por mellar su ADN sustrato mediante la formación de un aducto covalente de ADN-relaxasa y terminan la transferencia en las células receptoras por reincorporarse extremos del plásmido linealizado. MobM forma un aducto de ADN-histidina, único para MOBV relaxases, en lugar de un aducto de ADN-tirosina, lo que representa una categoría distinta de relaxases con especialización hacia la transferencia de elementos genéticos móviles cortos en bacterias patógenas Gram-positivas. MobM estructura general se asemeja a la de otras veces relaxases caracterizan estructuralmente, aunque algunas diferencias estructurales importantes están presentes. Base molecular para el procesamiento de origen del plásmido por MobM y mecanismo de sitio activo se describe en esta thesis.

The increase of opportunistic infections due to emerging species of fungi has caused difficulties in the treatment. For this reason, in this thesis we have experimentally evaluated the efficacy of different drugs against systemic infections by Candida guilliermondii, Scopulariopsis spp., and Curvularia spp. The low incidence of these infections has hampered the adoption of effective therapeutic strategies against these infections which are associated to a high mortality. Ourin vitro and in vivo studies demonstrated the efficacy of liposomal amphotericin B against C. guilliermondii and limited activity of posaconazole, voriconazole and amphotericin B against infections by the dematiaceous species studied. We have also demonstrated the importance of molecular identification of species of clinical interest, which have led to the proposal of a new species: Candida neorugosa sp. nov / El aumento de infecciones oportunistas debido a especies de hongos emergentes ha generado dificultades en el tratamiento. Por esta razón, enesta tesis hemos evaluado experimentalmentela eficacia de diferentes fármacos frente a infecciones sistémicas producidas por Candida guilliermondii, Scopulariopsisspp., y Curvulariaspp. La baja incidencia de estas infecciones ha dificultado la adopción de estrategias terapéuticas eficaces debido a lo cual estas infecciones están asociadas a una elevada mortalidad. Hemos realizado estudios in vitro e in vivo que han permitido comprobar la eficacia de anfotericina liposomal frente a C. guilliermondii y una limitada actividad de posaconazol, voriconazol y anfotericina B frente a infecciones por las especiesdematiáceas aquí estudiadas. A su vez hemos demostrado la importancia de la identificación de especies de interés clínico, mediante técnicas moleculares, lo cual nos ha llevado a la propuesta de la nueva especie: Candidaneorugosasp. nov.

The treatment of invasive mycoses is far to be the optimal and despite advances made in the last decades these infections continue to be associated with high mortality rates. The main goal of this thesis was to evaluate the in vitro and in vivo efficacy of new therapeutical strategies against systemic infections such as candidiasis, aspergillosis and mucoramycosis. The best in vivo efficacy of echinocandins in the treatment of infections by Candida parapsilosis was only observed among those mice infected with the strains that showed the lowest MICs. Posaconazole showed good efficacy against infections by Aspergillus terreus. The voriconazole in vitro data could be useful for predicting the outcome of A. terreus infections; while A. fumigatus isolates showed important variability in their in vivo response to this drug. Amphotericin B was the most effective drug for the treatment of infections by Mucor circinelloides. Posaconazole and amphotericin B showed efficacy in the treatment of Apophysomyces variabilis infections. Posaconazole had the greatest efficacy in our model of disseminated infection by Saksenaea vasiformis. / Las terapias utilizadas en la actualidad para el tratamiento de infecciones fúngicas invasoras causadas por hongos oportunistas están lejos de ser las óptimas, y a pesar de los avances realizados en las últimas décadas, estas infecciones siguen asociadas a altas tasas de mortalidad. El objetivo principal de esta tesis ha sido contribuir al desarrollo experimental de nuevos tratamientos o a la mejora de los ya existentes frente a infecciones sistémicas como las candidiasis, aspergilosis y mucoramicosis. Para ello, se han realizado estudios in vitro e in vivo en modelos animales adecuados que han permitido comprobar la eficacia de diferentes fármacos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os micro-organismos