Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). L’émergence de nouvelles souches épidémiques hypervirulentes, multi-résistantes aux antibiotiques et possédant une grande capacité de transmission, telles que LESB58, entraîne de grandes difficultés de traitement et une augmentation de la mortalité chez ces patients. Le séquençage complet de LESB58 a révélé un génome à 90% hautement conservé additionné de 455 gènes regroupés sous six prophages (PPs) et cinq îlots génomiques (GIs). Cette étude a pour objectif de déterminer l’implication de ces régions supplémentaires dans la pathogénie de LESB58. Une mutagenèse à étiquette signature (STM) suivie de plusieurs criblages ont permis de sélectionner 162 mutants dont 11 portant une insertion dans un GI ou PP. Des analyses subséquentes ont été réalisées sur ces mutants afin d’évaluer leur niveau de virulence in vivo dans un modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat. Des analyses de génomique ont été effectuées sur deux de ces mutants afin de mieux comprendre leur incapacité à établir l’infection dans le modèle d’infection in vivo. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen and causes chronic pulmonary infection to cystic fibrosis (CF) patients. The hypervirulent epidemic strain LESB58 is associated with high transmissibility and is highly resistant to antibiotics causing increased morbidity and mortality. Whole genome sequencing of LESB58 revealed a 90% highly conserved core genome and 455 additional genes grouped in five genomics islands (GIs) and six prophages (PPs). The aim of this study was to determine the implication of the accessory genome in LESB58 virulence. We performed a signature tagged mutagenesis (STM) followed by an in vivo screening of the mutants. From 162 STM mutants defective for in vivo maintenance, we selected 11 harbouring an insertion in GI or PP for further virulence analysis. Two of these mutants were used for genomics analysis in order to better understand their incapacity for in vivo maintenance in the rat model of chronic lung infection.

La parodontite chronique est une maladie infectieuse des tissus de soutien de la dent, entraînant une perte d'attache et une résorption osseuse. Elle résulte d'un déséquilibre entre le biofilm sous-gingival et la réponse inflammatoire de l'hôte. Le modèle de sang complet permet de recréer des conditions apparentées à celles présentes dans la poche parodontale. Utilisant ce modèle stimulé par le lipopolysaccharide (LPS) de Porphyromonas gingivalis, il nous a été permis de démontrer que la tétracycline, la doxycycline et la tétracycline modifiée chimiquement (CMT-3) peuvent inhiber la production d'importants médiateurs proinflammatoires. En comparant les réponses de patients atteints de parodontite et de sujets sains dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS, nous avons pu établir que le taux d'accroissement de la production de cytokines et de métalloprotéinases matricielles était plus important chez le premier groupe, laissant supposer une réaction immune plus importante de leur part.

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De 1956 à 1986, l'utilisation des glycopeptides en thérapeutique infectieuse a été marquée par de francs succès dans le traitement des infections graves dues à des bactéries à Gram positif. La vancomycine et la téicoplanine sont des antibiotiques de grande importance thérapeutique utilisés à travers le monde pour traiter les infections graves dues aux staphylocoques, aux entérocoques, aux streptocoques et à Clostridium difficile à cause de la résistance de ces bactéries à d'autres antibiotiques. Malheureusement, depuis 1986, on a assisté à l'émergence et la dissémination de la résistance aux glycopeptides chez un grand nombre d'espèces pathogènes telles que les entérocoques et plus récemment Staphylococcus aureus résistant à la méticilline. Dans ce contexte de dissémination de la résistance aux glycopeptides, mon projet de doctorat fournit d'importantes données grâce à la mise en évidence d'un réservoir des gènes vanB, vanD et vanG dans la flore intestinale humaine. Nous avons caractérisé pour la première fois plusieurs allèles du gène vanG dans la flore humaine. Puis, nous avons isolé et caractérisé deux nouvelles espèces bactériennes anaérobies résistantes aux glycopeptides. Les analyses phylogénétiques ont montré que ces nouvelles espèces appartiennent au groupe phylogénétique XlVa des Clostridium. La première espèce a été nommée Clostridium lavalense sp. nov. CCRI-9842T . Cette souche est résistante à la vancomycine du fait de la présence du locus vanB2 porté par le transposon Tn5382. La deuxième espèce isolée a été nommée Ruminococcus gauvreaui sp. nov. CCRI-161101 . Cette souche est résistante à la vancomycine et à la téicoplanine et contient le locus vanD qui confère la résistance aux glycopeptides ainsi qu'un locus apparenté au locus vanG décrit chez les ERG. Il s'agit de la première description du locus vanD de résistance aux glycopeptides dans une espèce autre que