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Diverse Aspects of the Sorting and Assembly Machinery in Human Mitochondria / Diverse Aspekte der Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie in humanen Mitochondrien

Ott, Christine Kornelia January 2013 (has links) (PDF)
Mitochondria are organelles of endosymbiotic origin, which play many important roles in eukaryotic cells. Mitochondria are surrounded by two membranes and, considering that most of the mitochondrial proteins are produced in the cytosol, possess import machineries, which transport mitochondria-targeted proteins to their designated location. A special class of outer mitochondrial membrane (OMM) proteins, the β-barrel proteins, require the sorting and assembly machinery (SAM) for their OMM integration. Both mitochondrial β-barrel proteins and the central component of the SAM complex, Sam50, have homologs in gram-negative bacteria. In yeast mitochondria, bacterial β-barrel proteins can be imported and assembled into the OMM. Our group demonstrated that this, however, is not the case for human mitochondria, which import only neisserial β barrel proteins, but not those of Escherichia coli and Salmonella enterica. As a part of this study, I could demonstrate that β-barrel proteins such as Omp85 and PorB of different Neisseria species are targeted to human mitochondria. Interestingly, only proteins belonging to the neisserial Omp85 family were integrated into the OMM, whereas PorB was imported into mitochondria but not assembled. By exchanging parts of homologous neisserial Omp85 and E. coli BamA and, similarly, of neisserial PorB and E. coli OmpC, it could be demonstrated in this work that the mitochondrial import signal of bacterial β barrel proteins cannot be limited to one short linear sequence, but rather secondary structure and protein charge seem to play an important role, as well as specific residues in the last β-strand of Omp85. Omp85 possesses five conserved POTRA domains in its amino-terminal part. This work additionally demonstrated that in human mitochondria, at least two POTRA domains of Omp85 are necessary for membrane integration and functionality of Omp85. In the second part of this work, the influence of Sam50 on the mitochondrial cristae structure was investigated. This work contributed to a study performed by our group in which it was confirmed that Sam50 is present in a high molecular weight complex together with mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, metaxin 1 and metaxin 2. This connection between the inner and outer mitochondrial membrane was shown to be crucial for the maintenance of the mitochondrial cristae structure. In addition, a role of Sam50 in respiratory complex assembly, suggested by a SILAC experiment conducted in our group, could be confirmed by in vitro import studies. An influence of Sam50 not only on respiratory complexes but also on the recently described respiratory complex assembly factor TTC19 was demonstrated. It was shown that TTC19 not only plays a role in complex III assembly as published, but also influences the assembly of respiratory complex IV. Thus, in this part of the work a connection between the OMM protein Sam50 and maintenance of cristae structure, respiratory complex assembly and an assembly factor could be established. / Mitochondrien sind Zellorganellen endosymbiotischen Ursprungs, die viele wichtige Funktionen in eukaryotischen Zellen haben. Mitochondrien sind von zwei Membranen umgeben, und da die meisten Mitochondrienproteine im Cytosol hergestellt werden, besitzen sie Importmaschinerien, die die für die Mitochondrien bestimmten Proteine zu ihrem jeweiligen Zielort transportieren. Eine besondere Klasse von Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran (ÄMM), die β-Fassproteine, benötigen die Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie (SAM) für ihre Integration in die ÄMM. Sowohl mitochondriale β-Fassproteine als auch die zentrale Komponente des SAM-Komplexes, Sam50, haben Homologe in gramnegativen Bakterien. In Hefemitochondrien können bakterielle β Fassproteine importiert und in der ÄMM assembliert werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass dies jedoch nicht auf humane Mitochondrien zutrifft, die nur neisserielle β-Fassproteine importieren, nicht aber diejenigen von Escherichia coli und Salmonella enterica. Im Rahmen dieser Studie konnte ich zeigen, dass β Fassproteine verschiedener Neisserienarten, wie Omp85 und PorB, in humane Mitochondrien aufgenommen werden. Interessanterweise wurden nur Proteine der neisseriellen Omp85-Familie in die ÄMM eingebaut, während PorB zwar importiert, jedoch nicht assembliert wurde. Durch das Austauschen von Teilen von homologem neisseriellen Omp85 und E.coli BamA und ebenso von neisseriellem PorB und E. coli OmpC konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das mitochondriale Importsignal bakterieller β-Fassproteine nicht auf eine kurze lineare Sequenz eingegrenzt werden kann, sondern dass die Sekundärstruktur und die Ladung des Proteins eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, sowie im Fall von Omp85 einige bestimmte Aminosäurereste des letzten β-Stranges. Omp85 besitzt fünf konservierte POTRA-Domänen in seiner aminoterminalen Hälfte. In dieser Arbeit wurde zudem demonstriert, dass in humanen Mitochondrien mindestens zwei POTRA-Domänen von Omp85 für die Membranintegration und Funktionalität von Omp85 vorhanden sein müssen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Sam50 auf die mitochondriale Cristaestruktur untersucht. Diese Arbeit hat zu einer von unserer Gruppe durchgeführten Studie beigetragen, in der bestätigt werden konnte, dass Sam50 in einem hochmolekularen Komplex mit Mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, Metaxin 1 und Metaxin 2 vorliegt. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindung zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran unverzichtbar für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Cristaestruktur ist. Zudem konnte eine Rolle von Sam50 bei der Assemblierung von Atmungskettenkomplexen, die durch ein in unserem Labor durchgeführtes SILAC-Experiment nahegelegt worden war, durch in-vitro-Importstudien bestätigt werden. Weiterhin wurde ein Einfluss von Sam50 nicht nur auf Atmungskettenkomplexe, sondern auch auf einen vor kurzem beschriebenen Assemblierungsfaktor der Atmungskette, TTC19, demonstriert. Es wurde gezeigt, dass TTC19 nicht nur, wie veröffentlicht, eine Rolle bei der Assemblierung des Atmungskettenkomplexes III spielt, sondern auch die Assemblierung des Atmungskettenkomplexes IV beeinflusst. In diesem Teil der Arbeit konnte folglich eine Verbindung zwischen dem ÄMM-Protein Sam50 und der Organisation der Cristaestruktur, der Atmungskettenassemblierung und einem Assemblierungsfaktor nachgewiesen werden.
