La flore intestinale, composée de l’ensemble des microorganismes retrouvés dans le tractus digestif, joue un rôle essentiel dans le développement et l’homéostasie du système immunitaire. Son altération est associée à de multiples maladies inflammatoires ayant des répercussions non seulement à l’intestin, mais bien dans l’ensemble de l’organisme. Les causes de cette dérégulation restent toutefois méconnues. Parmi les multiples facteurs susceptibles de moduler sa composition, on retrouve plusieurs enzymes bactéricides produites à l’intestin. L’une de ces protéines, la phospholipase A2-IIA sécrétée (sPLA2-IIA), est fortement surexprimée en condition inflammatoire. Nous avons émis l’hypothèse que la surexpression de la sPLA2-IIA à l’intestin au cours de maladies inflammatoires pourrait altérer la composition de la flore intestinale, contribuant ainsi à la physiopathologie de ces maladies. L’utilisation de souris surexprimant la sPLA2-IIA humaine (sPLA2-IIATGN) nous a permis d’observer l’apparition spontanée d’un désordre immunitaire encore jamais caractérisé dans ce modèle. En nous intéressant à l’impact de cette enzyme sur la flore intestinale, nous avons pu identifier plusieurs altérations dans le microbiome de ces souris. Nos résultats suggèrent également que l’environnement, et plus spécifiquement le microbiote intestinal, joue un important rôle dans le développement de ce désordre immunitaire. Nos résultats suggèrent que la modulation de l’inflammation systémique par la sPLA2-IIA est dépendante de la flore intestinale. / The mammalian digestive tract harbors trillions of microorganisms that collectively form the intestinal microbiota. This flora has been shown to play a prominent role in the development and homeostasis of the immune system. As such, its alteration was associated with a wide array of inflammatory diseases with intestinal and systemic afflictions. However, the cause of this unbalance remains poorly understood. While the intestinal flora may be regulated by a large number of environmental factors, multiple endogenous intestinal enzymes have been shown or proposed to play an important part in the shaping of its composition. One of those enzymes, the secreted phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA), possesses great bactericidal properties and is overexpressed during multiple inflammatory disorders. We hypothesized that the overexpression of sPLA2-IIA in the intestine during inflammatory processes could alter the composition of the intestinal microbiota, thereby contributing to the pathophysiology of those diseases. To verify this hypothesis, we used transgenic mice overexpressing the human sPLA2- IIA (sPLA2-IIATGN) and observed a yet uncharacterized spontaneous immune disorder in this model. We aimed to evaluate the impact of sPLA2-IIA on the intestinal flora in this model. We identified multiple alterations in the microbiome of sPLA2-IIATGN mice. Our results also suggest that the environment, and more specifically the intestinal microbiota, play a prominent role in the development of this immune disorder. Our results suggest that the modulation of systemic inflammation by sPLA2-IIA is dependent upon the intestinal flora.

La connaissance du microbiote du lait est importante pour contrôler la qualité microbiologique du lait. Le but de cette étude était d'évaluer la diversité et la dynamique de la communauté microbienne de laits traités et non traités entreposés à basse température par les méthodes d'empreintes moléculaires telles que la banque de clones d'ADNr 16S, la PCR quantitative (qPCR), le polymorphisme des longueurs des fragments de restriction terminaux (T-RFLP) et l'électrophorèse sur gel de gradient dénaturant (DGGE). Des laits crus (UT) ont été traités par addition de gaz carbonique (CO₂), thermisation (TH) ou microfiltration (MF) et ont été entreposés à 4 °C et à 8 °C pendant 7 jours. Les banques de clones ont permis de déterminer la composition de la population bactérienne des laits. Les deux unités taxonomiques opérationnelles (UTOs) les plus abondantes dans la banque de clones appartenaient aux classes Gammaproteobacteria et Bacilli. Les genres bactériens dominants dans les laits traités (UT, CO₂ et TH) ont été affiliés à Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Aerococcus, Facklamia, Corynebacterium, Acinetobacter et Trichococcus. Les bactéries dominantes dans les laits microfiltrés étaient associées à Stenotrophomonas maltophilia et Delftia acidovorans tandis que Staphylococcus aureus dominait dans les laits thermisés. La qPCR a été utilisée pour quantifier les bactéries dominantes dans les laits traités. Pseudomonas fluorescens dominait la population bactérienne dans les laits UT et CO₂ entreposés pendant 7 jours tandis que Streptococcus uberis dominait dans les laits CO₂ entreposés à 8 °C Les profils de PCR-DGGE ont démontré l'effet des traitements (TH, CO₂ et MF) sur les bactéries dominantes des laits traités. Les profils de T-RFLP ont démontré que l'abondance et la diversité de la communauté bactérienne a été affectée par les traitements. Le T-RFLP a démontré la dynamique des bactéries spécifiques dans les laits traités. Ces bactéries pourraient être ainsi utilisées comme marqueur dans les laits traités. Le T-RFLP a une résolution plus élevée que la PCR-DGGE lors de l'analyse des laits traités. Cette étude montre que des bactéries spécifiques peuvent se développer pendant l'entreposage à basse température des laits traités. Les objectifs fixés dans cette étude ont été atteints avec succès en employant des méthodes moléculaires. Ce projet a ainsi mis en évidence le potentiel des méthodes moléculaires dans l'analyse de la population microbienne du lait.