quando se apresentam em biofilme expressam propriedades distintas de quando estÃo na forma planctÃnica. Uma dessas propriedades à uma maior tolerÃncia aos agentes antimicrobianos. O objetivo deste estudo foi avaliar a formaÃÃo biofilmes de dermatÃfitos in vitro e ex vivo, em lamÃnulas de poliestireno e fragmentos de unha, respectivamente, bem como a sua sensibilidade a trÃs agentes antifÃngicos (itraconazol, voriconazol e griseofulvina) na forma plantÃnica e em biofilmes. Para tal, num primeiro momento, foram utilizadas 26 cepas isoladas de espÃcimes clÃnicos de origem humana e animal: Trichophyton rubrum (4) Trichophyton tonsurans (6), Trichophyton mentagrophytes (3), Microsporum gypseum (3) e Microsporum canis (10). Os biofilmes foram, inicialmente, formados em placas de microdiluiÃÃo, e as cepas foram classificadas, pela quantidade de biomassa, como nÃo formadoras (2/26), fracas (7/26), moderada (1/26) e fortes formadoras de biofilme (16/26). Em seguida, cepas fortes formadoras de biofilmes foram escolhidas, sendo uma de cada espÃcie, para formaÃÃo de biofilmes em lamÃnulas e fragmentos de unha, para anÃlises pela microscopia Ãptica, confocal e eletrÃnica de varredura, posteriormente. As anÃlises demonstraram que todas as espÃcies formaram biofilmes in vitro e ex vivo, com densidade e arquitetura distintas. M. gypseum e M. canis produziram biofilmes com maior e menor quantidade de biomassa, respectivamente. Em um segundo momento, conforme as preconizaÃÃes do documento M38-A2 do CLSI, foram determinadas as concentraÃÃes inibitÃria mÃnima (CIMs) das trÃs drogas contra as 26 cepas de dermatÃfitos, na forma plantÃnica. Os valores CIMs variaram entre 0,00195-0,25 Âg/ml para itraconazol; 0,00195-0,125 para voriconazol e <0,0039-4 Âg/ml para griseofulvina. Posteriormente foram formados biofilmes, em placas de microdiluiÃÃo, que foram tratados com as mesmas drogas, nos valores de CIM, 10 x CIM e 50 x CIM. A viabilidade celular dos biofilmes foi quantificada utilizando o ensaio colorimÃtrico XTT. Para reduzir de forma significativa a atividade metabÃlica dos biofilmes (P<0,05) foi necessÃrio usar 50 x CIM, para as trÃs drogas. Este estudo pode contribuir para melhorar a compreensÃo da fisiopatologia do microrganismo e tolerÃncia ou resistÃncia ao tratamento. / The microorganisms when presented in biofilm express properties different from when they are in the planktonic form. One of these properties is a higher resistance to antimicrobial agents. The aim of this study was to evaluate the formation of dermatophytesâ biofilms in in vitro and ex vivo assay performed in polystyrene coverslip and nail fragments, respectively, and their susceptibility to three antifungal agents (itraconazole, voriconazole and griseofulvin) in planktonics and biofilm forms. To this end, at first, they were used 26 strains isolated from clinical specimens of human and animal: Trichophyton rubrum (4) Trichophyton tonsurans (6), Trichophyton mentagrophytes (3), Microsporum gypseum (3) e Microsporum canis (10). The biofilms were initially formed in microdilution plates, and the strains were classified by the amount of biomass as non producers (2/26), weak (7/26), moderate (1/26) and strong biofilm producers (16/26). Then, strains, strong producers of biofilms, were chosen, one of each species, to biofilm formation in coverslip Thermanox and nail fragments for later analysis by optical, confocal and scanning electron microscopy. The analyzes demonstrated that all species formed biofilms in vitro and ex vivo, with different density and architecture. M. gypseum and M. canis produced biofilms with higher and lower amounts of biomass, respectively. At a second step, according to the recommendations of the CLSI M38-A2 protocol, the minimum inhibitory concentration (MIC) values for the three antifungal agents against these 26 strains were determined, in the planktonic form. MICs values ranged from 0.00195-0.25 &#956;g/ml for itraconazol, 0.00195-0.125 for voriconazole and <0.0039-4 &#956;g / ml for griseofulvin. Subsequently, biofilms were formed, in microdilution plates and treated with the same drugs, in MIC, 10 x MIC and 50 x MIC values. The cell viability of the biofilms was quantified using the XTT colorimetric assay. In order to significantly reduce the metabolic activity of biofilms (P <0.05), 50 x MIC was required, for the three drugs. This study may contribute to improve the understanding of the pathophysiology of the microorganism and tolerance or resistance to treatment.