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Veränderungen der murinen mitochondrialen Funktion unter Einfluss verschiedener Sauerstoffkonzentrationen während mehrstündiger Beatmung / Impact of several hours of volatile anesthesia on mitochondrial function and oxidative damage in the murine heart and kidney utilizing different fractions of inspired oxygen

Balz, Milena Aurelia January 2018 (has links) (PDF)
Ziel dieser Arbeit war es Veränderungen mitochondrialer Atmungskettenfunktionen von murinem Herz und muriner Niere unter einer inhalativen Anästhesie mit Sevofluran in Abhängigkeit von der inspiratorischen Sauerstoffkonzentration zu untersuchen. In unserer in vivo Studie wurden männliche Black Six Mäuse 6 Stunden mit 1.0 MAC Sevofluran anästhesiert. Je nach Versuchsgruppe wurde mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von 21%, 50% oder 100% ventiliert. Am Ende des Versuchsprotokolls wurden Herz und Nieren entnommen und direkt weiterverarbeitet. Es erfolgten photometrische Analysen und einer Blue Native Polyacrylamid Gel Elektrophorese zur Darstellung der mitochondrialen Komplexaktivitäten, der Proteincarbonylierung mitochondrialer Proteine und der Empfindlichkeit der isolierten Mitochondrien gegenüber der Ca2+ induzierten Schwellung. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass eine sechsstündige volatile Anästhesie zu einer deutlichen Änderung der mitochondrialen respiratorischen Komplexaktivitäten, sowohl in der Niere als auch im Herzen führt. Insbesondere wies Komplex I eine erhöhte enzymatische Aktivität auf. Die Veränderungen der mitochondrialen Respiration waren größtenteils unabhängig von der inspiratorischen Sauerstoffkonzentration und führten zu keiner mitochondrialen Schädigung. Sowohl die Superoxid Produktion als auch die Proteincarbonylierung blieben unverändert. Die mitochondriale Empfindlichkeit gegenüber der Ca2+ induzierten Schwellung zeigte keine Veränderung gegenüber den Kontrolltieren. Somit ergaben sich keine toxischen Auswirkungen hoher Sauerstoffkonzentrationen im Sinne eines erhöhten oxidativen Schadens des mitochondrialen Proteoms oder einer Membranschädigung. / In the current study we investigated the impact of several hours of volatile anesthesia on mitochondrial function and oxidative damage in the heart and kidney of mice utilizing different fractions of inspired oxygen. Mice were randomly assigned to one of four study groups. The animals were either directly euthanized by cervical dislocation without any subsequent intervention or anesthetized with sevoflurane (1.0 MAC) utilizing different fractions of inspired oxygen in an air/O2 mixture of 21%, 50% or 100% after endotracheal intubation and mechanical ventilation, respectively. Cardiac and renal tissue was homogenized in a buffer the crude mitochondrial fraction was collected by centrifugation. Mitochondrial permeability transition was assessed by Ca2+-induced mitochondrial swelling. Opening of the mPTP was initiated by the addition of CaCl2 and determined following the decrease in light scattering. The reaction of certain amid acids of a protein with ROS leads to the formation of protein carbonyl derivates. The formed protein carbonyls, as a measure of generalized protein oxidation, was quantified spectrophotometrically utilizing the carbonyl specific reagent 2,4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH). The activity of superoxide dismutase (SOD) was determined utilizing a commercially available assay kit. The enzymatic functions of mitochondrial respiratory complexes I-IV were measured utilizing specific single-wavelength spectrophotometric. Each assay provides quantitative information concerning the maximal catalytic activities of the respective respiratory complex. Blue-Native PAGE electrophoresis was performed to determine in-gel catalytic activity of complex I, III and IV and supercomplexes. We found that inhalational anesthesia of six hours significantly increased respiratory complex I activity both in the kidney and the heart. The effects were independent of the supplied inspiratory oxygen concentration and did not cause oxidative damage even if the animals received 100% inspired oxygen throughout the six-hour protocol.