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Malgré la pasteurisation obligatoire du lait de consommation et la mise en place de bonnes pratiques de fabrication et d'hygiène dans les usines de transformation laitière, certains microorganismes résistants à la chaleur ou issus de phénomènes de post-contamination peuvent se retrouver dans les produits laitiers transformés et s'y développer. En plus d'entraîner des pertes alimentaires et économiques en raison du non-respect des normes microbiologiques ou des diverses altérations occasionnées, les microorganismes associés aux produits laitiers non-conformes et/ou atypiques (PL-NC/AT) constituent une préoccupation majeure pour les industries laitières en raison de leur capacité potentielle à former des biofilms sur les surfaces et à résister à certains désinfectants et antibiotiques. Ce projet de recherche visait à isoler, identifier et caractériser les microorganismes provenant de PL-NC/AT afin de bâtir une collection microbienne documentée de référence. En collaboration avec plusieurs industries laitières et fromagères, 105 souches de bactéries, levures et moisissures problématiques, issues de différents PL-NC/AT (lait, crème, crème glacée et fromages), ont été isolées par culture et identifiées par MALDI-TOF ou séquençage. La caractérisation de cette diversité d'isolats a permis de mettre en évidence que la majorité de ces souches étaient sensibles à un traitement de chaleur équivalent à une pasteurisation, suggérant que ces microorganismes auraient été réintroduits dans les produits laitiers par post-contamination. Près de 25 souches bactériennes se sont d'ailleurs révélées être d'importantes productrices de biofilms en microplaques de 96 puits et 13 de ces souches ont démontré une résistance élevée à un traitement de 5 minutes à l'acide peracétique (100 ppm) et à l'hypochlorite de sodium (70 ppm) en microplaques MBEC. De plus, 56 isolats bactériens ont présenté une résistance contre l'ampicilline, la fosfomycine et/ou la ceftriaxone. Ces nouvelles connaissances pourront guider et mener à l'élaboration de mesures innovantes dans le contrôle et la prévention des contaminations microbiologiques dans l'industrie laitière. / Despite the mandatory pasteurization of fluid milk and the implementation of good manufacturing and hygiene practices in dairy processing plants, some heat-resistant microorganisms or other microorganisms resulting from post-pasteurization contamination can be found in processed dairy products. In addition to causing food and economic losses due to spoilage or non-compliance with microbiological standards, microorganisms associated with non-compliant and/or atypical dairy products (NC/AT-DP) are a major concern for dairy industries due to their potential ability to form biofilms and to resist to some disinfectants and antimicrobial agents. The objective of this project was to isolate, identify and characterize microorganisms from NC/AT-DP to create a documented microbial collection. In collaboration with several dairy and cheese industries, 105 strains of problematic bacteria, yeasts, and molds from various NC/AT-DP (milk, cream, ice cream and cheese) were isolated by culture and identified by MALDI-TOF or sequencing. The characterization of these isolates demonstrated that most of the strains were sensitive to a heat treatment equivalent to pasteurization, suggesting that these microorganisms would have been reintroduced into dairy products by post- pasteurization contamination. Nearly 25 bacterial strains have also shown to be moderate or strong biofilm-producers in 96-well microplates and 13 of these strains have demonstrated a high resistance to a 5-minute treatment with peracetic acid (100 ppm) and sodium hypochlorite (70 ppm) in MBEC microplates. In addition, 56 bacterial isolates showed resistance against ampicillin, fosfomycin and/or ceftriaxone. These results will guide and may lead to the development of new strategies to control and prevent microbiological contamination in the dairy sector.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / La fréquentation des spas peut entraîner des infections par les bactéries Legionella (pneumonies sévères) et Pseudomonas aeruginosa (lésions cutanées). Peu de données sont toutefois disponibles sur la contamination microbiologique de ces bassins. Des paramètres microbiologiques et physicochimiques de l'eau de 95 spas du Québec ont été mesurés durant l'été 2008. Les gestionnaires ont aussi répondu à un questionnaire sur leur entretien. Une proportion de 2% des spas était contaminée par Escherichia' coli, 41% par Pseudomonas aeruginosa et 22% par Legionella. Dans 25% des spas, des bactéries ont été détectées en concentrations préoccupantes. Les paramètres physicochimiques s'écartaient fréquemment des valeurs recommandées. Seulement quatre gestionnaires étaient formés (4%). Une bonne filtration, un nettoyage fréquent du spa et une désinfection adéquate limitaient efficacement la contamination microbiologique. Des efforts devraient être faits pour adapter les réglementations aux spas qui abritent un écosystème différent des piscines. Une meilleure formation des gestionnaires est également nécessaire.