Bacillus subtilis and related species have strong interest in agriculture because several strains are biocontrol agents of plant diseases, which have been recognized as biosafe. In this work, a selective enrichment procedure based on PCR targeting antimicrobial peptide (AMP) genes has been designed and evaluated to screen field samples and pure cultures of Bacillus spp. The procedure increased the yield of isolation of Bacillus strains compared to the standard procedure. The isolates were characterized according to the presence of six AMP genes, the capacity to produce AMPs, and their antimicrobial activity against fungal and bacterial plant pathogens. The relationships between AMP genes, products and antimicrobial activity have been established. Finally, a collection of 184 Bacillus has been obtained having multiple AMP genes simultaneously, and producing several cyclic lipopeptides, with a wide range of antimicrobial activity. It is expected that such strains would be suitable candidates to develop novel biopesticides for plant disease control / Bacillus subtilis i les espècies relacionades són de gran interès per l'agricultura, gràcies a la seva implicació en el biocontrol de malalties de plantes, i ser reconeguts com a biosegurs. En aquest treball s'ha dissenyat i avaluat un procés d'enriquiment selectiu basat en la detecció de gens relacionats amb la síntesis de pèptids antimicrobians, per tal d'analitzar mostres naturals i cultius purs de Bacillus. El procediment va permetre un increment d'aïllament de Bacillus en comparació al mètode estàndard d'aïllament. Els aïllats van ser caracteritzats segons la presencia de sis gens biosintètics, la capacitat de produir ciclolipopèptids i la seva activitat antimicrobiana contra fongs i bacteris patògens de plantes. Es van establir les relacions existents entre la presència del gens biosintètics, els productes i l'activitat antimicrobiana. Finalment, es va obtenir una col•lecció de 184 aïllats de Bacillus amb múltiple presència de gens biosintètics de pèptids antimicrobians simultàniament, productors de varis ciclolipopèptids, i amb un ampli espectre d'activitat antimicrobiana. És d'esperar que aquests aïllats resultin bons candidats per desenvolupar nous biopesticides per al control de malalties de plantes

El present treball es centra en l'estudi a diferents nivells dels carotenoides de les espècies marrons de Bacteris Verds del Sofre (GSB, de l'anglès Green Sulfur Bacteria). L'objectiu global ha estat el d'esbrinar quina és la funció d'aquests pigments dins l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes i aprofundir en el coneixement de la seva estructura i interaccions amb els altres pigments de l'aparell fotosintètic.En primer lloc es va dissenyar un nou mètode de cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) per analitzar de manera més ràpida i precisa els carotenoides de diferents soques de GSB (Capítol 3). Aquest mètode es basa en una purificació prèvia dels extractes pigmentaris amb columnes d'alúmina per eliminar les bacterioclorofil·les (BCls). Això va permetre analitzar amb una elevada resolució i en tan sols 45 min de carrera cromatogràfica els diferents carotenoides i els seus precursors, així com les configuracions trans i cis dels seus isòmers. El segon mètode utilitzat va consistir en una modificació del mètode de Borrego i Garcia-Gil (1994) i va permetre la separació precisa de tot tipus de pigments, procedents tant de cultius purs com de mostres de caràcter complex. Un exemple concret foren uns paleosediments de la zona lacustre de Banyoles. En aquests sediments (0,7-1,5 milions d'anys d'antiguitat) es van detectar, entre d'altres pigments, carotenoides específics de les espècies marrons de GSB, la qual cosa va permetre confirmar la presència d'aquests bacteris a la zona lacustre de Banyoles ja des del Pleistocè inferior. En aquest primer capítol també es van analitzar els carotenoides de Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides CL1401 mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS/MS), amb l'objectiu de confirmar la seva identificació i el seu pes molecular. A més, també es va avaluar l'efecte de la temperatura, la llum i diferents agents oxidants i reductors en la composició quantitativa i qualitativa dels carotenoides i les BCls d'aquesta espècie. Això va permetre confirmar el caràcter fotosensible de les BCls i que els isòmers trans/cis dels diferents carotenoides no són artefactes produïts durant la manipulació de les mostres, sinó que són constitutius de l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes.El Capítol 4 inclou els experiments de fisiologia duts a terme amb algunes espècies de GSB, a partir dels quals es va intentar esbrinar la dinàmica de síntesi dels diferents pigments de l'aparell fotosintètic (BCl antena, BCl a i carotenoides) durant el creixement