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Neuropathologie primärer und sekundärer Mitochondriopathien im Rahmen entzündlicher Muskelerkrankungen

Henkes, Greta 04 August 2011 (has links) (PDF)
Idiopathische Myositiden stellen die größte Gruppe der erworbenen Myopathien im Erwachsenenalter dar. Die Pathogenese dieser Erkrankungen ist sehr heterogen und nicht in allen Einzelheiten geklärt. Das Auftreten von mitochondrialen Veränderungen und mtDNADeletionen in idiopathischen Myositiden und deren pathophysiologische Bedeutung ist in der Literatur ein kontrovers diskutiertes Thema. Nach der Präsentation des bekannten Wissens über diese Erkrankungen wird in vorliegender Arbeit dieses Thema anhand lichtmikroskopischer Methoden unter Anwendung histologischer Spezialmethoden an Muskelbiopsien von 98 Patienten untersucht. Ziel der Arbeit ist es, mit verschiedenen histologischen Färbemethoden Hinweise für Mitochondrien-Alterationen und feinstrukturelle Charakteristika von primären Mitochondrialen Myopathien in idiopathischen Myositiden zu detektieren. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Anwendung einer neuen immunhistochemischen Methode unter Anwendung eines monoklonalen antimitochondrialen Antikörpers. Es wird der Fall eines Mädchens mit muskeldystrophischer Symptomatik dargestellt, dessen Muskelbiopsie im Alter von 7 Jahren die myohistologische Diagnose einer juvenilen Dermatomyositis und Hinweise auf eine mitochondriale Dysfunktion ergab. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Methode korrelieren gut mit anderen bekannten mitochondrialen Färbungen, sind sensitiver und stellen möglicherweise eine gute Ergänzung zu den bekannten mitochondrialen Markern und Färbungen dar. Die beobachteten mitochondrialen Dysfunktionen sprechen für die gestörte Mitochondrienfunktion und eine früh im Krankheitsverlauf, am ehesten sekundäre, Beteiligung der Mitochondrien im Krankheitsprozess dieser primär nicht mitochondrialen Erkrankungen
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Untersuchungen zur Oligomerisierung des Mitochondrien-assoziierten Anteils des p53 Tumorsuppressorproteins

Schmitt, Katrin 09 June 2009 (has links) (PDF)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Quartärstruktur des Tumorsuppressors p53 an Mitochondrien zu untersuchen. In vorangegangenen Untersuchungen der Arbeitsgruppe konnte festgestellt werden, dass der transkriptionsunabhängige Apoptoseweg von p53 an den Mitochondrien resistent war gegenüber dominant-negativer Hemmung durch mutiertes p53. Dadurch stellte sich die Frage, welche Mechanismen für diese Resistenz verantwortlich sind. Unter den zahlreichen, denkbaren Möglichkeiten erschienen zwei als wahrscheinlich: a) Der Mechanismus, der p53 nach Stress an die Mitochondrien transloziert, ist spezifisch für Wildtyp-Homotetramer; b) mitochondriales p53 liegt als Monomer vor. Für das experimentelle Vorgehen wurden HCT116 Colon-Adenokarzinomzellen und MCF-7 Mamaadenokarzinomzellen verwendet, die beide einen intakten p53- Apoptoseweg besitzen. Zudem wurden HCT116R175HPuro und HCT116R273HPuro verwendet, um die Eigenschaften von mutiertem p53 an Mitochondrien untersuchen zu können. Aus den Zellen wurden die Mitochondrien isoliert, um dann die mitochondrialen Proteine durch die beiden Crosslinker Bismaleimidohexan (BMH) und Glutaraldehyd (GLD) zu vernetzen. Durch einen Western Blot wurden die Proteine voneinander getrennt und detektiert. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass Wildtyp-p53 im Gesamtzellextrakt von HCT116 Zellen, ebenso wie die p53 Mutanten, sowohl als Monomer als auch als Oligomer vorkommt. Außerdem konnte eine Methode etabliert werden, mit der es möglich war, Oligomere durch eine Vernetzung mit BMH sichtbar zu machen. Um zeigen zu können, dass die Methode für Proteine an Mitochondrien geeignet war, wurden Bax-Oligomere an den Mitochondrien nachgewiesen. Mit der etablierten Methode konnten dann im Gesamtzellextrakt p53-Oligomere und –Monomere nachgewiesen werden, während p53 an den Mitochondrien unter gleichen Bedingungen nur als Monomer vorlag. Um die erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Experimente mit einem weiteren Crosslinker (Glutaraldehyd) wiederholt. Auch in diesen Untersuchungen konnte p53 als Monomer an den Mitochondrien nachgewiesen werden. Um zeigen zu können, dass diese vorliegenden Ergebnisse nicht nur für HCT116 Zellen gültig sind, wurden die beschriebenen Untersuchungen in einer weiteren Zelllinie vorgenommen. Die Ergebnisse bewiesen, dass auch in MCF-7 Zellen p53 vorwiegend als Monomer an den Mitochondrien vorkommt.