Les éclosions virales constituent des menaces persistantes pour les établissements de soins. En plus de compromettre la santé des usagers, du personnel et des visiteurs, ces éclosions représentent d'énormes défis de gestion des ressources humaines, matérielles et financières. La pandémie de SRAS-CoV-2 sévissant depuis plus d'une année a mis en lumière la méconnaissance du rôle de l'air dans la transmission des virus. Des technologies de traitement de l'air pourraient contribuer au contrôle des virus aérosolisés et éventuellement à la protection des occupants des milieux de soins. Dans le cadre de ce doctorat, une stratégie de traitement de l'air utilisant l'ozone a été testée pour inactiver des bioaérosols viraux. Afin d'obtenir un portrait de la contamination aérienne en milieu hospitalier, une campagne d'échantillonnage a été menée lors de trois éclosions d'influenza. Enfin, la production d'aérosols pendant le traitement d'échantillons en laboratoire clinique a été examinée. Dans la première étude, le norovirus murin ainsi que les bactériophages PhiX174, Phi6, PR772 et MS2 ont été nébulisés dans une chambre d'aérosols rotative et exposés à un traitement de l'air utilisant l'ozone à différents niveaux d'humidité relative. Le norovirus murin a été exposé à 0,23 ppm d'ozone et à 20% et 85% d'humidité relative alors que les bactériophages ont été exposés à 1,13 ppm d'ozone et à trois humidités relatives, soit 20%, 55% et 85%. Pour tous les virus, des temps d'exposition de 10, 40 et 70 minutes ont été évalués. Ce traitement a été comparé à une condition de référence, qui consistait en une exposition à l'air. Les aérosols ont été récupérés à l'aide d'un échantillonneur d'air et les virus ont été quantifiés en culture et par biologie moléculaire. Des ratios infectieux ont été calculés afin de déterminer la réduction de l'infectiosité virale attribuable au traitement à l'ozone. Une inactivation d'au moins deux ordres de grandeur a été observée après 40 minutes d'exposition à l'ozone à 85% d'humidité relative pour PhiX174, MS2 et MNV-1. Une exposition à la condition de référence à 20% d'humidité relative pendant 10 minutes a été suffisante pour une inactivation similaire des bactériophages PR772 et Phi6. Ce même traitement de l'air a ensuite été évalué pour l'inactivation d'aérosols d'influenza et du virus respiratoire syncytial. Toutefois, dans le cas de ce second virus, la perte d'infectiosité lors des procédés d'aérosolisation et d'échantillonnage était trop importante pour pouvoir l'exposer à l'ozone. Concernant l'influenza, des concentrations d'ozone de 0,23 et 1,70 ppm ont été testées à des niveaux faibles et élevés d'humidité relative. Deux suppléments, l'un de nature lipidique et l'autre de nature protéique, ont été ajoutés au lysat viral afin de quantifier l'effet protecteur qu'ils pourraient procurer aux virus aérosolisés. Une condition sans supplément a aussi été testée à des fins de comparaison. Une exposition pendant 80 minutes à une concentration d'ozone de 1,70 ppm combinée à une humidité relative élevée a engendré la meilleure inactivation, soit une réduction de quatre ordres de grandeur, pour les aérosols sans supplément ou additionnés de supplément protéique Lors de la troisième étude, l'air d'un milieu hospitalier en contexte d'éclosion grippale a été échantillonné à trois reprises. L'efficacité de récupération de trois appareils, dont deux fonctionnant à haut débit et un à bas débit, a été évaluée. Cette campagne a révélé une variabilité des concentrations aériennes d'influenza A et B entre les éclosions. Bien que des concentrations maximales de l'ordre de 10⁵ copies d'ARN/m³ aient été détectées, aucun virus infectieux n'a été quantifié. Finalement, la génération d'aérosols pendant le traitement d'échantillons sanguins et urinaires dans un laboratoire clinique de biochimie a été examinée. Les employés redoutaient de produire des aérosols contenant du SRAS-CoV-2 infectieux à partir d'échantillons récoltés chez des patients infectés par la COVID-19. Pour ce projet, une culture liquide d'une bactérie modèle a été employée en remplacement des échantillons cliniques. Trois méthodes de collecte ont été utilisées pour évaluer la production d'aérosols, soit le prélèvement d'air par un appareil standard, l'emploi de boîtes indicatrices et l'écouvillonnage de surfaces. Aucune bactérie n'a été récupérée par ces trois méthodes d'échantillonnage, ce qui indique que les procédures de traitement étudiées n'ont produit qu'une faible quantité d'aérosols. / Viral outbreaks are recurring threats to healthcare facilities. While putting the health of users, staff and visitors at risk, these outbreaks represent enormous challenges in the management of human, material and financial resources. The SARS-CoV-2 pandemic. The SARS-CoV-2 pandemic, which has been raging for more than a year, has highlighted the misunderstanding of the role of air in the transmission of viruses. Air treatment technologies could contribute to the control of airborne viruses and eventually to the protection of healthcare occupants. During this doctoral program, an air treatment strategy using ozone was assessed for the inactivation of viral bioaerosols. To obtain a global portrait of airborne contamination in a hospital environment, an air sampling campaign was conducted during three influenza outbreaks. At last, the aerosol production during sample treatment in a clinical laboratory was examined. In the first study, murine norovirus and bacteriophages PhiX174, Phi6, PR772 and MS2 were nebulized in a rotative aerosol chamber and exposed to an air treatment using ozone at different relative