les entérocoques habituellement connus comme réservoir de ce locus de résistance. De plus, un nouvel allèle du gène vanG a été caractérisé dans la souche R. gauvreaui CCRI-16110'. Ainsi les résultats de nos travaux ont permis de montrer que le tube digestif humain représente un important réservoir des gènes de résistance aux glycopeptides qui sont parfois présents dans des espèces bactériennes encore inconnues du tube digestif. Ces nouvelles données vont permettre de mieux adapter les outils de contrôle des infections dues à des bactéries résistantes aux glycopeptides. / From 1956 to 1986, glycopeptide use in infectious disease therapy was marked by astounding success for the treatment of serious Gram-positive bacterial infections. Vancomycin and teicoplanin are considered as the last resort glycopeptide antibiotics presently in use for the treatment of serious Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp. and Clostridium difficile drug-resistant infections. Unfortunately, the last twenty years have seen the emergence and dissemination of glycopeptide-resistant pathogenic strains such as methicillin-resistant Enterococcus spp. and, more recently, methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In this context of glycopeptide resistance dissemination, my thesis serves as an important contribution through the identification of vanB, vanD and vanG reservoir genes in the human intestinal flora. We have, for the first time, characterized several alleles of the vanG gene in the human flora and have isolated and characterized two new anaerobic glycopeptide-resistant bacterial strains. Phylogenetic analyses have shown that these new strains belong to the Clostridium XlVa phylogenetic group. The first strain was named Clostridium lavalense sp. nov. CCRI-98421 . This strain is resistant to vancomycin, due to the presence of the vanB2 locus carried by Tn5382/1549 transposon. The second strain was named Ruminococcus gauvreaui sp. nov. CCRI-16110r and is resistant to vancomycin and teicoplanin. Ruminococcus gauvreaui CCRI-161101 contains the vanD locus, which confers glycopeptide resistance in enterococci, along with a vanG-like locus described for vancomycin-resistant Enterococcus. This is the first description of a glycopeptide resistance vanD locus in a non-Enterococcus strain, the usual vanD locus reservoir. In addition, a new allele of the vanG gene was characterized in the R. gauvreaui CCRI-16110T strain. Therefore, our results demonstrate that the human digestive tract represents an important reservoir of glycopeptide resistance genes, present in yet-to-be-described intestinal bacterial strains. These data will allow the fine tuning of infection control tools against glycopeptide-resistant bacteria.

L'expression de l'intégrine a5pl et celle de son ligand, la fibronectine (FN), est augmentée au tout début de la cicatrisation cornéenne afin de favoriser la migration des cellules épithéliales. Toutefois, l'expression du collagène de type IV (CIV) et de la laminine (LM), deux composantes majeures de la membrane basale, est diminuée temporairement durant ce processus. Notre laboratoire étudie le promoteur a5 afin de déterminer quels sont les mécanismes responsables de l'augmentation de l'expression de l'intégrine a5(31 dans le contexte de la cicatrisation cornéenne. Jusqu'à maintenant, nous avions démontré que la sous-unité a5 était à la fois modulée par la FN et la densité cellulaire. Ces effets étaient, en partie, causés par des modifications du facteur de transcription Spl (±spécifie protein one¿), un régulateur positif de la transcription du gène a5. Sur le promoteur a5, nous avons identifié un site de liaison potentiel pour le facteur de transcription NFI (±nuclear factor one¿) à proximité de celui des sites Spl et AP-1 (±activator protein one¿) préalablement identifiés. Le premier objectif de cette thèse fut de déterminer l'influence de chacun de ces facteurs sur l'activité du promoteur a5. Le second objectif fut de définir l'influence de la densité cellulaire sur les facteurs de transcription AP-1, Spl et NFI. Finalement, le troisième objectif visait à déterminer l'influence du CIV et de la LM sur l'expression d'a5. Nous avons démontré que les facteurs de transcription AP-1, Spl et NFI modulent l'activité basale du promoteur a5. Nous avons aussi démontré que la densité cellulaire induit des modifications des propriétés des facteurs de transcription AP-1 et NFI. Par la suite, nous avons démontré que la FN, le CIV et la LM influencent individuellement l'expression de la sous-unité a5. Nous avons ensuite démontré que ces influences sont, en partie, causées par des modifications des facteurs de transcription Spl, AP-1 ainsi que NFI. Ainsi, l'expression de la sous-unité a5 s'avère modulée par la densité cellulaire et par des protéines de la matrice extracellulaire (MEC) impliquées dans la cicatrisation cornéenne. Ces influences résultent de modifications dans les propriétés ou les niveaux endogènes des facteurs de transcription AP-1, Spl et NFI.

Une analyse microbiologique détaillée a été réalisée sur 111 échantillons provenant de lait cru de vache de fromageries artisanales du Québec. Parmi les analyses effectuées, on note le compte des bactéries mésophiles, des bactéries psychrophiles, des coliformes, de Staphylococcus aureus et une analyse détaillée des levures et moisissures (L&M). Les échantillons provenaient de 13 fromageries et ont été récoltés pendant sept mois, entre février et octobre 2009. Un effet de terroir, de race, de production biologique et de lieu géographique a aussi été mesuré. Au total, 505 isolats de L&M ont été prélevés du lait cru ainsi que 103 isolats de L&M ont été prélevés de fromages en cours d'affinage. Après analyse, 82 espèces de L&M ont été identifiées. Pour quatre fromageries, une analyse plus détaillée a été réalisée au niveau des L&M. Chacune des quatre fromageries a montré un profil de L&M unique, tant au niveau quantitatif qu'au niveau des espèces dominantes. Une analyse génétique a été réalisée sur 13 isolats appartenant à l'espèce Issatchenkia orientalis et provenant d'échantillons de laits crus ou de fromages. Les isolats ont été différenciés à l'aide du «Multilocus sequence typing» (MLST). Une persistance des souches dans le temps a pu être observée pour une même fromagerie, tandis qu'il y avait une diversité observable parmi les six fromageries analysées. Finalement, différentes capacités technologiques ont été mesurées sur six isolats appartenant à l'espèce Galactomyces geotrichum et comparées à une souche industrielle de la même espèce. La vitesse de croissance, la tolérance au sel, la protéolyse, la lipolyse et l'utilisation du lactate ont été mesurés afin de déterminer si les souches isolées du lait de terroir ont un potentiel d'application industrielle.

La Maladie Hollandaise de l'Orme (MHO) est causée par des champignons du genre Ophiostoma. Ceux-ci sont responsables de la mort de plusieurs centaines de milliers d'ormes adultes en Europe ainsi qu'en Amérique du Nord, modifiant de manière drastiques les paysages forestiers et urbains. L'étude de la MHO a permis de caractériser deux espèces différentes, O. ulmi et O. novo-ulmi, qui présentent des phénotypes différents en terne de virulence et de croissance. L'analyse de données de séquençage à haut débit (génomique) associée à l'utilisation de données phénotypiques s'est répandue ces dernières décennies dans le domaine de la phytopathologie et permet de comprendre plus en détails la structure des populations ainsi que les gènes et mécanismes impliqués dans l'adaptation chez les champignons pathogènes. Dans le premier chapitre, nous comparons les caractéristiques évolutives des champignons phytopathogènes des cultures et des forêts. Nous contrastons l'impact des différents degrés de domestication et de gestion des milieux agricoles et forestiers sur ces populations de pathogènes. Les milieux agricoles et les forêts présentent des caractéristiques très différentes, comme le temps de génération ou le niveau de domestication. Cependant, nous trouvons que les mécanismes modelant les populations de pathogènes restent similaires, comme l'hybridation, les sauts d'hôtes, la sélection, la spécialisation et l'expansion clonale. Dans un second temps nous faisons un bilan des méthodes et techniques disponibles pour la gestion et l'amélioration des plantes de ces systèmes afin de prévenir ou lutter contre de futures épidémies. Dans le second chapitre, nous avons utilisé des données de génomiques pour examiner la structure génétique des populations des champignons responsables de la Maladie Hollandaise de l'Orme (MHO) Ophiostoma ulmi et Ophiostoma novo-ulmi. Nous quantifions et caractérisons la diversité génétique au sein des quatre lignées génétiques, ainsi que la divergence et la phylogénie entre chaque taxon. Nous décrivons le rôle de l'hybridation et de l'introgression dans l'histoire évolutive de ces pathogènes comme étant le mécanisme principal générant de la diversité génétique. La production de données phénotypiques nous permet également de caractériser l'impact de l'introgression sur l'adaptation de ces espèces. Dans le troisième chapitre, nous avons utilisé une approche « GWAS » (Genome Wide Analysis Study) pour révéler les marqueurs impliqués dans l'adaptation à la température et à un composé de défense de l'hôte chez O. ulmi et O. novo-ulmi. Nous trouvons d'importants gènes