d'aquestes espècies. Aquestes investigacions van permetre monitoritzar també els canvis en el nombre de centres de reacció (CR) durant el procés d'adaptació lumínica. La determinació experimental del nombre de CR es va realitzar a partir de la quantificació de la BCl663, l'acceptor primari en la cadena de transport d'electrons dels GSB. L'estimació del nombre de CR/clorosoma es va realitzar tant a partir de dades estequiomètriques i biomètriques presents a la bibliografia, com a partir de les dades experimentals obtingudes en el present treball. El bon ajust obtingut entre les diferents estimacions va donar solidesa al valor estequiomètric calculat, que fou, com a promig, d'uns 70 CR per clorosoma. En aquest capítol de fisiologia també es van estudiar les variacions en les relacions trans/cis pels principals carotenoides de les espècies marrons de GSB. Aquestes es van determinar a partir de cultius purs de laboratori i de poblacions naturals de GSB. Pel que fa als valors trobats en cultius de laboratori no es van observar diferències destacades entre el valor calculat a alta intensitat de llum i el calculat a baixa intensitat, essent en ambdós casos proper a 2. En els clorosomes aïllats de diferents soques marrons aquest quocient prengué un valor similar tant pels isòmers de l'isorenieratè (Isr) com pels del &#61538;-isorenieratè (&#61538;-Isr). En poblacions naturals de Chl. phaeobacteroides aquesta relació va ser també de 2 isòmers trans per cada isòmer cis, mantenint-se constant tant en fondària com al llarg del temps.Finalment, en el Capítol 5 es presenta un marcador molecular que permet la identificació específica d'espècies marrons de GSB. Malgrat que inicialment aquest marcador fou dissenyat a partir d'un gen implicat en la síntesi de carotenoides (crtY, el qual codifica per a una licopè ciclasa) la seqüència final a partir de la qual s'han aconseguit els encebadors selectius està relacionada amb la família de proteïnes de les Policètid-ceto-sintases (PKT). Tot i així, l'eina dissenyada pot ser de gran utilitat per a la discriminació d'espècies marrons de GSB respecte les verdes en poblacions mixtes com les que es troben en ambients naturals i obre la porta a futurs experiments d'ecologia microbiana utilitzant tècniques com la PCR en temps real, que permetria la monitorització selectiva de les poblacions d'espècies marrons de GSB en ecosistemes naturals. / El presente trabajo se centra en el estudio a partir de distintos niveles de los carotenoides de las especies marrones de Bacterias Verdes del Azufre (GSB, del inglés Green Sulfur Bacteria). El objetivo global ha sido el de averiguar cual es la función de estos pigmentos en estos microorganismos así como ampliar los conocimientos de su estructura y interacciones con los otros pigmentos del aparato fotosintético.En primer lugar se diseñó un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para analizar de forma más precisa y rápida los carotenoides de distintas cepas de GSB (Capítulo 3). Este método se caracteriza por una purificación previa de los extractos pigmentarios mediante columnas de alúmina para eliminar las bacterioclorofilas (BCls). Esto permitió analizar con una elevada resolución y en tan sólo 45 min de carrera cromatográfica los distintos carotenoides y sus precursores, así como las configuraciones trans y cis de sus isómeros. El segundo de los métodos utilizado consistió en una modificación del método de Borrego y Garcia-Gil (1994) y permitió la separación precisa de todo tipo de pigmentos, procedentes tanto de cultivos puros como de muestras de carácter complejo. Un ejemplo concreto fueron los sedimentos antiguos de la zona lacustre de Banyoles. En estos sedimentos (0,7-1,5 millones de años de antigüedad) se detectaron, entre otros pigmentos, carotenoides específicos de las especies marrones de GSB, lo que permitió confirmar la presencia de estas bacterias en la zona lacustre de Banyoles ya des del Pleistoceno inferior.En este primer capítulo también se analizaron los carotenoides de Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides CL1401 mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS), con el objetivo de confirmar su identificación y su peso molecular. Además, también se analizó el efecto de la temperatura, la luz y distintos agentes oxidantes y reductores sobre la composición cuantitativa y cualitativa de los carotenoides y las BCls de esta especie. Estos experimentos permitieron confirmar el carácter fotosensible de las BCls y que los isómeros trans/cis de los distintos carotenoides no son artefactos producidos durante la manipulación de las muestras sino que son constitutivos del aparato fotosintético de estos microorganismos.El Capítulo 4 incluye los experimentos de fisiología realizados con algunas especies de GSB, centrados en elucidar los mecanismos en la dinámica de síntesis de los distintos