humidity levels. The murine norovirus was exposed to 0.23 ppm of ozone and 20% and 85% of relative humidity while the bacteriophages were exposed to 1.13 ppm of ozone and three relative humidity: 20%, 55% and 85%. For all viruses, exposure times of 10, 40 and 70 minutes were evaluated. This treatment was compared to a reference condition, which was air exposure. The aerosols were collected with an air sampler and viruses were quantified using both culture and molecular biology. Infectious ratios were calculated to determine the viral infectivity reduction that was attributable to ozone. An inactivation of at least two orders of magnitude was obtained for an ozone exposure of 40 minutes at 85% of relative humidity for PhiX174, MS2 and MNV-1. Exposure to the reference condition at 20% of relative humidity for 10 minutes was sufficient for a similar inactivation of bacteriophages PR772 and Phi6. The same air treatment was then evaluated for the inactivation of influenza or respiratory syncytial virus aerosols. However, the infectivity loss of the respiratory syncytial virus during aerosolization and sampling processes was too elevated for ozone exposure. For influenza, ozone concentrations of 0.23 and 1.70 ppm were tested at low and high relative humidity levels. Two supplements, one lipid-based and the other protein-based were added to the viral lysate to quantify their protective effect for airborne viruses. A condition without a supplement was also tested for comparison purposes. Exposure to 1.70 ppm of ozone at high relative humidity for 80 minutes yielded the greatest inactivation, which was a reduction of four orders of magnitude for aerosols without supplement or with the protein-based supplement. In the third study, the air in a hospital environment during influenza outbreaks was sampled three times. The collection efficiency of three air samplers, two high flowrate and one low flowrate, was evaluated. This campaign revealed a variability between outbreaks in regards to airborne influenza A and B concentrations. While concentrations of up to 10⁵ RNA copies/m³ were detected, no infectious virus could be quantified. Lastly, aerosol generation during blood and urine sample treatment in a clinical biochemistry laboratory was examined. Employees feared producing infectious SARS-CoV-2 containing aerosols from samples collected from COVID-19 infected patients. For this project, a liquid culture of a model bacteria was employed to replace clinical samples. The sampling methods were used to evaluate aerosol production: air sampling using a standard device, the use of settling plates and surface swabbing. No bacteria were recovered by these three sampling methods, which indicates that the studied sample treatment procedures produce low quantities of aerosols.

L’objectif de cette étude était de vérifier la biocompatibilité entre les mycètes du fromage Camembert et les bactéries lactiques (probiotiques ou d’affinage). La plupart des souches fongiques utilisées ont été isolées de laits en provenance du terroir québécois et deux laits d’origines différentes ont servi pour la fabrication de caillés modèles. La spectrophotométrie automatisée (SA) a été employée pour présélectionner des mélanges de souches mycéliennes et bactériennes biocompatibles. Des milieux à base de lait furent fermentés par des mycètes et étaient ensuite inoculés avec les bactéries. La croissance préalable des mycètes stimulait ou inhibait les bactéries, mais les effets étaient mineurs et variaient selon les souches. Par la suite, afin de confirmer ces résultats, des caillés modèles ont été inoculés simultanément par des combinaisons de bactéries et de mycètes. L’absence d’inhibition des bactéries par les mycètes observée en SA a été confirmée, mais les interactions en caillé modèle différaient de celles notées en SA en raison de l’évolution différente du pH dans les deux séries expérimentales. Finalement, des fromages Camembert probiotiques ont été fabriqués avec des souches du terroir et commerciales. Le Camembert s’est révélé un aliment intéressant pour favoriser la survie des bactéries lactiques. Par contre, aucun mélange de souches fongiques n’a été systématiquement meilleur qu’un autre pour stimuler la viabilité des probiotiques. / This study was carried out to verify the biocompatibility between the mycetes of Camembert cheese and lactic cultures (probiotic and ripening strains). Most of the fungi strains used had been isolated from different milk sources over the province of Quebec (Canada) and two different kinds of milk were used to produce cheese slurries. Automated spectrophotometry (AS) was employed to screen some biocompatible pairings of mycete and bacterial strains. A milk medium was fermented by yeasts and moulds and then inoculated with bacteria. The previous growth of the mycetes was sometimes stimulatory and sometimes inhibitory, but the effects were minor and varied as a function of the strains. Subsequently, to confirm these AS results, cheese slurries were inoculated simultaneously with different strains combinations. Finally, pilot scale Camembert cheese was produced to verify its ability to support probiotic bacterial cultures viability. The absence of inhibition of the bacteria by the mycetes in SA was confirmed, but the interactions in the cheese slurries differed from those noted in AS because of the different pH patterns in the two experimental series. Camembert was shown to have potential to favour the viability of probiotic bacterial strains during ripening and storage. However, no mycete mix was systematically better than another to stimulate this viability.