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Die Rolle der Phosphatidylserin Decarboxylase für die mitochondriale Phospholipid-Biosynthese in Arabidopsis thaliana / Role of phosphatidylserine decarboxylase in mitochondrial phospholipid biosynthesis of Arabidopsis thaliana

Nerlich, Annika January 2007 (has links)
Die durch Phosphatidylserin Decarboxylase (PSD) katalysierte Decarboxylierung von Phosphatidylserin (PS) zu Phosphatidylethanolamin (PE) ist für Mitochondrien in Hefe und Mäusen von essentieller Bedeutung. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde erstmals die Rolle dieses PE-Syntheseweges in Pflanzen untersucht. Die drei in Arabidopsis identifizierten PSD Gene atPSD1, atPSD2, atPSD3 codieren für Enzyme, die in Membranen der Mitochondrien (atPSD1), der Tonoplasten (atPSD2) und des Endoplasmatischen Retikulums (atPSD3) lokalisiert sind. Der Beitrag der einzelnen PSDs zur PE-Synthese wurde anhand von psd Null-Mutanten untersucht. Dabei stellte sich atPSD3 als das Enzym mit der höchsten Aktivität heraus. Alternativ zum PSD-Weg wird in Arabidopsis PE auch mittels Aminoalkohol-phosphotransferase synthetisiert. Der Verlust der gesamten PSD-Aktivität, wie es in der erzeugten psd Dreifachmutante der Fall ist, wirkt sich ausschließlich auf die Lipidzusammensetzung in der Mitochondrienmembran aus. Demzufolge wird extramitochondriales PE hauptsächlich über die Aminoalkoholphosphotransferase synthetisiert. Die veränderte Lipidzusammensetzung der Mitochondrienmembran hatte jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl, Größe und Ultrastruktur der Mitochondrien sowie auf das ADP/ATP-Verhältnis und die Respiration. Neben der Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten beeinflusst die Funktionalität der Mitochondrien auch die Bildung von Blüten- und Staubblättern. Diese Blütenorgane waren in der psd Dreifachmutante stark verändert, und der Blütenphänotyp ähnelte der APETALA3-Mutante. Dieses homöotische Gen ist für die Ausbildung von Blüten- und Staubblättern verantwortlich. Für die Erzeugung der Mutanten psd2-1 und psd3-1 wurde ein T-DNA Vektor verwendet, der den Promotor des APETALA3 Gens enthielt, welcher in den Mutanten psd2-1, psd3-1 sowie psd2-1psd3-1 und der psd1psd2-1psd3-1 Dreifachmutante eine vergleichbare Co-Suppression des APETALA3 Gens hervorruft. Der Blütenphänotyp trat jedoch nur in der psd Dreifachmutante auf, da nur in ihr die Kombination von geringen Funktionstörungen der Mitochondrien, hervorgerufen durch veränderte Lipidzusammensetzung, mit der Co-Suppression von APETALA3 auftritt. / Decarboxylation of phosphatidylserine (PS) to form phosphatidylethanolamine (PE) catalyzed by phosphatidylserine decarboxylase (PSD) is an essential reaction for mitochondria in yeast and mice. This dissertation describes the role of this biosynthesis pathway in plants for the first time. Three PSD genes were identified in Arabidopsis, atPSD1, atPSD2, atPSD3. The gene products localize to mitochondria (atPSD1), tonoplast (atPSD2) and endoplasmatic retikulum (atPSD3). Contribution to PE-synthesis of each PSD was analyzed using T-DNA insertion mutants. Thereby, atPSD3 was found to be the most active isoform. Alternatively, PE is also synthesized by the action of aminoalcohol phosphotransferase. Complete loss of PSD activity, like in the psd triple mutant, resulted in changes in lipid composition of mitochondria membranes exclusively. In conclusion the bulk of PE is synthesized by aminoalcohol phosphotransferase. Changed lipid composition of mitochondria did not result in changes of mitochondria number, structure, ADP/ATP ratio and respiration. Mitochondria functionality was formerly shown to effect formation of petals and stamens. These flower organs were drastically morphologically changed in psd triple mutants and showed strong similarities to APETALA3 mutants. APETALA3 is a homeotic gene responsible for specifying petals and stamens. Mutants psd2-1 and psd3-1 used for crossing psd double and triple mutants contained a T-DNA vector which include the promoter for APETALA3. This promoter caused co-suppression of the endogenous APETALA3 gene in all mutants isolated from the Arabidopsis Knockout Facility, whereas changed flower morphology occurred only in the triple mutant concluding a combined effect of co-suppression and a reduced functionality of mitochondria, caused by changed lipid composition.
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Protein phosphorylation in yeast mitochondria: enzymes, substrates and function / Proteinphosphorylierung in Mitochondrien der Hefe: Enzyme, Substrate und Funktion

Krause, Udo 28 October 2013 (has links) (PDF)
Protein phosphorylation is one of the major post-translational modifications to allow for signal transmission and fine tuning of metabolism on the cellular proteomic level. As such it is “one of the last instances” to modulate the activity of enzymes and hence to impact the cellular life irrespective of the basic conditions provided by the genome – and epigenome– controlled gene expression. The evolutionary increase in cellular complexity is reflected by highly sophisticated regulatory networks in multicellular eukaryotes based on the transfer of phosphate mostly onto the side chains of serine, threonine and tyrosine residues. Nature has chosen phosphate for inter- and intracellular communication, which is also an integral component of nucleic acids and can be regarded as the molecule of choice for life. Currently, life science is interested to unravel the network of reversible protein phosphorylation that is catalyzed by two antagonistic enzyme classes: the protein kinases and protein phosphatases. We are currently in the era of proteomics and enormously benefit from the progress of mass-spectrometry methods. This is documented by a huge number of “proteomic studies” that mostly provide a simple inventory of the existence of proteins – and/or their phosphorylated forms – under more or less defined conditions. So far, the physiological correlations could be established only in a few cases, e.g. by comparing two physiological conditions. Another strategy, which was addressed in this work, is the systematic screening of mutants defective in genes encoding either protein kinases or protein phosphatases. This approach benefits from the ease to predict these enzymes due to the presence of characteristic protein motifs. In combination with the major goal of this work – to shed light on the impact of protein phosphorylation in the mitochondrial (mt) compartment – the yeast Saccharomyces cerevisiae was chosen as a model system because of its respiro-fermentative metabolism, that allows for the maintenance of respiratory defective mutants. Indeed, this reverse genetic approach successfully revealed two kinases (Pkp1p, Pkp2p) and two phosphatases (Ppp1p, Ppp2p) as the key components regulating the pyruvate dehydrogenase complex by phosphorylation of serine 313 of its α- subunit Pda1p. In addition, evidence is provided that Pkp1p has an additional role in the assembly process of the PDH complex. Also, the effect of the deletion of the COQ8 gene (gene engaged in coenzyme Q synthesis; originally named ABC1) leading to respiratory deficiency, could be correlated with the phosphorylation of subunit Coq3p of the mitochondrial ubiquinone biosynthesis complex. Finally, in the case of the kinase Sat4p (protein involved in salt tolerance), overexpression of the enzyme was used as an alternative approach to unravel the molecular basis of the originally observed salt sensitivity of sat4 mutants. The data suggest that Sat4p has a direct or indirect role in the late steps of iron-sulfur (Fe/S) cluster assembly of the so-called “aconitase-type” enzymes in mitochondria, accompanied by a strongly reduced steady state concentration of the Fe/S-cluster protein aconitase. Interestingly, a secondary phenotype became apparent upon overexpression of Sat4p: the abundance of the lipoic acid containing mitochondrial proteome was markedly reduced. Most likely this phenotype is due to the fact that the synthesis and/or attachment of lipoic acid depend on a Fe/S-cluster bearing enzyme. In the course of the work it became clear that the regulatory (mt) protein phosphorylation network of yeast evolved to meet the criteria of a life adapted to the ecological niche on temporarily available sugar rich sources. Clearly, the transfer of the respective data to higher eukaryotes is limited. However, it shows that yeast is primarily an excellent model system for the principal molecular reactions shared with higher eukaryotes. / Phosphorylierungen von Aminosäuren ist eine der verbreitetsten post-translationalen Modifikationen für zelluläre Signalübertragungswege und zur Regulation des Metabolismus auf Proteom-Ebene. Mit der reversiblen Protein-Phosphorylierung eng verbunden ist die unabhängige Modulation der Aktivität von Enzymen ungeachtet der Genom- und Epigenom-basierten Genexpression. Die evolutionäre Zunahme der zellularen Komplexität äußert sich in zunehmend komplexeren Regulations-Netzwerken in mehrzelligen eukaryotischen Organismen basierend auf dem Transfer von Phosphatgruppen vorzugsweise auf die Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin. Die Natur hat evolutionär als Baustein der inter- und intrazellulären Kommunikation Phosphat gewählt, welches auch ein integraler Bestandteil der Nukleinsäuren ist und somit als das „Molekül der Wahl“ für das Leben bezeichnet werden darf. Die Lebenswissenschaften sind gegenwärtig daran interessiert das Netzwerk der Proteinphosphorylierung aufzuklären, welches durch zwei antagonistisch wirkende Enzymklassen, die Proteinkinasen und Proteinphosphatasen charakterisiert ist. Dabei profitieren wir gegenwärtig von den Fortschritten der „Proteomics-Ära“ auf dem Gebiet der massenspektrometrischen Proteinidentifizierung. Ausdruck dessen ist eine Vielzahl von Proteom-Studien, die jedoch meist nur eine einfache Inventarisierung der unter mehr oder weniger gut definierten zellulären Bedingungen existierenden Proteine in ihrer Phosphat-modifizierten oder unphosphorylierten Form darstellen. Die beteiligten Enzyme werden dabei kaum berücksichtigt. Insbesondere gilt dies für extra-cytoplasmatische Ereignisse. Bisher gelang es nur in wenigen Fällen eine Korrelation der physiologischen Rolle dieser Proteinmodifikation, z.B. durch den Vergleich der Phospho-Proteome unter zwei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen, herzustellen. Eine andere Strategie, die auch Gegenstand dieser Arbeit ist, sieht ein Screening von Mutanten vor, die durch Deletionen von Genen, die für Proteinkinasen bzw. –phosphatasen kodieren, gekennzeichnet sind. Dieser Ansatz profitiert von der Existenz und leichten bioinformatischen Vorhersagbarkeit charakteristischer Kinase- bzw. Phosphatase- Sequenzmotive. In Kombination mit dem Hauptziel der Arbeit – Licht ins Dunkel der Proteinphosphorylierung im mitochondrialen Kompartiment zu bringen – wurde die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem gewählt, insbesondere vor dem Hintergrund ihres fermentativen Metabolismus. Als Beleg der prinzipiellen Funktionalität des vorgeschlagenen Ansatzes konnten zwei Kinasen (Pkp1p, Pkp2p) und zwei Phosphatasen (Ppp1p, Ppp2p) als Schlüsselkomponenten der Regulation des Pyruvatdehydrogenase (PDH) Komplexes identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus konnte sowohl das Zielprotein der Phosphorylierung, Pda1p, die α-Untereinheit des Komplexes, als auch die modifizierte Aminosäure (Serin 313) experimentell bestätigt werden. Ferner konnte der Atmungsdefekt von Stämmen mit einer nicht-funktionellen Abc1p-Kinase mit dem Phosphorylierungszustand der Untereinheit Coq3p des Ubiquinon-Biosynthese Komplexes und dem Ausfall der Ubiquinonsynthese korreliert werden. Eine alternative Herangehensweise, die Überexpression einer Kinase, führte zur Identifizierung möglicher Zielproteine von Sat4p. Vergleichende Analysen des 2D-gelelektrophoretisch separierten mitochondrialen Genoms mit dem des Wildtyps legen die Vermutung nahe, dass Sat4p eine direkte oder indirekte Rolle bei der Regulation der „Aconitase-Typ“ Eisen-Schwefel (Fe/S) Proteine besitzt. Der darüber hinaus beobachtete Effekt einer Abnahme von Liponsäure-tragenden mitochondrialen Enzymen, ist wahrscheinlich sekundärer Natur und kann durch die Zugehörigkeit der Liponsäure-Synthase zur oben erwähnten Gruppe der „Aconitase-Typ“ -Fe/S-Proteine erklärt werden. Im Verlauf der Arbeit wurde deutlich, dass das regulatorische Netzwerk der Proteinphosphorylierung der Hefe eher den Kriterien einer evolutionären Adaptation an eine spezifische ökologische Nische – der temporären Verfügbarkeit zuckerreicher Substanzen – entsprechen. Das schränkt die Übertragbarkeit der gewonnen Einsichten in die Regulation des mitochondrialen Metabolismus auf höhere Eukaryonten ein. Es zeigt jedoch, dass Hefe in erster Linie ein exzellentes Modellsystem für die prinzipiellen molekulare Mechanismen ist, die sie mit den höheren Eukaryonten teilt.
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Untersuchung der Heterogenität submitochondrialer Proteinverteilungen mit hochauflösender Mikroskopie / Analysis of the Heterogeneity of submitochondrial Proteindistributions with high resolution Microscopy

Stagge, Franziska 15 October 2014 (has links)
Mitochondrien sind essentielle Organellen eukaryotischer Zellen. Sie erfüllen eine Vielzahl wichtiger Funktionen in den Zellen: neben ihrer herausragenden Bedeutung für die Energieproduktion haben sie eine zentrale Rolle im Stoffwechsel, der Ionenhomöostase, sowie beim Zelltod. Weiterhin sind Mitochondrien hochdynamische Organellen. Die Erscheinung des mitochondrialen Netzwerks wird durch die Vorgänge der Fusion und Teilung kontinuierlich verändert. Eine morphologische oder funktionale Heterogenität dieser Organellen wurde bereits in verschiedenen Zelltypen und innerhalb einzelner Zellen beobachtet. Über die Bedeutung dieser Beobachtungen gibt es jedoch nur Vermutungen. Es wird angenommen, dass sie die Folgen eines mitochondrialen Anpassungsmechanismus an unterschiedliche metabolische Anforderungen darstellen. Bislang ist wenig darüber bekannt, ob mitochondriale Proteine auch eine heterogene intrazelluläre Verteilung aufweisen. Um Informationen über die Lokalisation mitochondrialer Proteine zu erhalten, wird unter anderem die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl Konfokal- als auch beugungsunbegrenzte STED-Mikroskopie in Kombination mit mathematischen Auswertealgorithmen verwendet, um mitochondriale Proteinverteilungen quantitativ innerhalb einzelner Säugerzellen zu analysieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Vielzahl mitochondrialer Proteine, welche in verschiedenen mitochondrialen Subkompartimenten lokalisieren und unterschiedliche Funktionen erfüllen, eine heterogene Dichteverteilung in Form eines Gradienten, mit einer höheren Proteindichte in Zellkernnähe, innerhalb einzelner Zellen aufweist. Diese Gradientenverteilung ist zudem bereits direkt nach der Zellteilung in beiden Tochterzellen zu beobachten. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Hyperelongation von Mitochondrien eine Verringerung des Ausmaßes der Gradientenverteilung von Tom20 bewirkt. Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass in Zellen, in denen die Mikrotubuli depolymerisiert vorliegen, das Ausmaß der intrazellulären Tom20-Gradientenverteilung deutlich verringert ist. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass der Vorgang des mitochondrialen Transports einen entscheidenden Einfluss auf die heterogene Verteilung mitochondrialer Proteine hat. Somit wurde durch diese Arbeit das Verständnis der intrazellulären Heterogenität mitochondrialer Proteinverteilungen entscheidend verbessert. Durch die erhaltenen Ergebnisse kann festgestellt werden, dass viele mitochondriale Proteine eine heterogene Verteilung in Form eines intrazellulären Dichtegradienten aufweisen, die durch Vorgänge der mitochondrialen Dynamik (Teilung, Bewegung) kontrolliert wird.
