Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4136.pdf: 5493903 bytes, checksum: 43bf6490c910378ad1f093d9b1f60982 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Purine Nucleoside Phosphorylases (PNPs) are key enzymes of the purine salvage pathway, and therefore are considered attractive targets for new drugs search. In this context, the development of effective and selective bioassays for PNP ligands screening is an important task. This work describes the covalent immobilization of human and Schistossoma mansoni PNP on fused silica capillaries. The activity of the immobilized enzyme reactors (IMERs) was monitored on line, employing multidimensional zonal chromatography, by the quantification of the product formed throughout the enzymatic reaction. This method enabled the determination of kinetic constants, screening, identification and characterization of enzymatic inhibitors. Two potent human PNP inhibitors were recognized and characterized. Through the use of inhibitors with different potencies, previously characterized by zonal chromatography, the affinity-based ligands screening employing frontal chromatography was validated. Frontal affinity chromatography analysis demonstrated to be a valuable method for the rapid identification of new ligands, while the main advantage of the multidimensional zonal chromatography method herein described consists on the ability to directly evaluate the effect of the ligands in the biological function of these enzymes. The methods described in this work represent an improvement to the PNPs inhibitors consolidated screening assays, since they directly quantify the enzymatic reaction product or are able to rank the inhibitors according to their affinities, resulting in a rapid automated analysis and false positives free. / Purina Nucleosídeo Fosforilases (PNPs) são enzimas chave na via de salvação de purinas, e por isso são consideradas alvos atrativos para a busca por novos fármacos. Nesse contexto, o desenvolvimento de bioensaios seletivos e eficazes para a triagem de novos ligantes das PNPs é de importância crucial. Este trabalho descreve a imobilização covalente das PNPs humana e de Schistosoma mansoni em capilares de sílica fundida. A atividade das enzimas imobilizadas (IMERs) foi monitorada on line, por cromatografia zonal multidimensional, através da quantificação do produto formado na reação enzimática. Este método possibilitou a determinação das constantes cinéticas, a triagem, identificação e caracterização de inibidores enzimáticos. Dois inibidores potentes da PNP humana foram reconhecidos e caracterizados. Através do uso destes inibidores de diferentes potências, previamente caracterizados por cromatografia zonal, a triagem de ligantes por afinidade empregando a cromatografia frontal foi validada para o IMER baseado na PNP humana. As análises por cromatografia de afinidade frontal demonstraram ser uma estratégia valiosa na identificação rápida de novos ligantes, enquanto o método multidimensional desenvolvido apresenta como principal vantagem a capacidade de avaliar diretamente o efeito dos ligantes na função biológica destas enzimas. Os métodos descritos neste trabalho representam um avanço aos métodos consolidados de triagem de inibidores das PNPs, pois quantifica diretamente o produto formado da reação enzimática ou os classifica por afinidade, resultando em análises rápidas, automatizadas e sem falsos positivos.

NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase / NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis

The activities of the enzymes NTPDase (E.C. 3.6.1.5, apyrase, CD39) and 5 -nucleotidase (E.C. 3.1.3.5, CD73) were analyzed in synaptosomes from the cerebral cortex and platelets of rats submitted to demyelination by ethidium bromide (EB) associated with interferon-β (IFN-β) treatment. The following groups were studied: I - control (saline), II - (saline and IFN-β), III - (EB) and IV - (EB and IFN-β). After 7, 15 and 30 days of the surgical procedure, the animals (n=5) were sacrificed and samples was collected for enzymatic assays. The results showed that NTPDase and 5 -nucleotidase activities was increased in synaptosomes of the group III after 7 and 15 days in relation in the control group. The treatment with IFN-β increased the ATP hydrolysis in the groups II e IV after seven days and in the group IV in fifteen days, whereas no alteration was observed in ADP hydrolysis in relation the group I. The 5 -nucleotidase activity in synaptosomes also increased in the group II e IV in fifteen days, when compared with the control group. In relation the ectonucleotidases in platelets, the results demonstrated that the NTPDase activity was reduced in the group III after seven and fifteen days and the IFN-β treatment increased nucleotides hydrolysis in the group IV with relation the group III. In the group II was observed a reduction in the ATP and ADP hydrolysis after 7 days and an increase after 15 days with relation the group I. The 5 -nucleotidase activity in platelets increased in the group IV after 7days and reduced in the groups III and IV after 15 days when compared with the control. In 30 days, no significant alteration was observed in the enzymes activities in synaptosomes and platelets of the groups studied. These results demonstrated that the NTPDase and 5 -nucleotidase activities are altered in synaptosomes and platelets the rats after an event the toxic demyelination in the central nervous system and that IFN-β interfered with the adenine nucleotide hydrolysis. / A atividade das enzimas NTPDase (E.C. 3.6.1.5, apirase, CD39) e 5 -nucleotidase (E.C. 3.1.3.5, CD73) foram avaliadas em sinaptossomas de córtex cerebral e plaquetas de ratos submetidos a desmielinização experimental pelo brometo de etídio (BE) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-β). Os seguintes grupos foram estudados: I - controle (salina), II - (salina e IFN-β), III - (BE) e IV - (BE e IFN-β). Após 7, 15 e 30 dias do procedimento cirúrgico, os animais (n=5) foram sacrificados e as amostras coletadas para os ensaios enzimáticos. Os resultados demonstraram que a atividade da NTPDase e 5 -nucleotidase em sinaptossomas aumentou no grupo III após 7 e 15 dias em relação ao grupo controle. O tratamento com IFN-β aumentou a hidrólise do ATP em sinaptossomas nos grupos II e IV após 7 dias e no grupo IV aos quinze dias enquanto que não foram observadas alterações na hidrólise do ADP em relação ao grupo I. A atividade da 5 -nucleotidase em sinaptossomas também aumentou no grupo II e IV aos quinze dias quando comparado ao grupo controle. Em relação as ectonucleotidases de plaquetas, os resultados demonstraram que a atividade da NTPDase está reduzida no grupo III após 7 e 15 dias e o tratamento com IFN-β aumentou a hidrólise dos nucleotídeos no grupo IV em relação ao grupo III. No grupo II foi observado uma redução na hidrólise do ATP e ADP após 7 dias e um aumento após 15 dias em relação ao grupo I. A atividade da 5 -nucleotidase em plaquetas aumentou no grupo IV após 7 dias e reduziu nos grupos III e IV após 15 dias quando comparado ao grupo controle. Aos 30 dias nenhuma alteração foi observada na atividade das enzimas em sinaptossomas e plaquetas dos respectivos grupos estudados. Estes resultados demonstraram que a atividade das enzimas NTPDase e 5 -nucleotidase está alterada em sinaptossomas e plaquetas de ratos após um evento de desmielinização tóxica no sistema nervoso central e que IFN-β interferiu com a hidrólise dos nucleotídeos de adenina.