pigmentos (BCl antena, BCl a i carotenoides) durante el crecimiento de estas especies. Estas investigaciones permitieron monitorizar también las variaciones en el número de CR durante el proceso de adaptación lumínica. A partir de la cuantificación de la BCl663, el aceptor primario en la cadena de transporte de electrones en GSB, se calculó el número de CR. La estimación de la relación CR/clorosoma se llevó a cabo, primero a partir de datos estequiométricos y biométricos presentes en la bibliografía, y luego a partir de los datos experimentales de este trabajo. El buen ajuste entre las distintas estimaciones dio solidez al valor estequiométrico calculado, el cual fue, como promedio, de unos 70 CR por clorosoma. En este capítulo de fisiología también se estudiaron las variaciones en las relaciones trans/cis entre los principales carotenoides de las especies marrones de GSB. Estas se determinaron a partir de cultivos puros de laboratorio y a partir de poblaciones naturales de GSB. Las relaciones calculadas para los cultivos no presentaron diferencias destacadas en función de las condiciones de iluminación de estos. En las dos condiciones estudiadas, alta y baja intensidad de luz, el valor de la relación trans/cis fue aproximadamente de 2. En clorosomas aislados de distintas cepas marrones de GSB la relación también fue aproximadamente de 2, tanto para el isorenierateno (Isr) como para el &#61538;-isoreniearateno (&#61538;-Isr). En poblaciones naturales de Chl. phaeobacteroides esta relación fue también de 2 isómeros trans por cada isómero cis, manteniéndose constante tanto en profundidad como a lo largo del tiempo. Finalmente, en el Capítulo 5 se presenta un marcador molecular que permitió la identificación específica de especies marrones de GSB. A pesar que su diseño inicial fue a partir de un gen implicado en la síntesis de carotenoides (crtY, que codifica para una licopeno ciclasa) la secuencia final a partir de la cual se han obtenido los encebadores selectivos está relacionada con la familia de proteínas de las Policétido-ceto-sintasas (PKT). A pesar de todo, la nueva herramienta puede ser de gran utilidad para la discriminación de especies marrones de GSB respecto a las verdes en poblaciones mixtas como las que se encuentran en ambientes naturales y abre las puertas a futuros experimentos de ecología microbiana utilizando técnicas como la PCR en tiempo real, que permitiría la monitorización selectiva de las poblaciones de especies marrones de GSB en ecosistemas naturales. / This study is focused on the composition, distribution and function of carotenoids in the photosynthetic antenna of brown-coloured species of Green Sulfur Bacteria (GSB).The first part of the work has focused on the development of two different reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) methods to study the diversity of carotenoids from different species of GSB (Chapter 3). We also introduced a pre-treatment of samples that provides a better resolution on the separation of all carotenoids including the all-trans and cis isomers, in a run time of 45 min. For complex pigment samples, such as untreated extracts or sediment pigment samples where a high diversity of pigments is suspected, we modified an existing method (Borrego and Garcia-Gil, 1994) to achieve the complete separation of all carotenoids as well as all the different bacteriochlorophylls (BChls) homologues and algal pigments. This modification was successfully applied for the detection and identification of pigments in ancient sediments (0.7-1.5 million years-old) from a quarry located in the lacustrine area of Banyoles. The detection of signature pigments for brown-coloured GSB confirmed the presence of GSB in the lacustrine area of Banyoles at least since mid-Pleistocene.In this first part we also analyzed the carotenoids from Chlorobium (Chl) phaeobacteroides CL1401 by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) to confirm their identification and determine their molecular mass. Besides, several experiments were done to evaluate the effect of temperature, light and different oxidising and reducing chemical agents in the quantitative and qualitative composition of carotenoids and BCls in Chl. phaeobacteroides CL1401. These results confirmed that BCls are easily photodamaged and that the all-trans and cis isomers are constitutive components of the photosynthetic apparatus of GSB and then they are not artefacts produced during sample manipulation.Chapter 4 compiles a series of experiments carried out to elucidate the dynamics of pigment synthesis during growth of several species of GSB under different light conditions. Also these investigations allowed us to monitor the changes in the number of reaction centers (RC) during the light adaptation process. The number of RC was determined from the chromatographic quantification of