et familles de gènes associés avec les phénotypes de croissance et de virulence comme des transporteurs, des cytochromes, des protéines de choc thermique ou des protéines impliquées dans le système d'incompatibilité végétative qui pourraient jouer un rôle dans la protection contre les virus. / Dutch Elm Disease (DED) is a highly destructive tree disease caused by fungi from the Ophiostoma genus. These fungi are responsible for the deaths of hundreds of thousands of mature elm trees both in Europe and in North America. Studies on DED allowed the characterization of two disctinct species, O. ulmi and O. novo-ulmi, that exhibit different virulence and growth phenotypes. Global pathogen genomics data including population genomics and high-quality reference assemblies are crucial for understanding the evolution and adaptation of pathogens. In a first chapter, we review crops and forest pathosystems with remarkably different characteristics, such as generation time and the level of domestication. They also have different management systems for disease control which is more intensive in crops than forest trees. By comparing and contrasting results from pathogen population genomic studies done on widely different agricultural and forest production systems, we can improve our understanding of pathogen evolution and adaptation to different selective pressures. We find that despite these differences, similar processes such as hybridization, host jumps, selection, specialization, and clonal expansion are shaping the pathogen populations in both crops and forest trees. We propose some solutions to reduce these impacts and to lower the probability of global pathogen outbreaks so that we can envision better management strategies to sustain global food production as well as ecosystem services. In a second chapter, we investigate how hybridization and the resulting introgression can drive the success of DED fungi via the rapid acquisition of adaptive traits. Using whole-genome sequences and growth phenotyping of a worldwide collection of isolates, we show that introgression has been the main driver of genomic diversity and that it impacted fitness-related traits. Introgressions contain genes involved in host-pathogen interactions and reproduction. Introgressed isolates have enhanced growth rate at high temperature and produce different necrosis sizes on an in vivo model for pathogenicity. In addition, lineages diverge in many pathogenicity-associated genes and exhibit differential mycelial growth in the presence of a proxy of a host defence compound, implying an important role of host trees in the molecular and functional differentiation of these pathogens. In the third chapter, we performed the identification of O. ulmi and O. novo-ulmi genes potentially associated with virulence and growth using Genome-Wide Association (GWA) analysis. We measured necrosis size induced on apples as a proxy for fungal virulence and measured growth rates at three different temperatures and two different media. We found several candidate genes for virulence, such as a CFEM domain containing protein and a HC-toxin efflux carrier. For growth, we identify several important gene families such as ABC and MFS transporters, cytochromes, transcription factors and proteins from the vegetative incompatibility complex.

L'eau est un vecteur important pour la transmission de maladies infectieuses. Les méthodes classiques utilisées pour évaluer la qualité microbiologique de l'eau sont cependant inaptes à garantir l'absence de tous les microorganismes pathogènes. Le développement de nouvelles méthodes moléculaires permettant la détection rapide, sensible, spécifique et abordable de ces microorganismes pourrait diminuer le nombre de cas d'infections reliées à la consommation d'eau potable. Ce mémoire décrit la démarche empruntée pour adapter, utiliser et comparer des méthodes microbiologiques classiques à bord du laboratoire mobile Atlantis (LMA) lors d'une campagne de surveillance de la qualité l'eau en région éloignée. Nous élaborons ensuite sur le processus permettant le transfert technologique de deux méthodes moléculaires ciblant deux indicateurs de contamination fécale, Escherichia coli et les entérocoques. Les résultats de ces recherches permettent de conclure que le LMA pourra jouer un rôle prometteur pour la surveillance des maladies infectieuses d'origine hydrique.