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Neuropathologie primärer und sekundärer Mitochondriopathien im Rahmen entzündlicher Muskelerkrankungen: Neuropathologie primärer und sekundärerMitochondriopathien im Rahmen entzündlicherMuskelerkrankungen

Henkes, Greta 10 March 2011 (has links)
Idiopathische Myositiden stellen die größte Gruppe der erworbenen Myopathien im Erwachsenenalter dar. Die Pathogenese dieser Erkrankungen ist sehr heterogen und nicht in allen Einzelheiten geklärt. Das Auftreten von mitochondrialen Veränderungen und mtDNADeletionen in idiopathischen Myositiden und deren pathophysiologische Bedeutung ist in der Literatur ein kontrovers diskutiertes Thema. Nach der Präsentation des bekannten Wissens über diese Erkrankungen wird in vorliegender Arbeit dieses Thema anhand lichtmikroskopischer Methoden unter Anwendung histologischer Spezialmethoden an Muskelbiopsien von 98 Patienten untersucht. Ziel der Arbeit ist es, mit verschiedenen histologischen Färbemethoden Hinweise für Mitochondrien-Alterationen und feinstrukturelle Charakteristika von primären Mitochondrialen Myopathien in idiopathischen Myositiden zu detektieren. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Anwendung einer neuen immunhistochemischen Methode unter Anwendung eines monoklonalen antimitochondrialen Antikörpers. Es wird der Fall eines Mädchens mit muskeldystrophischer Symptomatik dargestellt, dessen Muskelbiopsie im Alter von 7 Jahren die myohistologische Diagnose einer juvenilen Dermatomyositis und Hinweise auf eine mitochondriale Dysfunktion ergab. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Methode korrelieren gut mit anderen bekannten mitochondrialen Färbungen, sind sensitiver und stellen möglicherweise eine gute Ergänzung zu den bekannten mitochondrialen Markern und Färbungen dar. Die beobachteten mitochondrialen Dysfunktionen sprechen für die gestörte Mitochondrienfunktion und eine früh im Krankheitsverlauf, am ehesten sekundäre, Beteiligung der Mitochondrien im Krankheitsprozess dieser primär nicht mitochondrialen Erkrankungen:INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................. I Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................................................iii 1 EINLEITUNG....................................................................................................... 1 1.1 Einführung ...................................................................................................................................................... 1 1.2 Aufbau und Funktion der Skelettmuskulatur............................................................................................... 1 1.3 Die Mitochondrien.......................................................................................................................................... 6 1.4 Erkrankungen der Skelettmuskulatur......................................................................................................... 11 1.4.1 Diagnostik der Skelettmuskelerkrankungen............................................................................................. 11 1.4.2 Entzündliche Muskelerkrankungen.......................................................................................................... 13 1.4.2.1 Polymyositis.................................................................................................................................... 15 1.4.2.2 Dermatomyositis .............................................................................................................................. 18 1.4.2.3 Einschlusskörpermyositis................................................................................................................ 21 1.4.3 Mitochondriale Myopathien..................................................................................................................... 23 1.5 Die Muskelbiopsie......................................................................................................................................... 26 1.6 Die Lichtmikroskopie der Skelettmuskulatur ............................................................................................. 28 1.6.1. Die Enzymhistochemie ........................................................................................................................... 28 1.6.2. Grundlagen der Immunhistochemie ........................................................................................................ 31 1.7 Die Elektronenmikroskopie .......................................................................................................................... 35 2 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................... 36 2.1 Patienten........................................................................................................................................................ 36 2.1.1 Das Patientenkollektiv ............................................................................................................................. 36 2.1.2 Besonderer Fall einer Patientin mit juveniler Dermatomyositis............................................................... 38 2.2 Methoden....................................................................................................................................................... 44 2.2.1 Die Lichtmikroskopie .............................................................................................................................. 44 2.2.1.1 Enzymhistochemie ........................................................................................................................... 46 2.2.1.2 Immunhistochemie ........................................................................................................................... 49 2.2.2 Die Elektronenmikroskopie ..................................................................................................................... 54 2.3 Statistische Methoden .................................................................................................................................. 54 3 ERGEBNISSE ....................................................................................................... 56 3.1 Ergebnisse der Lichtmikroskopie................................................................................................................ 56 3.1.1 Ergebnisse der Enzymhistochemie........................................................................................................... 56 3.1.2 Ergebnisse der Immunhistochemie .......................................................................................................... 62 3.1.3 Korrelation der Ergebnisse der Enzymhistochemie und Immunhistochemie ........................................... 70 Inhaltsverzeichnis ii 3.2 Ergebnisse der Elektronenmikroskopie....................................................................................................... 73 4 DISKUSSION .................................................................................................... 76 4. 1 Lichtmikroskopie......................................................................................................................................... 