BChl663, the primary acceptor in the electron transport chain in GSB. The estimation of RC per chlorosome was done according to both previous pigment stoichiometries and biometric values and from the experimental data obtained in this work. An average value of 70 RC per chlorosome was obtained. This value agrees with current models of pigment composition in the photosynthetic apparatus of GSB.In this chapter the study of the evolution of trans/cis ratios for the main carotenoids in GSB during light adaptation is also included. This ratio was calculated for different strains and chlorosomes of GSB and also from natural populations of Chl. phaeobacteroides thriving in a meromictic lake. No differences were found for the trans/cis ratio between cultures grown at saturating and limiting light conditions (trans/cis ratio of 2). Furthermore, similar values were found in isolated chlorosomes of different brown-coloured strains of GSB and in natural populations. In this case the trans/cis ratio remained fairly constant throughout the water column and also along the studied growth period of the population. Finally, in Chapter 5 we present a new molecular marker for the specific detection of brown-species of GSB. Although the designed primers originally targeted a gene involved in the biosynthetic pathway of carotenoids (CrtY that encodes a lycopene cyclase), final sequence retrieved matches with a gene related to the Polyketide ketosynthases protein family. The precise function of this protein in GSB remains hitherto unknown. However, the availability of this molecular tool opens the door for future investigations on the microbial ecology of brown-coloured species of GSB using techniques as Real-time PCR to selectively monitor populations of these microorganisms in their natural habitats.

El objetivo de esta Tesis es el estudio de diferentes comportamientos celulares dinámicos en Escherichia coli y Bacillus subtilis. Es interesante comprender cómo estos organismos sencillos poseen mecanismos complejos para responder al entorno en el que se encuentran. Dicha respuesta está regulada por complicadas redes de regulación formadas por genes y proteínas, donde al igual que los instrumentistas de una orquesta, cada elemento de las redes genéticas debe tomar parte en armonía, en el momento justo y la cantidad adecuada para dar lugar a la respuesta celular apropiada. La Parte I introduce aspectos básicos de la metodología utilizada y conceptos fundamentales para la comprensión de los resultados. El Capítulo 1 es una breve introducción a los circuitos de regulación genética y el uso de proteínas fluorescentes para el estudio in vivo y en células individuales de la dinámica de dichos circuitos. El Capítulo 2 describe los materiales y técnicas utilizadas, desde el cultivo y obtención de cepas bacterianas, los métodos para filmar dichas cepas con microscopía de fluorescencia temporalizada, al análisis de las imágenes. El Capítulo 3 describe las características básicas de los procesos biológicos de estudio. El Capítulo 4 describe ciertos aspectos de la dinámica celular como el comportamiento oscilatorio o excitable de algunos sistemas biológicos, y las herramientas matemáticas usadas para contrastar los datos experimentales. La Parte II corresponde a los resultados. El Capítulo 5 describe los resultados del estudio del control del inicio de la replicación cromosómica en E. coli. Mediante una serie de perturbaciones en las proteínas que regulan este proceso, y mediante el análisis de las imágenes obtenidas por microscopía, se cuantificó el efecto ejercido sobre el inicio de replicación, comparando los resultados con una cepa control. El Capítulo 6 describe los resultados del estudio de la forma en que el circuito genético que regula la competencia en B. subtilis integra múltiples señales simultáneas. Se caracterizó experimentalmente y con un análisis de bifurcación del modelo matemático del circuito, la respuesta en células individuales e in vivo a señales químicas de diferente intensidad que controlan la expresión constitutiva de los genes que forman el circuito, y a la variación del número de copias de uno de estos genes. El Capítulo 7 describe los resultados del estudio del proceso de toma de decisión celular en B. subtilis, basado en la decisión de estas bacterias por optar entre los programas de diferenciación en competencia genética y esporulación, los cuales compiten entre sí en el tiempo. El análisis simultáneo y en células individuales de ambos programas permitió descubrir por qué las bacterias optan por uno u otro mediante un mecanismo de carrera molecular entre estos dos programas en competición. El Capítulo 8 describe los resultados del estudio de la adaptación celular al estrés mediante esporulación y la toma de decisión de una forma robusta en B. subtilis. Se analizó de forma cuantitativa la expresión