Depuis quelques années, il y a émergence de souches de Salmonella enterica sérovar Typhimurium multirésistantes causant une septicémie et la mort chez le porc. Ceci constitue un problème majeur pour l’industrie porcine et possiblement pour la santé publique. L’objectif de ce projet était de comparer et de caractériser une souche capable de causer une septicémie chez le porc et une souche commensale, en observant l’interaction avec des cellules épithéliales, des macrophages humains et d’identifier des gènes exprimés par les souches septicémiques et les souches commensales. Tout d’abord, l’infection de cellules épithéliales permet d’observer l’adhérence et l’invasion des bactéries, pour ainsi mettre en évidence la capacité des souches à coloniser le tractus gastro-intestinal. La souche commensale possède un pouvoir d’adhésion supérieur à la souche septicémique. Par la suite, l’infection de macrophages permet de caractériser le niveau de phagocytose et de survie. L’importance de la survie dans les macrophages pourrait permettre de faire un lien avec la septicémie. Toutefois, aucune différence n’est observable dans les conditions qui ont été testé. Ensuite, la technique SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) est utilisée pour capturer des gènes uniques à la souche septicémique et un autre SCOTS est fait pour capturer les gènes spécifiques à la souche commensale. Finalement, les gènes sont clonés, leur spécificité face aux souches est analysé par dot blot et ils sont identifiés par séquençage suivient d’une analyses bioinformatiques. Les gènes identifiés par SCOTS, lors des captures pour la souche septicémique et la souche commensale, se trouvent à être des gènes communs aux Salmonella. Toutefois, la différence de pathologie causée par les deux souches, n’est peut-être pas l’acquisition de nouveaux gènes, mais plutôt une différence d’expression entre les deux souches. / For many years, there has been an emergence of new multi-drug resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium strains responsible for high mortality rates in regards to swine infections. This represents a major problem for the swine industry and also for public health. The objective of this project was to characterize an isolate capable of creating swine septicemic illness and another which is naturally present in this host’s intestinal tract. The study conducted here includes observations of bacteria-epithelial cell interactions, bacteria-macrophage interactions and identification of genes expressed during different epithelial cell infections. Bacterial adherence and invasion of cells were observed after epithelial cell infection. This type of assay underlines the ability of the isolates to colonize the intestinal tract. The commensal strain has a better adherence then the other. Macrophage infections allowed characterization of bacterial phagocytosis and intracellular survival. Survival within macrophages reflects the capacity of the bacterial isolates to infect and survive in the host. There’s no difference between the two strains with the condition we test. A technique termed SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) was used to capture unique transcripts from the isolate which caused illness during swine infection. SCOTS was also used to find unique genes expressed by the commensal isolate. The captured fragments were cloned, their strain specificity was analyzed by dot blot and the genes transcribed were identified by direct sequencing followed by bioinformatic analysis. SCOTS carried out with the septicemic and the commensal isolates was done. During the SCOTS conducted with the strain isolated from a sick swine or with the isolate from healthy swine, common Salmonella genes were found. Thus, even though these two isolates cause different pathologies, virulence of the strains does not rely on the acquisition of new genes, but perhaps on differential gene expression among both.

Les nitrates, largement dérivés des activités anthropiques posent un réel problème pour la santé et l'environnement lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu naturel, en particulier lorsque la ressource est destinée à la production d'eau potable. Déterminer l'origine de ces nitrates est alors une première étape indispensable pour assurer ensuite une meilleure gestion de ces ressources en eau. C'est dans ce but, qu'une approche multi-traceurs originale a été développée sur la source karstique du Marseillon, située dans le Sud-Ouest de la France et exploitée pour l'eau potable. Une stratégie d'échantillonnage a été menée entre octobre 2010 et janvier 2013 à différentes échelles spatiales (du régional à l'étude du forage) et temporelles (du suivi mensuel au suivi horaire). Les outils hydrodynamiques et géochimiques ont mis en évidence une contribution importante d'une eau pauvre en nitrate à l'alimentation de la source. Les outils isotopiques (?15N-NO3, ?18O-NO3 et ?11B) et microbiologiques ont permis d'identifier une connexion hydraulique entre les eaux de surface et la source du Marseillon, favorisée pendant les épisodes de crues de surface. Les outils de datation ont permis d'estimer une contribution d'environ 80% d'une eau de 1980 et de 20 % d'une eau rechargée au cours de l'année de la mesure (2011) caractérisée par des nitrates d'origine organique et des contaminations fécales humaines et animales. Les résultats obtenus ainsi que la démarche développée dans cette thèse ont permis de dresser les grandes lignes d'un guide méthodologique, accessible aux plus grand nombre d'acteurs de l'eau, pour la détermination de l'origine des nitrates dans les eaux souterraines. / Nitrate is widely derived from anthropogenic activities. When it reaches groundwater bodies, it becomes an environmental issue especially when the resource is used for drinking water supply. The determination of nitrate sources is thus the first step in water restoration and preservation management. An innovative multi-indicators approach has been used in Marseillon karstic spring (Southwest of France) which is considered as a strategic resource for drinking water supply. A spatial and temporal multi-scale sampling plan has been carried out in surface waters and groundwater. Hydrodynamic and geochemical tools helped to highlight an important contribution of deep water origin (i.e.: low nitrate concentration) in spring alimentation. Isotopic (?15N-NO3, ?18O-NO3 and ?11B) and microbiological tools have allowed identifying a hydraulic connection between surface water and the spring. This connection seems to be more important during the river?s flood events. Water dating shows a heterogeneous recharge of Marseillon spring with old water (<1940) mixed with current water characterized by nitrate derived from organic sources and fecal contamination originated from both human and animal wastes. This original multi-tracers approach developed in this thesis improves the knowledge on the nitrate origin determination and can be seen as a methodological guide for drinking water management.