76 4.1.1 Enzymhistochemie .................................................................................................................................. 76 4.1.1.1 Cytochrom-c-Oxidase ...................................................................................................................... 76 4.1.1.2 NADH............................................................................................................................................. 80 4.1.1.3 SDH ................................................................................................................................................ 80 4.1.1.4. Engel .............................................................................................................................................. 81 4.1.2 Immunhistochemie.................................................................................................................................. 84 4.2 Elektronenmikroskopie ................................................................................................................................ 89 4.3 Besonderer Fall einer Patientin mit juveniler Dermatomyositis ............................................................... 90 4.4 Effekte des Alterns auf die Mitochondrien und deren klinische Bedeutung ............................................ 93 4.5 Die Rolle der Mitochondrien in der Pathogenese der entzündlichen Muskelerkrankungen .................. 94 5 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................... 98 6 QUELLENANGABEN...................................................................................... 102 6.1 Literaturverzeichnis........................................................................................................................... 102 6.2 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................... 109 6.3 Tabellenverzeichnis .................................................................................................................................... 110 7 DANKSAGUNG................................................................................................... 111 8 LEBENSLAUF..................................................................................................... 112 9 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT ... 113
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Elektrophysiologische Charakterisierung der Proteintranslokationsporen der Äußeren Mitochondrienmembran

Becker, Lars 07 July 2008 (has links)
In der vorliegenden Arbeit konnte am rekombinanten Tom40 aus Neurospora crassa und aus Saccharomyces cerevisiae gezeigt werden, dass in beiden Spezies ein einziges Tom40-Molekül in der Lage ist ein membrandurchspannendes Beta-Barrel Protein aus 16 transmembranen Beta-Strängen auszubilden. Tom40 aus beiden Spezies bildet einen kationenselektiven Kanal dessen charakteristischer Hauptleitwert eine gute Übereinstimmung zu publizierten Werten zeigt und genau einer porenbildenden Einheit im TOM-Komplex entspricht. Ein generell unterschiedliches Verhalten von Tom40 durch eine Fehlfaltung des zuvor denaturierten Proteins, kann also ausgeschlossen werden. Der Kanal interagiert seitenabhängig mit aminoterminalen mitochondrialen Präsequenzen. Die Spezifität der Wechselwirkung mit Tom40 ist jedoch geringer als die mit dem TOM-Komplex. In elektrophysiologischen Untersuchungen des SAM-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae konnte gezeigt werden, dass Sam50 die charakteristische porenbildende Einheit im Komplex darstellt. Sam50 aus Saccharomyces cerevisiae und Homo sapiens bilden kationenselektive Kanäle, wobei der Hauptleitwert im humanen Protein signifikant größer als im Hefe-Protein ist. Der evolutiv konservierte C-Terminus von Sam50 reicht hierbei aus diese Pore zu bilden, ist aber im Vergleich zum Volllängenprotein stark im Schaltverhalten beeinträchtigt. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Sam50, spiegeln exemplarisch die Werte verwandter Poren der Omp85-Familie wider. Der Sam50-Kanal wird im SAM-Komplex durch die ebenfalls essenzielle Komponente Sam35 reguliert. Es konnte gezeigt werden, dass sich durch eine Interaktion von Sam35-Protein mit einem konservierten Beta-Signalpeptid der Komplex in einen aktiven Zustand größerer Leitfähigkeit überführen lässt, der sich durch ein dynamisches Schaltverhalten und das Auftreten multipler Leitwerte auszeichnet, wobei im Komplex mehrere Porenproteine am Stromfluss beteiligt sind.
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Untersuchungen zur Oligomerisierung des Mitochondrien-assoziierten Anteils des p53 Tumorsuppressorproteins

Schmitt, Katrin 07 April 2009 (has links)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Quartärstruktur des Tumorsuppressors p53 an Mitochondrien zu untersuchen. In vorangegangenen Untersuchungen der Arbeitsgruppe konnte festgestellt werden, dass der transkriptionsunabhängige Apoptoseweg von p53 an den Mitochondrien resistent war gegenüber dominant-negativer Hemmung durch mutiertes p53. Dadurch stellte sich die Frage, welche Mechanismen für diese Resistenz verantwortlich sind. Unter den zahlreichen, denkbaren Möglichkeiten erschienen zwei als wahrscheinlich: a) Der Mechanismus, der p53 nach Stress an die Mitochondrien transloziert, ist spezifisch für Wildtyp-Homotetramer; b) mitochondriales p53 liegt als Monomer vor. Für das experimentelle Vorgehen wurden HCT116 Colon-Adenokarzinomzellen und MCF-7 Mamaadenokarzinomzellen verwendet, die beide einen intakten p53- Apoptoseweg besitzen. Zudem wurden HCT116R175HPuro und HCT116R273HPuro verwendet, um die Eigenschaften von mutiertem p53 an Mitochondrien untersuchen zu können. Aus den Zellen wurden die Mitochondrien isoliert, um dann die mitochondrialen Proteine durch die beiden Crosslinker Bismaleimidohexan (BMH) und Glutaraldehyd (GLD) zu vernetzen. Durch einen Western Blot wurden die Proteine voneinander getrennt und detektiert. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass Wildtyp-p53 im Gesamtzellextrakt von HCT116 Zellen, ebenso wie die p53 Mutanten, sowohl als Monomer als auch als Oligomer vorkommt. Außerdem konnte eine Methode etabliert werden, mit der es möglich war, Oligomere durch eine Vernetzung mit BMH sichtbar zu machen. Um zeigen zu können, dass die Methode für Proteine an Mitochondrien geeignet war, wurden Bax-Oligomere an den Mitochondrien nachgewiesen. Mit der etablierten Methode konnten dann im Gesamtzellextrakt p53-Oligomere und –Monomere nachgewiesen werden, während p53 an den Mitochondrien unter gleichen Bedingungen nur als Monomer vorlag. Um die erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Experimente mit einem weiteren Crosslinker (Glutaraldehyd) wiederholt. Auch in diesen Untersuchungen konnte p53 als Monomer an den Mitochondrien nachgewiesen werden. Um zeigen zu können, dass diese vorliegenden Ergebnisse nicht nur für HCT116 Zellen gültig sind, wurden die beschriebenen Untersuchungen in einer weiteren Zelllinie vorgenommen. Die Ergebnisse bewiesen, dass auch in MCF-7 Zellen p53 vorwiegend als Monomer an den Mitochondrien vorkommt.

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