Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-12T17:12:09Z No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-15T12:23:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T12:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This work describes several instrumental improvements to electrophoretic microchips (MSE) and microfluidic paper-based analytical devices (μPADs). The improvements are showed in terms of fabrication process, modification steps, control of sample volume and detection system. First off, a CO2 laser engraver was proposed to produce microchannels on a polymethyl methacrylate (PMMA) surface. All parameters were previously optimized in order to obtain a channel with the smallest dimension. Channels with 80 μm of deep and width were fabricated. MSE was coupled with amperometric detection and this work showed for the use of a decoupler produced by a mixture between PDMS and sugar the first time. The proof-of-concept testing of the final device demonstrated the analysis of a model mixture of phenolic compounds within 200 s with baseline resolution. Injection and control of the solution inside the microchannel was the another parameter improved during the development of this project. Hydrodynamic injector was developed using an electronic micropipette. The dispenser function of the micropipette can be explored to inject fractioned sample volumes inside the microchannel. The volume equaling 0.6 μL was considered ideal to completely fill the injection channel. In order to have better control of the sample volume, microdevices with different configuration were proposed. A microdevice with two auxiliary channels (split configuration) was select to realize the experimental part. When compared to electrokinetic injection, hydrodynamic showed better analytical performance including correcting the bias effect, which is the main problem related to electrokinetic injection. μPAD surface was modified by two different methodologies, using silica nanoparticles and chitosan. The modification process was used to solve the drawback related to the non-homogeneity or uniformity of color development in the detection zone. Silica nanoparticles and chitosan were incorporated on the cellulose surface to function as a new support to immobilize the selected enzyme. The modification process with both the nano and bio compounds improved the analytical performance, increased the reliability of the low cost platform and decreased the limit of detection (LD) of colorimetric system. The resulting LD for the glucose and uric acid assays were 23 and 37 μM, respectively. The enhanced analytical performance of modified the μPADs ensured for the first time the colorimetric detection of glucose in tear samples from four non-diabetic patients. The found concentration levels ranged from 130 to 380 μM. / O trabalho descrito nesta tese mostra uma variedade de melhorias instrumentais desenvolvida tanto para os microssistemas eletroforéticos (MSE) como para os dispositivos analíticos a base de papel (μPADs). As melhorias são discutidas em termos de processo de fabricação dos microdispositivos, modificação de superfície e manipulação da solução no interior dos microcanais. Inicialmente o uso de uma gravadora a laser foi proposta para a fabricação dos microcanais em substrato de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Todos os parâmetros do laser foram otimizados afim de fabricar canais nas menores dimensões possíveis. Canais com aproximadamente 80 μm de largura e profundidade foram obtidas. Os MSE fabricados com laser foram acoplados ao sistema de detecção amperométrica em que foi proposto pela primeira vez o uso de um desacoplador alternativo fabricado a partir da mistura entre o poli(dimetisiloxano) (PDMS) e açúcar. A prova de conceito do dispositivo fabricado com a gravadora a laser associada a detecção amperométrica foi demostrada na separação de uma mistura de compostos fenólicos em menos de 200 s e com ótima resolução de linha de base. A etapa de injeção e manipulação de solução no interior dos microcanais foi outra melhoria instrumental proposta no desenvolvimento deste trabalho. Desenvolveu-se um injetor hidrodinâmico alternativo a partir do uso de uma micropipeta eletrônica comercial. A micropipeta possui uma função dispenser que pode ser explorado para injetar volumes fracionados no interior dos microcanais. O volume de 0,6 μL foi denominado como o ideal para realizar a etapa de injeção. No intuito de se ter um melhor controle do volume de amostra, um arranjo de microcanais foi proposto. Os dispositivos fabricados na configuração contendo dois canais auxiliares foram determinados como os ideais. Quando comparada a injeção eletrocinética, o injetor hidrodinâmico apresentou um ótimo desempenho analítico corrigindo principalmente o efeito bias, um dos principais problemas relacionados ao processo de injeção eletrocinética. Em relação aos μPADs, foram propostas duas diferentes estratégias de modificação de superfície afim de corrigir problemas correlacionados à falta de homogeneidade e uniformidade de cor gerada na zona de detecção. Nanopartículas de sílica e quitosana foram diretamente incorporadas na superfície da celulose servido como um novo suporte para imobilização enzimática. A modificação com o nano e biocomposto melhorou significativamente o desempenho analítico dos μPADs corrigindo o efeito de lavagem, aumentando a confiabilidade analítica e reduzindo os limites de detecção do sistema colorimétrico. Os limites de detecção (LD) encontrado para os ensaios de glicose e ácido úrico foram de 23 e 37 μM, respectivamente. Devido as melhoras analíticas encontrada foi possível pela primeira vez demonstrar o uso dos dispositivos a base de papel para na detecção de glicose em amostra de lágrimas. Foram medidos os níveis de glicose na lágrima de quatro pacientes não diabéticos. Os níveis de glicose encontrado variou entre 130 a 380 μM.