de los genes implicados en la progresión hacia la formación de esporas y se desarrolló un modelo matemático poblacional para estudiar el efecto de la reversibilidad en el proceso de adaptación celular a cambios en los niveles de estrés. La Parte III corresponde a las Conclusiones y la perspectiva futura para los resultados descritos en la Parte II. Los resultados obtenidos contribuyen a la comprensión de determinados comportamientos en E. coli y B. subtilis. Estas bacterias, sencillas si se comparan con organismos superiores, ofrecen la posibilidad de estudiar mecanismos utilizados por sistemas más complejos, pero que para su estudio se requieren técnicas complicadas. El estudio en células individuales de la dinámica de redes de regulación mediante las técnicas utilizadas nos permite el análisis in vivo y en tiempo real de lo que sucede con dichas redes en el interior de las células respecto al exterior celular. / The aim of this Thesis is the study of different dynamic cellular behaviors in Escherichia coli and Bacillus subtilis. It is interesting to understand how these simple organisms have not so simple mechanisms to respond to their environment. This response is regulated by complex regulatory networks consisting of genes and proteins, where as instrumentalists in an orchestra, each element of the network should operates in harmony, at the right time and the right amount to give an appropriate cellular response. Part I introduces basic aspects of the methodology and concepts for the understanding of the results presented in this Thesis. Chapter 1 provides a brief introduction to genetic regulatory circuits and the fluorescent proteins used for the study of the dynamics of such circuits in vivo and in individual cells. Chapter 2 describes the materials and techniques used, from growing and obtaining bacterial strains, to the methodology used for filming these strains by temporalized fluorescence microscopy, and to the analysis of the obtained images. Chapter 3 describes the main features of the dynamical biological processes studied in E. coli and B. subtilis. Chapter 4 refers to certain aspects of cellular dynamics such as oscillatory or excitable behavior of some biological systems, as well as the mathematical tools used to compare the data obtained experimentally. Part II corresponds to the results. Chapter 5 describes the results of the study of the control of chromosome replication initiation in E. coli. We implemented a set of perturbations in the main proteins that regulate this process, and their effect on the initiation of replication, quantified by analyzing the images obtained by fluorescence microscopy, comparing the results with a control strain. Chapter 6 describes the results obtained from the study of how a genetic circuit in B. subtilis, namely the one regulating competence, integrates multiple simultaneous inputs. We characterized experimentally the response of individual cells in vivo to different chemical signals that control the strength of the constitutive expression of genes forming the circuit, in addition to the copy number variation of one of these genes. The results were compared with a bifurcation analysis of the mathematical model of the circuit. Chapter 7 describes the results obtained in a study of the decision making process of microorganism B. subtilis. Specifically, we studied the decision of these bacteria between two differentiation programs such as genetic competence and sporulation, which compete with each other in time. The simultaneous analysis in individual cells of both programs allowed us to uncover the way in which bacteria choose between these two competing programs, showing that the competition occurs through a molecular race. Finally, Chapter 8 describes the results obtained in the study of reversible progression towards an all-or-none switch in the sporulation of B. subtilis. We quantitatively analyzed the expression of genes involved in the progression towards spore formation and a population model was developed to study the effect of reversibility in the process of cellular adaptation to changes in stress levels. Part III details the conclusions and a description of the possible future perspectives for each of the results described in Part II. The results obtained contribute to the understanding of certain dynamic behaviors in the microorganisms E. coli and B. subtilis. These bacteria, although simple when compared with higher organisms, offer the possibility of studying mechanisms that are frequently utilized by more complex systems, which require more sophisticated analysis techniques. The study at the single cell level of network dynamics of gene regulation by the techniques used in this Thesis, allows the analysis in vivo and in real time of the underlying dynamic of such networks inside cells in response to the cell environment.