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène opportuniste ubiquitaire. Les souches LES (Liverpool Epidemic Strain), associées à des infections pulmonaires chroniques, ont initialement été isolées en 1988 des expectorations de patients souffrant de fibrose kystique. Leurs nombreux facteurs de virulence, comme l'importante production de biofilm, rendent ces bactéries particulièrement difficiles à éradiquer. Des mutants de la souche LESB58, une souche LES, ont été obtenus grâce à la mutagenèse par étiquette. Trois mutants sélectionnés suite à leur avirulence chez le rat, l'amibe et la drosophile ont été obtenus: L70T18G, L138T21T et L155T7T. L'objectif de cette maîtrise est d'établir un lien entre la perte de virulence et les gènes mutés via l'analyse phénotypique des mutants. Une caractérisation des mutants a été réalisée par analyse du biofilm en microfluidique, des tests de détection des lipases, de pigmentation et de prédation en utilisant l'amibe. L'effet de l'ion magnésium (Mg²⁺) sur certains facteurs de virulence a également été mesuré. En microfluidique, la morphologie générale du biofilm attaché varie peu d'une souche à l'autre. L155T7T ne semble pas être capable de produire du biofilm en condition de microfluidique tandis que L138T21T s'établit plus rapidement que la souche sauvage. Un défaut de pigmentation chez la souche L138T21T est observable sur les différents milieux utilisés. Les mutants ne semblent pas présenter de défaut au niveau de leur sécrétion de lipases. De plus, suite à l'ajout de l'ion Mg²⁺, L70T18G, voit sa résistance à la prédation amibienne augmenter tandis que la souche sauvage perd de sa résistance. Chaque mutant présente un profil phénotypique distinct qui suggère que la virulence de la souche LESB58 est une combinaison de différents facteurs. Pour compléter la caractérisation et mieux jauger l'importance relative des différents facteurs de virulence, il serait intéressant d'effectuer d'autres tests comme l'ajout d'ions en microfluidique. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous opportunistic pathogen. The LES (Liverpool Epidemic Strain) strains, associated with chronic pulmonary infections, were initially isolated in 1988 from the sputum of patients suffering from cystic fibrosis. Their many virulence factors, such as the high production of biofilm, make these bacteria particularly difficult to eradicate. Mutants of the LESB58 strain, a LES strain, were obtained by signature-tagged mutagenesis. Three mutants selected for their avirulence in rats, amoeba and drosophila were obtained: L70T18G, L138T21T and L155T7T. In order to establish a link between these genes and the loss of virulence of the corresponding mutants, a phenotypic analysis of the mutants constitutes the objective of this project. Characterization of the mutants was performed by microfluidic biofilm analysis as well as lipase detection, pigmentation and amoeba-based predation tests. The effect of the magnesium ion (Mg²⁺) on some virulence factors was also measured. In microfluidics, the general morphology of the attached biofilm slightly varies from one strain to another. L155T7T does not appear to be able to produce biofilm under microfluidic conditions while L138T21T establishes a biofilm faster than the wild strain inside the channels. A pigmentation defect in the L138T21T strain is observable on the various media used. The mutants do not seem to present any defect in their secretion of lipases. Moreover, following the addition of the Mg²⁺ ion, L70T18G sees its resistance to predation by amoebae increased while the wild strain loses resistance. Each mutant exhibits a distinct phenotypic profile which suggests that the virulence of strain LESB58 is a combination of different factors. To complete the characterization and better gauge the relative importance of the different virulence factors, it would be interesting to perform othertests such as the addition of ions in microfluidics.

La bactérie Aeromonas salmonicida utilise le système de sécrétion de type trois (SSTT) pour injecter des effecteurs à l'intérieur des cellules de l'hôte lors de l'infection. L'étude du génome d'A. salmonicida a révélé l'existence d'Ati2, un nouvel effecteur du SSTT. Ce projet avait pour but d'étudier la relation structure-fonction d'Ati2 afin de déterminer son rôle dans la virulence d'A. salmonicida. Des analyses biochimiques et en modélisation moléculaire ont permis de démontrer qu'Ati2 est une inositol polyphosphate 5-phosphatase qui hydrolyse les PtdIns(4,5)P₂ et les PtdIns(3,4,5)P₃. Divers mutants d'Ati2 ont été produits et clones dans des vecteurs d'expression chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Les tests d'expression ont démontré qu'Ati2 est toxique pour l'amibe et que cela est lié à son activité catalytique. Ce projet de recherche a ainsi permis de démontrer l'existence d'un nouvel effecteur du SSTT et d'en spécifier la fonction dans la pathogénicité d'A. salmonicida.

Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) sont souvent associés à des maladies d'origine alimentaire incriminants des aliments minimalement transformés. Comme les méthodes de culture virale demeurent limitées pour une utilisation de routine, il est nécessaire de concentrer les virions présents à la surface des aliments avant leur détection. Le but ultime de cette étape est de séparer les virus de la matrice alimentaire, de les concentrer et d'éliminer les inhibiteurs pouvant affecter la détection. L'organisation internationale de normalisation (ISO) a publié des procédures de détection des virus dans les aliments. Cependant, elles varient grandement en fonction des aliments étudiés, tout en étant longues et laborieuses. Elles nécessitent aussi du personnel qualifié et comportent plusieurs étapes risquant de réduire la récupération virale, cela rendant leur utilisation difficile comme analyse de routine. C'est pourquoi le développement d'étapes de concentration, de purification et d'extraction du matériel génétique rapides et sensibles, limitant les étapes manuelles s'avère nécessaire. Le premier objectif de ce projet était de développer une nouvelle approche de concentration des virus en vue d'une meilleure surveillance dans les aliments. L'approche développée se base sur l'ultrafiltration pour une récupération des particules virales à la suite de leur élution de la surface d'aliments. La méthode optimisée a, par la suite, été comparée à la méthode de référence ISO 15 216-1 :2017 en utilisant des fraises, framboises et mûres fraîches et congelées ainsi que de la laitue et des oignons verts frais. Les résultats ont montré une réduction importante du temps d'expérimentation face à la méthode de référence, tout en conservant une détection à des faibles concentrations de VHA et des HuNoVs. Sauf pour la framboise, la méthode d'ultrafiltration était généralement équivalente à la méthode de référence, quel que soit le virus testé. Le deuxième objectif avait pour but de comparer une nouvelle méthode d'extraction automatisée optimisée pour les HuNoVs GI et GII puis le VHA à une méthode du commerce semi-automatisée applicable sur plusieurs matrices alimentaires à risque. Pour les framboises fraîches, les huîtres et la laitue romaine, les deux plateformes d'extraction ont été jugées équivalentes. Tandis que la méthode automatisée a permis une meilleure récupération pour les framboises congelées et une inhibition moindre pour les échantillons de mûres congelées. Le troisième objectif avait finalement pour but d'évaluer la persistance d'ARN de VHA provenant de virions inactivés à la chaleur. L'ARN était dilué à différentes concentrations puis ajouté à des solutions (eau et tampon phosphate salin) ou déposé sur des surfaces (acier inoxydable, polychlorure de vinyle et bleuets). La persistance de l'ARN était mesurée à différentes températures d'entreposage (-80 °C, -20 °C, 4 °C et 23 °C) sur une période de 90 Jours. En solution, sur le polychlorure de vinyle et sur les bleuets, l'ARN a été détecté dans la plupart des conditions jusqu'à 90 jours d'entreposage. Les résultats suggèrent cependant une dégradation plus rapide de l'ARN viral sur l'acier inoxydable. En conclusion, les résultats de cette thèse permettent de proposer une application de ces protocoles de concentration et d'extraction dans un contexte de routine, tout en mettant en lumière les enjeux liés à la persistance de l'ARN viral dans l'analyse des résultats de détection de virus dans les aliments. / Human norovirus (HuNoV) and hepatitis A virus (HAV) are often associated with foodborne illnesses involving minimally processed foods. As viral culture methods remain limited for routine use, it is necessary to concentrate virions present on foods before their detection. The goal of this step is to separate the viruses from the food matrix, to concentrate them and to eliminate inhibitors that may affect detection. The International Organization for Standardization (ISO) has published procedures for detecting viruses in food. However, they vary considerably depending on the foods to study, while being long and laborious. They also require trained personnel and involve several steps that may reduce viral recovery, making them difficult to use in routine analysis. This is why the development of rapid and sensitive concentration, purification, and extraction steps for genetic material, limiting manual steps, is necessary. The first objective of this project was to develop a new approach of virus concentration based on ultrafiltration of the eluted viral particles from the surface of food. The optimized method was subsequently compared to the reference method ISO 15 216-1:2017 using fresh and frozen strawberries, raspberries, and blackberries as well as fresh lettuce and green onions. The results showed a reduction in experimental time compared to the reference method, while maintaining detection at low concentrations of HAV and HuNoVs. Except for raspberry, the ultrafiltration method was generally equivalent to the reference method, regardless of the virus tested. The second objective was to compare a new automated extraction method optimized for VHA, HuNoVs GI and GII to a commercial semi-automated method applicable to several high-risk food matrices. For fresh raspberries, oysters, and romaine lettuce, the two extraction platforms were considered equivalent. While the automated method provided better recovery for frozen raspberries and less inhibition for frozen blackberry samples. The third objective was to evaluate the persistence of HAV RNA from heat-inactivated virions. RNA was diluted in water to different concentrations and then added to solutions (water and phosphate buffer saline) or laid on surfaces (stainless steel, polyvinyl chloride, and blueberries). RNA presence was measured at different storage temperatures (-80°C, -20°C, 4°C and 23°C) over a period of 90 days. In solution, on polyvinyl chloride and on blueberries, RNA was detected under most conditions for up to 90 days of storage. The results, however, showed a faster degradation of viral RNA on stainless steel. In conclusion, these concentration and extraction methods could be suitable for routine analysis of viruses throughout the food production and surveillance chain. The findings of this study also highlight the challenges associated with the persistence of viral RNA when interpreting results from virus detection in food.