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 85.pdf: 911776 bytes, checksum: 157643f210a8dc4b9b4da249344c2332 (MD5) Previous issue date: 2009 / Os testes de triagem por serem sensíveis, específicos, rápidos e de baixo custo, vêmsendo largamente utilizados no monitoramento de contaminantes químicos, como osagrotóxicos, visando à prevenção de riscos para a saúde humana. Estes tipos de testes têmsido aplicados no monitoramento de um grande número de amostras, permitindo que aanálise cromatográfica seja realizada apenas em amostras potencialmente não-conformes, oque reduz substancialmente o custo. O leite bovino é um alimento essencial na dieta do serhumano e, especialmente, de crianças e são poucos os trabalhos de monitoramento deresíduos de agrotóxicos, neste tipo de alimento, realizados no Brasil. O aparecimento deresíduos de agrotóxicos no leite pode ocorrer pelo uso de rações e pastagens contaminadas,ou pelo tratamento, com agrotóxicos, especialmente alguns organofosforados, contraectoparasitas que atacam os animais. Desenvolveu-se um método de extração de resíduos de agrotóxicosorganofosforados (OFs) em leite bovino para detecção qualitativa desta classe desubstâncias através da inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) eposterior confirmação pela cromatografia gasosa (CG). Através das pesquisas realizadas estabeleceu-se um protocolo de extração dosagrotóxicos OFs de amostras de leite bovino para posterior detecção utilizando o kitenzimático e confirmação pela cromatografia em fase gasosa, bem como as condiçõesideais de análise usando o kit desenvolvido pelo Laboratório de Toxicologia Enzimática(ENZITOX) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), próprio para análise deOFs em água, adaptado para a detecção de organofosforados em leite bovino. O leite foicontaminado com parationa metílica e clorpirifós etil de modo que a concentração dessassubstâncias variassem na faixa de 5 a 200 ng/ml. Os resultados obtidos demonstraram que os métodos de extração e de detecção porinibição enzimática propostos, para o leite integral, permitem detectar, com segurança,níveis tão baixos quanto 5 ng/ml de clorpirifós, menor que o LMR não intencionalestabelecido pela ANVISA/MS que é de 10 ng/ml de clorpirifós etil na gordura do leite.Desde que somente concentrações de clorpirifós a partir da de 10 ng/ml foram detectadaspor cromatografia gasosa, nosso método mostrou-se mais sensível. O kit de inibiçãoenzimática demonstrou ser apropriado para monitoramento de contaminação do leite porclorpirifós. / Rapid and practical methods, like screening assays having sensibility, specificity, and low cost are widely used in monitoring programs for risk prevention of chemical contaminants. Screening tests are used as strategic tools when a large number of samples are involved. In these cases, chromatographic analysis is carried out only in potentially non-conforming samples, substantially reducing monitoring costs. The bovine milk is an essential food in adult and, specially, children diets. Considering that caws can accumulate such residues in milk from ingested food and also during ectoparasite treatment with insecticides and taking into account that, so far, a few pesticide monitoring programs in bovine milk were carried out in Brazil, we now propose, for this purpose, a practical methodology which could be useful in large scale survey programs. A method of extraction of organophosphorus pesticides in bovine milk was developed for the qualitative and quantitative detection of these substances. This technique is based on the inhibition of the acetylcholinesterase (AChE) enzyme by organophosphates that can be subsequently confirmed by gas chromatography. The enzymatic screening method used in this work, was initially developed by the ENZITOX laboratory of the Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), for the detection organophosphate and carbamate pesticides in the water. Therefore, the main objective of this work was to establish an organophosphate extraction protocol which could efficiently perform on the fat enriched-bovine milk matrix and, thus, be used in the simultaneous detection by enzymatic and chromatographic methods. For this purpose, milk samples were fortified with methyl-parathion and chlorpyriphos-ethyl in the concentration range 5 - 200 ng/ml. Results demonstrated that the proposed milk extraction and enzyme detection methods were able to efficiently detect 5 ng/ml of chlorpyriphos. The gas chromatographic method used could only detect chlorpyriphos from the initial concentration of 10 ng/ml. The ANVISA establishes a not intentional LMR of 10 ng/ml for chlorpyriphos-ethyl in milk samples. The proposed methodology proved to be appropriated and efficient for use in wide scale milk monitoring programs evaluating the presence of organophosphate pesticides.