The genus Arcobacter, belongs to the family Campylobacteraceae, along with. Some species, are considered emerging pathogens and have been associated with gastrointestinal diseases and bacteraemia in humans and with diarrhoea, mastitis and abortions in animals. Diarrhoea, is the most common clinical presentation in humans. However, still are not fully defined the routes of transmission, the virulence factors present in pathogenic strains have not been determined and the isolation and identification methods are still deficient. All of these factors contribute to a possible underestimation of the sanitary importance of this genus. In this thesis it has been demonstrated the existence of five new species of this genus. In their differentiation, new tools have been used, such as the Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI TOF) Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) with concatenated 5 genes (rpoB, gyrB, hsp60, gyrA and atpA). Furthermore, the performance of 5 molecular identification methods was compared and none of them was useful for all the strains studied. In this regard, the updating of 16S rRNARFLP method for the identification of all species proved very useful. Moreover, in this thesis was a great diversity of species of this genus in samples of shellfish and sewage. Both matrices have epidemiological importance; however, they have been poorly studied. It was also demonstrated that the use in parallel of direct culturing and post enrichment, as well as the incubation under aerobic and microaerophilic, enhances the recovery and diversity of arcobacters. Regarding the virulence of Arcobacter spp., most of them proved to be potential enteropathogens for man, as they showed the presence of virulence factors and were able to adhere and invade human intestinal cells (Caco-2). Finally, it was demonstrated that Arcobacter may be confused with Campylobacter sp., generating an underestimation of their sanitary importance. / El género Arcobacter incluye especies consideradas patógenos emergentes, ya que se han asociado con patologías gastrointestinales y bacteriemia en humanos y con diarrea, mastitis y abortos en animales. Sin embargo, aún no se ha definido completamente las rutas de transmisión, los factores de virulencia presentes en cepas patogénicas no se han determinado y los métodos de aislamiento e identificación aún son deficientes. Todo esto genera una subestimación de la importancia sanitaria de Arcobacter. En esta tesis doctoral se demostró la existencia de 5 nuevas especies de este género. Para su diferenciación se utilizó herramientas nuevas, tales como el Matrix Assisted Laser desorption Ionization Time of Flight (MALDI TOF) y un Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) con 5 genes concatenados (rpoB, gyrB, hsp60, atpA y gyrA). Considerando el número de especies incluidas actualmente en el género (n=17), se evaluó si 5 de los métodos moleculares de identificación son todavía útiles para la identificación de las especies para las que se habían definido o si se generan confusiones, demostrrando que todos ellos generan algún error que osciló entre el 16,8% y 67,4% de las cepas estudiadas. En este sentido, la ampliación del método 16S rRNA-RFLP para poder identificar todas las especies resultó ser de gran utilidad. Por otra parte, en esta tesis se observó una gran diversidad de especies de este género en muestras de mariscos y aguas residuales. Ambas matrices han sido poco estudiados a pesar de su importancia epidemiológica. Más aún, se demostró que el uso en paralelo del cultivo por siembra directa y post enriquecimiento, además de incubación en aerobiosis y microaerofilia, favorece la recuperación de una mayor diversidad. Por otra parte, también se demostró que la mayoría de las especies de este género, en especial algunas cepas A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii, A. trophiarum y A. defluvii, son potenciales enteropatógenos para el hombre, ya que presentaron factores de virulencia y fueron capaces de adherir e invadir células intestinales humanas (Caco-2). Por último, se demostró que Arcobacter puede ser confundido con Campylobacter sp., lo que puede contribuir aún más a subestimar su importancia sanitaria.