Cocoa bean fermentation is an essential but spontaneous fermentation process to obtain the necessary raw material for the production of cocoa-derived products, among which chocolate. Successful cocoa bean fermentation processes are typically dominated by three microbial groups, namely yeasts, lactic acid bacteria, and acetic acid bacteria. The use of functional starter cultures may allow to gain a better control over the fermentation process. Previously, a number of candidate functional starter cultures have been proposed for the lactic acid bacteria, namely Lactobacillus fermentum 222 and Lactobacillus plantarum 80, and for the acetic acid bacteria, namely Acetobacter pasteurianus 386B, Acetobacter ghanensis LMG 23848T, and Acetobacter senegalensis 108B. The metabolism of bacteria determines an important part of their physiology, and this is recently being investigated by using computational models. The aim of this PhD thesis was to develop such models for the candidate functional starter cultures for the cocoa bean fermentation process and to perform the related computational analysis. The computational models developed were genome-scale metabolic models, which constitute a comprehensive repertoire of metabolic enzymes with their concomitant reactions, and this at genome-scale. The reconstruction of such models requires a combination of high-quality genome re-annotation, comparative genomics, manual curation, and experimental validation. Genome-scale metabolic modeling together with the use of previously published experimental data under cocoa fermentation conditions allowed to contextualize the experimental data and to gain new insights into the metabolic properties of the candidate functional starter cultures. Simulations with the A. pasteurianus 386B genome-scale metabolic model revealed the metabolic roles of lactate and ethanol, the energetic properties of the strains’ aerobic respiratory chain, and the possible functional role of an NAD(P)+ transhydrogenase. Modeling the metabolite dynamics of A. ghanensis LMG 23848T under cocoa fermentation conditions revealed an alternative strategy for its diauxic growth, compared with A. pasteurianus 386B, which was related to a difference in lactate consumption rate and pyruvate overflow. For A. senegalensis 108B, it was shown that, next to lactic acid, also citric acid could sustain its growth in vitro as the sole carbon source. Furthermore, the absence of the glyoxylate cycle predicted from its genome did not correspond with its species description that reports growth on ethanol as the sole carbon source. For L. fermentum 222 and L. plantarum 80, core genome-scale metabolic models allowed to gain insight into the possible metabolic flux distributions as a function of environmental conditions. The modeling also indicated a current lack in knowledge; for example, concerning the presence and consumption of undefined substrates in the complex medium used.In summary, genome-scale metabolic modelling of candidate functional starter cultures for the cocoa bean fermentation process provided useful in silico tools to gain insight into their metabolic properties at a systemic level. / La fermentation du cacao est un processus essentiel pour obtenir la matière première nécessaire pour la production de produits dérivés du cacao, comme par exemple le chocolat. Une fermentation de cacao favorable est caractérisée par la domination de trois groupes de microorganismes :les levures, les bactéries lactiques, et les bactéries acétiques. L'utilisation de cultures de départ fonctionnelles permet un meilleur contrôle sur le processus de fermentation. En ce qui concerne les bactéries, de nombreuses cultures "starter" ont été proposées, à savoir Lactobacillus fermentum 222 et Lactobacillus plantarum 80 pour les bactéries lactiques et Acetobacter pasteurianus 386B, Acetobacter ghanensis LMG 23848T, et Acetobacter senegalensis 108B pour les bactéries acétiques. Le métabolisme des bactéries constitue une partie importante de leur physiologie et la recherche actuelle se concentre de plus en plus sur la modélisation du métabolisme et la simulation des flux métaboliques par ordinateur. Cette thèse de doctorat a été consacrée au développement et à l'analyse de tels modèles computationnels pour des cultures fonctionnelles "starter" proposés pour la fermentation du cacao.Les modèles qui ont été développés dans cette thèse sont des modèles métaboliques à l’échelle du génome. La reconstruction du réseau métabolique a entraîné la ré-annotation du génome, une étude de génomique comparative, la curation manuelle des annotations et la validation du modèle par des expériences in vitro. La modélisation nous a permis de contextualiser des données expérimentales déjà publiées pour en obtenir de nouvelles informations concernant les propriétés métaboliques des cultures starter. Des simulations utilisant le modèle métabolique de A. pasteurianus 386B ont clarifié les rôles métaboliques de l’acide lactique et de