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-12-21T11:28:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kezia Gomes de Oliveira - 2016.pdf: 1770872 bytes, checksum: de67c9847e819d3256098ae1514be2d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-27T13:02:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kezia Gomes de Oliveira - 2016.pdf: 1770872 bytes, checksum: de67c9847e819d3256098ae1514be2d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-27T13:02:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kezia Gomes de Oliveira - 2016.pdf: 1770872 bytes, checksum: de67c9847e819d3256098ae1514be2d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-07 / Outro / The several advantages of miniaturization of DNA amplification and coupling with sample preparation and detection steps on the same chip are well known. Currently, most miniaturized systems for nucleic acids analysis are based on polymerase chain reaction (PCR). PCR amplification requires precise temperature control, switching between heating and cooling solution in three specific temperatures. Therefore, the adaptation of PCR for microchip is relatively complex and presents some limitations particularly for use in remote locations. Without the need for heating cycles, isothermal microsystems for DNA amplification can be designed to be simple and low energy consumption and hence can overlap the portable PCR detection systems. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel technique which has emerged as a simple and fast tool for DNA amplification which can be used for the detection and identification of several pathogens. The LAMP using Bst DNA polymerase enzyme which is an enzyme having strand displacement activity and uses a set of four primers designed from six individual segments of the sequence to be amplified. In this study, we developed a simple and rapid LAMP reaction for the E. coli malB gene amplification in the reaction was thermally controlled with a thermoblock for 60 minutes at 66 ° C. The PeT microdevices demonstrated compatibility with all reagents used in the LAMP and the success of the isothermal amplification was observed by agarose gel electrophoresis, yielding detectable amount amplicons as few as starting with 1 copy of DNA. Moreover, the success of the nucleic acid amplification reaction was evaluated by visual detection of the amplicons in the microchip by the use of fluorescent DNA intercalators, which yielded fluorescence in positive reactions. The LAMP in PeT microdevice is a simple and inexpensive method, that allowed a rapid detection (62 minutes) of E. coli. Because of simple operation and without the need for sophisticated instrumentation, LAMP held in microchip PeT has proven to be a valuable tool for molecular diagnostics, with great potential for applications in point-of-care. / As diversas vantagens da miniaturização das reações de amplificação de DNA e o acoplamento com as etapas de preparo da amostra e de detecção no mesmo chip já são bem conhecidas. Até o presente momento, a maioria dos sistemas miniaturizados para a análise de ácidos nucleicos são baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR necessita de controle preciso de temperatura, alternando entre aquecimento e resfriamento da solução em três temperaturas específicas. Desta forma, a adaptação da PCR em microchips é relativamente complexa apresentando algumas limitações relacionadas principalmente a utilização em lugares remotos. Sem a necessidade de ciclos de aquecimento, os microssistemas isotérmicos podem ser projetados para serem simples e de baixo consumo de energia e, portanto, pode sobrepor a PCR em sistemas de detecção portáteis. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é uma técnica recente e inovadora que surgiu como uma ferramenta simples e rápida de amplificação de DNA que pode ser utilizada para detecção e identificação de diversos patógenos. A LAMP utiliza a enzima Bst DNA polimerase que é uma enzima com atividade de deslocamento de fita e utiliza um conjunto de quatro iniciadores desenhados a partir de seis segmentos específicos da sequência a ser amplificada. Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia simples e rápida para detecção de E.coli através da amplificação isotérmica do gene malB em dispositivos descartáveis de poliéster-toner (PeT) contendo um microcâmara com capacidade para 5 μL, e a reação foi incubada a 66 ºC em um termobloco por 60 minutos. Os microchips de PeT demonstraram compatibilidade com todos os reagentes utilizados na LAMP e o sucesso da amplificação isotérmica foi observado por eletroforese em gel de agarose, obtendo quantidade de amplicons detectáveis no gel em reações que partiram de 1 cópia de DNA. Além disso, o sucesso da reação de amplificação do ácido nucleico também foi avaliado através da detecção visual dos produtos amplificados no microchip através do uso de intercaladores fluorescentes de DNA, que produziram fluorescência nas reações positivas. A LAMP realizada em microdispositivos de PeT representa um método simples e de baixo custo, que permitiu a detecção rápida (62 minutos) da E.coli. Devido a simples operação, e sem a necessidade de instrumentação sofisticada, a LAMP realizada no microchip de PeT demonstrou ser uma ferramenta valiosa para diagnósticos moleculares, apresentando grande potencial para aplicações no point-of-care.