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:37:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 helena_cruz_ioc_mest_2014.pdf: 2754297 bytes, checksum: 2c7ec678b1ed921a46dbd4c47b56cced (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / O uso de testes rápidos (TR) para detecção de marcadores de infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) pode ser uma ferramenta para aumentar o acesso ao diagnóstico em áreas de difícil acesso. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de TRs na detecção de marcadores do HBV para fins de diagnóstico e estudos epidemiológicos. Um painel de referência com amostras de soro de pacientes com infecção pelo HBV e indivíduos saudáveis foi confeccionado para avaliação dos testes rápidos na detecção do HBsAg. Após, amostras de soro, sangue total e saliva foram obtidas de indivíduos de três grupos: i) alta endemicidade, ii) Baixa prevalência, e iii) alta vulnerabilidade para aquisição do HBV, e foram empregadas para avaliação dos TRs de detecção de HBsAg, anti-HBs e anti-HBe. Cinco TR foram avaliados: Vikia HBsAg® (Biomérieux, França), HBsAg teste rápido (Doles, Brasil), e do fabricante Wama (Brasil), os testes: Imuno- Rápido HBsAg®, Imuno-rápido anti-HBsAg® e Imuno-rápido anti-HBeAg®. Amostras de soro foram avaliadas em todos os TR, saliva foi avaliada nos TR para a detecção do HBsAg e sangue total somente no TR Vikia HBsAg®. Os resultados dos TR foram comparados com os obtidos em testes imunoenzimáticos comerciais (EIE) para detecção de HBsAg e anti-HBs e teste de eletroquimioluminescencia (ECLIA) para detecção de anti-HBe. Os TR para detecção de HBsAg tiveram sua repetitividade e reprodutibilidade em amostras de soro e saliva avaliadas, assim como a determinação de reação cruzada a outras infecções O Vikia HBsAg® apresentou melhor concordância, utilizando amostras de soro no painel de referencia (98,68%) e no total dos grupos de diferentes perfis (96,08%), sendo melhor no grupo i (95,81%). Os diferentes TR para detecção do HBsAg utilizando amostras de soro apresentaram concordância acima de 93% no painel de referência e 87% nos grupos de diferentes perfis. Nos dois cenários, houve aumento da sensibilidade dos TRs para detecção do HBsAg de acordo com a presença do HBV DNA. O TR Vikia HBsAg® apresentou concordância em amostras de sangue total de 72,72%, exceto no grupo ii, onde não foi possível detectar amostras HBsAg verdadeiro positivas. Os TR para HBsAg apresentaram baixos valores de concordância em amostras de saliva (45,65%), somente o Imuno-rápido HBsAg® conseguiu detectar um maior número de amostras verdadeiro positivos (n=34). Os TR para detecção de anti-HBs e anti-HBe apresentaram concordâncias iguais a 54,73% e 56,89%, respectivamente. O Imuno-rápido anti-HBs® apresentou melhores valores de sensibilidade em amostras com altos títulos de anti-HBs e naquelas obtidas de indivíduos com anti-HBc e anti-HBs reagente. Os TR para HBsAg apresentaram excelente repetitividade e reprodutibilidade (concordância igual à 100%) em amostras de soro e saliva. Não foram observados resultados HBsAg falso positivo ou negativo em amostras reativas para Dengue, porém resultados discordantes foram observados em todos os TRs avaliados em amostras com sorologia reativa para HCV, HIV e Treponema pallidum. Conclui-se que, TR para detecção do HBsAg podem ser empregados no diagnóstico da infecção em amostras de soro, enquanto os TR para detecção de anti-HBe e anti-HBs apresentam baixo desempenho para uso diagnóstico. Palavras-chave: Teste rápido, HBsAg, anti-HBs, anti-Hbe / The use of rapid tests (RT) for the detection of hepat itis B virus (HBV) markers can be a tool for increasing access to diagnosis in hard to r each areas. The objective of this study was to evaluate the performance of RTs for d etection of HBV markers for purposes of diagnostic and epidemiological studies. A re ference panel with serum samples from HBV patients with HBV infection and health y individuals was made for evaluation of rapid tests for HBsAg detection. Then, se rum, whole blood and saliva samples were obtained from subjects of three groups: i) high endemicity, ii) low endemicity, and iii) high vulnerability for acquisiti on of HBV infection and were employed for evaluation of TRs for HBsAg, anti- HBs , a nti- HBe detection. Five RTs were evaluated: Vikia HBsAg ® (Biomérieux, France), HBsAg teste rápido ® (Doles, Brazil), and to manufactory Wama (Brazil) the testes: Imuno-rapido HBsAg ® , Imuno- rapido anti-HBsAg ® , and Imuno-rapido anti-HBeAg ® . Serum samples were evaluated in all rapid tests, saliva samples were evaluated in all RTs for HBsAg detection and whole blood was used only along to RT Vikia HBsAg ® . The results of RT were compared with the commercial enzyme immunoassays (EIA) f or HBsAg and anti-HBs detection and electrochemiluminescence assay for detectio n of anti-HBe. The RT for detection of HBsAg had the repeatability and reproduci bility in serum and saliva evaluated, as well as the determination of cross-reactivit y to other infections. The Vikia HBsAg ® (Biomérieux) showed the best concordance using serum sa mples in the reference panel (98.68%) and in total of groups w ith different profiles of endemicity (96.08%), whereas was better in group i (95 .81%). RT for HBsAg detection using serum samples showed concordance above: 93% in the reference panel and 87% in the groups with different profiles . In both scenarios, there was increased sensitivity of RT for HBsAg detection according to the presence of HBV DNA. The RT Vikia HBsAg ® showed good agreement in whole blood samples (72.72%), except in group ii , where it was not possib le to detect HBsAg true positive samples. RT for HBsAg showed low levels of agreement in saliva samples (45.65%), where only the Imuno-rápido HBsAg ® was able to detect a larger number of true positive samples (34). RT for detection of anti-HBs and anti-HBe showed concordance of 54.73% and 56.89%, respectively. The Imun o-rápido anti-HBs ® showed better sensibility results in samples with high titers of anti-HBs and those obtained from individuals with reactive anti-HBc and an ti-HBs. RT for HBsAg showed excellent repeatability and reproducibility (concordanc e equal to 100%) in serum and saliva. No HBsAg positive or false negative results were ob served in samples reactive for Dengue virus, but discordant results were o bserved in all RT evaluated in samples with reactive serology for HCV, HIV and Treponema pallidum . In conclusion, the rapid tests for HBsAg detection can be employed for the diagnosis of infection in serum, while RT for detection of anti-HBe and anti-HB s exhibit poor performance for diagnostic use.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTRA.pdf: 6023275 bytes, checksum: 87890c0b29cd99b76805b302af8bc9ac (MD5) Previous issue date: 2006-05-17 / This work involved the study of plant extracts of the Rutaceae species. Among 16 extracts tested in assays carried out with T. cruzi gGAPDH and L. tarentolae APRT enzymes and trypomastigote forms of T. cruzi, four showed significant activities at least in one of them. The petroleum ether extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCF) and the methanolic extract of leaves of Rauia sp (RFM) showed 94% and 75% of parasitic lyses on trypomastigote forms of T. cruzi. The methanolic extract of leaves of Rauia sp1 (RF1M) showed 74% of inhibition of gGAPDH enzyme and the dichloromethane extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCD) showed 74% of inhibition of APRT enzyme. The methanolic extract of leaves of Rauia sp1 (RF1M) showed 67,9% of inhibition on the APRT enzyme assay. The phytochemical study of Rauia sp allowed the isolation of 30 substances among them 4 are described for the first time, the coumarins 3-ethylrauianin and 5-methoxyrauianin and the alkaloids 7-hydroxy-8-methoxy-N-methylflindersine and 8- hydroxy-Nmethylflindersine that is described as a natural product at first time. Among them 26 have already been described in the literature the coumarins murranganone, 7- methoxy-8-(2-acetyloxy-3-methyl-1-oxobut-2-enyl)-coumarin, isomurranganone, murralongin, murrangatin, munomicrolin, murrangatin diacetate, rauianin, umbeliferone e isoescopoletin, the alkaloids N-methyl-4-methoxy-2-quinolone, mirtopsine, dictamine, γ-fagarine, skimmianine, Z-dimethylrhoifolinate, zantobungeanine, zantodioline and veprissine, the amides paprazine and N-transferuloyltyramine, the flavone 3,7,4 -trimethoxy-5-hydroxyflavone, the lignan siringaresinol, the fenolic coumpound vanilic acid and the steroids β-sitosterol and stigmasterol. The phytochemical study of Conchocarpus macrophyllus allowed the isolation of 4 substances the alkaloids arborinine and methylarborinine and the steroids β-sitosterol and stigmasterol. Among the substances tested in one or more assays none of them showed satisfactory results, leading to conclude that either the active compounds have not been isolated or their activity is related to the combination effects. / Este trabalho envolveu estudo fitoquímico de plantas pertencentes à família Rutaceae. Foram testados 16 extratos de plantas pertencentes à família Rutaceae em ensaios sobre as enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae e sobre formas tripomastigotas de T. cruzi quatro apresentaram atividades satisfatórias em pelo menos um dos ensaios a que foram submetidos. O extrato em éter de petróleo do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCE) e o extrato metanólico das folhas de Rauia sp (RFM) apresentaram 94% e 75% de lise parasitária frente às formas tripomastigotas de T. cruzi. O extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou 74% de inibição frente à enzima GAPDH e o extrato diclorometânico do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCD) apresentou 77% de inibição sobre a enzima APRT. O extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou resultado próximo ao considerado satisfatório (67,9% de inibição) no ensaio sobre a enzima APRT. O estudo fitoquímico de Rauia sp resultou no isolamento de 30 substâncias. Destas, 4 são inéditas na literatura; as cumarinas 3-etilrauianina e 5-metoxirauianina e os alcalóides 7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina e 8-hidroxi-N-metilflindersina, este último não foi ainda relatado como produto natural e 26 já foram descritas na literatura; as cumarinas murranganona, 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2- enil)-cumarina, isomurranganona, murralongina, murrangatina, munomicrolina, acetato de murrangatina, rauianina, umbeliferona e isoescopoletina, os alcalóides Nmetil- 4-metoxi-2-quinolona, mirtopsina, dictamina, γ-fagarina, esquimianina, Zrhoifolinato de dimetila, zantobungeanina, zantodiolina e veprissina, as amidas paprazina e N-trans-feruloiltiramina, a flavona 3,7,4 -trimetoxi-5-hidroxi flavona, a lignana siringaresinol, o composto fenólico ácido vanílico e a mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol. O estudo de Conchocarpus macrophyllus resultou no isolamento de 4 substâncias, os alcalóides acridônicos arborinina e metilarborinina e a mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol. Dentre as substâncias que tiveram o potencial biológico avaliado frente a um ou mais ensaios nenhuma apresentou resultado satisfatório.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6532.pdf: 4134216 bytes, checksum: 66fda1fc89e3d69ae6b01c3cbca83d4e (MD5) Previous issue date: 2015-02-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsin D is an aspartyl endopeptidase involved in many pathological processes when overexpressed. In addition, it is responsible for degradation of hemoglobin ingested by parasites of schistosomiasis. For these reasons cathepsin D is considered an important target for chemotherapeutic intervention. The assays commonly performed to evaluate the inhibition of this enzyme monitor reaction products generated from the cleavage of fluorogenic peptide substrates or human hemoglobin in the presence of inhibitors that may exhibit autofluorescence/absorbance at the same wavelength used. Considering this problem, this paper presents the development and application of four methodologies for cathepsin D assays. In two methodologies the assays were performed in solution, and in one of them was used isolated bovine cathepsin D, and the other employed an extract of proteins taken from Schistosoma mansoni adult worms. A third assay was developed to evaluate inhibitors by means of a CatD-IMER bioreactor coupled to a multidimensional system in which it is possible to monitor the immobilized enzyme activity directly by quantifying the product formed. Finally, the last methodology was carried out by immobilizing the substrate human hemoglobin in the quartz crystal. The hydrolysis of hemoglobin by cathepsin D was evaluated by using a Quartz Crystal Microbalance technique, a method that monitor the enzyme activity by mass variations. For the enzymatic assays, twenty plant extracts were evaluated, which led to the isolation and identification of the alkaloid evolitrine, the compound 4-hydroxy-3- methoxycinnamaldehyde and the flavonoids orientin and isovitexina. It were also tested 31 pure compounds, among them, the substance (Z)-2-(pentadec-5- enyl)benzene-1,4-diol, which showed significant activity both against the isolated enzyme as the protein extract of S. mansoni. Finally, recombinant cathepsin D from S. mansoni was cloned and expressed using E. coli system, and in vitro studies of isolated natural product compounds showed excellent results regarding the limonoid cedrelona against somules and adult worms of S. mansoni. / A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana, na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de Microbalança de Cristal de Quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (Z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol se destacou apresentando uma atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-12T17:12:09Z No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-15T12:23:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T12:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Ellen Flávia Moreira Gabriel - 2016.pdf: 5261570 bytes, checksum: 5ada90cb52637625bbd0a9853f342564 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This work describes several instrumental improvements to electrophoretic microchips (MSE) and microfluidic paper-based analytical devices (μPADs). The improvements are showed in terms of fabrication process, modification steps, control of sample volume and detection system. First off, a CO2 laser engraver was proposed to produce microchannels on a polymethyl methacrylate (PMMA) surface. All parameters were previously optimized in order to obtain a channel with the smallest dimension. Channels with 80 μm of deep and width were fabricated. MSE was coupled with amperometric detection and this work showed for the use of a decoupler produced by a mixture between PDMS and sugar the first time. The proof-of-concept testing of the final device demonstrated the analysis of a model mixture of phenolic compounds within 200 s with baseline resolution. Injection and control of the solution inside the microchannel was the another parameter improved during the development of this project. Hydrodynamic injector was developed using an electronic micropipette. The dispenser function of the micropipette can be explored to inject fractioned sample volumes inside the microchannel. The volume equaling 0.6 μL was considered ideal to completely fill the injection channel. In order to have better control of the sample volume, microdevices with different configuration were proposed. A microdevice with two auxiliary channels (split configuration) was select to realize the experimental part. When compared to electrokinetic injection, hydrodynamic showed better analytical performance including correcting the bias effect, which is the main problem related to electrokinetic injection. μPAD surface was modified by two different methodologies, using silica nanoparticles and chitosan. The modification process was used to solve the drawback related to the non-homogeneity or uniformity of color development in the detection zone. Silica nanoparticles and chitosan were incorporated on the cellulose surface to function as a new support to immobilize the selected enzyme. The modification process with both the nano and bio compounds improved the analytical performance, increased the reliability of the low cost platform and decreased the limit of detection (LD) of colorimetric system. The resulting LD for the glucose and uric acid assays were 23 and 37 μM, respectively. The enhanced analytical performance of modified the μPADs ensured for the first time the colorimetric detection of glucose in tear samples from four non-diabetic patients. The found concentration levels ranged from 130 to 380 μM. / O trabalho descrito nesta tese mostra uma variedade de melhorias instrumentais desenvolvida tanto para os microssistemas eletroforéticos (MSE) como para os dispositivos analíticos a base de papel (μPADs). As melhorias são discutidas em termos de processo de fabricação dos microdispositivos, modificação de superfície e manipulação da solução no interior dos microcanais. Inicialmente o uso de uma gravadora a laser foi proposta para a fabricação dos microcanais em substrato de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Todos os parâmetros do laser foram otimizados afim de fabricar canais nas menores dimensões possíveis. Canais com aproximadamente 80 μm de largura e profundidade foram obtidas. Os MSE fabricados com laser foram acoplados ao sistema de detecção amperométrica em que foi proposto pela primeira vez o uso de um desacoplador alternativo fabricado a partir da mistura entre o poli(dimetisiloxano) (PDMS) e açúcar. A prova de conceito do dispositivo fabricado com a gravadora a laser associada a detecção amperométrica foi demostrada na separação de uma mistura de compostos fenólicos em menos de 200 s e com ótima resolução de linha de base. A etapa de injeção e manipulação de solução no interior dos microcanais foi outra melhoria instrumental proposta no desenvolvimento deste trabalho. Desenvolveu-se um injetor hidrodinâmico alternativo a partir do uso de uma micropipeta eletrônica comercial. A micropipeta possui uma função dispenser que pode ser explorado para injetar volumes fracionados no interior dos microcanais. O volume de 0,6 μL foi denominado como o ideal para realizar a etapa de injeção. No intuito de se ter um melhor controle do volume de amostra, um arranjo de microcanais foi proposto. Os dispositivos fabricados na configuração contendo dois canais auxiliares foram determinados como os ideais. Quando comparada a injeção eletrocinética, o injetor hidrodinâmico apresentou um ótimo desempenho analítico corrigindo principalmente o efeito bias, um dos principais problemas relacionados ao processo de injeção eletrocinética. Em relação aos μPADs, foram propostas duas diferentes estratégias de modificação de superfície afim de corrigir problemas correlacionados à falta de homogeneidade e uniformidade de cor gerada na zona de detecção. Nanopartículas de sílica e quitosana foram diretamente incorporadas na superfície da celulose servido como um novo suporte para imobilização enzimática. A modificação com o nano e biocomposto melhorou significativamente o desempenho analítico dos μPADs corrigindo o efeito de lavagem, aumentando a confiabilidade analítica e reduzindo os limites de detecção do sistema colorimétrico. Os limites de detecção (LD) encontrado para os ensaios de glicose e ácido úrico foram de 23 e 37 μM, respectivamente. Devido as melhoras analíticas encontrada foi possível pela primeira vez demonstrar o uso dos dispositivos a base de papel para na detecção de glicose em amostra de lágrimas. Foram medidos os níveis de glicose na lágrima de quatro pacientes não diabéticos. Os níveis de glicose encontrado variou entre 130 a 380 μM.

NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase / NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis

Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato. / One of the strategies used in the development of new drugs involves the discovery of compounds that modulate the activity of enzymes, important in the infectious pathogens process. An interesting approach in the screening of new ligands is the use of methods based on immobilization of enzymes in chromatographic supports coupled to liquid chromatography systems. The use of IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) as a stationary phase coupled to high performance chromatographic systems consist in a strategy to a fast and efficient compounds screening and it has advantages comparing to the use of enzymes in solution. The enzyme NTPDase-1 Trypanosoma cruzi acts as a pathogen infection facilitator, thus inhibits the host immune response allowing a silent infection, suggesting its use as a good target in the search for inhibitors. In this paper, the enzyme NTPDase-1 was immobilized for the manufacturing of ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Studies of conditions to the use of these bioreactors in the ligands screening along with the development of a multidimensional chromatographic method were performed and validated. The chromatographic method optimization and validation, presented excellent results, relating to the obtained values, from evaluated parameters in bioanalytical methods. The enzyme immobilization was successfully performed, being possible to detect the catalytic activity in the chromatographic system (TcNTPDase1-ICER). The kinetic study for the substrate ATP was also performed in the TcNTPDase1-ICER, obtaining KM of 0.317 ± 0.044 mM, which in comparison with studies in solution KM of 0.096 mM, still presents high affinity for the substrate.