l’éthanol, les propriétés énergétiques de sa chaîne respiratoire, et ont permis d'assigner un rôle possible à une NAD(P)+ transhydrogénase. La modélisation de la dynamique des métabolites provenant d’un milieu de croissance de A. ghanensis LMG 23848T dans des conditions simulant la fermentation du cacao, a mis en évidence une stratégie alternative de croissance biphasique comparé à A. pasteurianus 386B. Ceci est dû à une différence dans le taux de consommation de l’acide lactique et à l’éventuelle production de pyruvate. Pour A. senegalensis 108B, les expériences ont démontré, tant pour l’acide lactique que pour l’acide citrique, que ces sources de carbone permettaient, à elles seules, la croissance de cette bactérie. L’absence du cycle du glyoxylate chez A. senegalensis 108B ne correspondait pas à la description de cette espèce, laquelle pouvant croître sur l’éthanol comme seule source de carbone. Pour L. fermentum 222 et L. plantarum 80, la modélisation de leur métabolisme du carbone a permis d’explorer les distributions de flux métaboliques en fonction des substrats consommés. Les simulations ont aussi révélé le manque de connaissance que nous avons sur ces bactéries lactiques, telle que la consommation de substrats non identifiés venant du milieu de croissance et qui pourrait influencer leur dynamique de croissance.En résumé, la modélisation métabolique à l’échelle du génome des cultures starter proposées pour la fermentation du cacao a permis le développement d’outils in silico qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre le métabolisme global de ces souches. / Het cacaoboonfermentatieproces is een essentieel maar spontaan proces dat nodig is om de noodzakelijke grondstof, met name de gefermenteerde cacaobonen, voor de productie van cacao-afgeleide producten, waaronder chocolade, te bekomen. Succesvolle cacaoboonfermentatieprocessen worden typisch gedomineerd door drie microbiële groepen, met name gisten, melkzuurbacteriën en azijnzuurbacteriën. Om meer controle te verkrijgen over het fermentatieproces is het gebruik van functionele starterculturen aangewezen. In vorige studies werd reeds een reeks kandidaat-functionele starterculturen voorgesteld. Voor de melkzuurbacteriën zijn dit Lactobacillus fermentum 222 en Lactobacillus plantarum 80 en voor de azijnzuurbacteriën zijn dit Acetobacter pasteurianus 386B, Acetobacter ghanensis LMG 23848T en Acetobacter senegalensis 108B. Het metabolisme van bacteriën bepaalt in grote mate hun fysiologie, en dit wordt recent onderzocht door middel van computationele modellen. Het ontwikkelen en analyseren van zulke modellen voor de voorgestelde kandidaat-functionele starterculturen vormde het onderwerp van deze doctoraatsthesis.De computationele modellen waarvan sprake waren genoomwijde metabole modellen (GEMs), dewelke het repertoire aan metabole enzymen en de biochemische reacties die zij katalyseren in de bacteriële cellen omvat. De reconstructie van het metabole netwerk op genoomschaal vraagt om een gecombineerde aanpak van hoge-kwaliteit genoomherannotatie, comparatieve genomica en experimentele validatie. De GEMs werden gebruikt om reeds gepubliceerde experimentele data onder cacaofermentatiecondities te contextualiseren en nieuwe inzichten te verkrijgen in de metabole karakteristieken van de kandidaat-functionele starterculturen. Door middel van simulaties met het A. pasteurianus 386B GEM kon de metabole rol van melkzuur en ethanol, en de energetische karakteristieken van de aerobe respiratieketen van deze stam aangetoond worden, alsook de mogelijke metabole functie van een NAD(P)+ transhydrogenase. Het modelleren van de microbiële dynamica van A. ghanensis LMG 23848T onder cacaofermentatiecondities wees op een alternatieve strategie voor de tweevoudige groei van deze stam ten opzichte van de tweevoudige groei van A. pasteurianus 386B onder dezelfde condities, en dit omwille van een verschil in melkzuurconsumptiesnelheid en pyruvaatsecretie. Voor A. senegalensis 108B werd aangetoond dat deze stam, naast melkzuur, ook op citroenzuur als enige koolstofbron kon groeien. De afwezigheid van de glyoxylaatcyclus, voorspeld op basis van het genoom, bij A. senegalensis 108B is in tegenstelling tot de soortbeschrijving, dewelke stipuleert dat deze azijnzuurbacteriesoort in staat is tot groei op ethanol als enige koolstofbron. Voor L. fermentum 222 en L. plantarum 80 leidde de ontwikkeling van GEMs tot nieuwe inzichten in de mogelijke metabole fluxverdelingen, voornamelijk ten aanzien van substraatverbruik. Het modelleren van de microbiële dynamica wees ook op een tekortkoming aan huidige kennis over deze stammen, bijvoorbeeld met betrekking tot het gebruik van ongedefinieerde substraten in een rijk groeimedium.Samenvattend werden door middel van de ontwikkelde GEMs van de kandidaat-functionele starterculturen voor cacaoboonfermentatieprocessen nieuwe inzichten verkregen in hun metabolisme en dit op systeemniveau. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished