Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / L'objectif principal des études présentées dans cette thèse était d'étudier les effets métaboliques et anti-inflammatoires des acides gras oméga-3 et leurs dérivés bioactifs, nommés résolvines et protectines, dans le contexte d'obésité et d'insulino-résistance. Afin d'atteindre ce but, nous avons utilisé une nouvelle lignée de souris transgénique, fat-1, qui nous permet d'augmenter les niveaux d'acides gras oméga-3 sans modifier la diète expérimentale. Dans la première étude, nous avons démontré que le rétablissement des acides gras oméga-3 dans les souris obèses nourries avec une diète riche en gras, pouvait augmenter la synthèse des dérivés bioactifs des acides gras oméga-3, notamment les protectines, dans le tissu adipeux et le muscle squelettique. Ceci était associé à une meilleure capacité à résoudre une réponse inflammatoire aigùe et à une diminution de l'inflammation dans le tissu adipeux. De plus, les souris fat-1 obèses ont démontré une meilleure sensibilité à l'insuline et une plus grande tolérance au glucose. Tout cela avec un gain de poids et accretion de graisse équivalents à leurs homologues sauvages. Dans la seconde étude, nous avons analysé les effets métaboliques et antiinflammatoires de l'administration de la protectine DX dans des macrophages in vitro ainsi que dans les souris in vivo. En plus des activités anti-inflammatoires anticipées, nous avons pu observer que la protectine DX possède une activité antidiabétique unique qui pourrait être expliquée par une sécrétion d'interleukine-6 impliquée dans l'inhibition de l'expression des enzymes de la gluconéogenèse dans le foie. Dans la troisième étude, nous avons effectué une analyse comparative par biopuces du tissu adipeux des souris fat-1 obèses et des souris sauvages. Cette étude nous a permis de révéler cinq voies ciblées par des acides gras oméga-3 dans le tissu adipeux. Nous avons pu valider certaines cibles par PCR quantitatif et par histologie. L'ensemble de nos études démontre le rôle déterminant des acides gras oméga-3 et leurs dérivés, notamment les protectines, dans l'homéostasie métabolique. De plus, nous avons été en mesure d'identifier la protectine DX comme un nouvel agent thérapeutique qui possède un important potentiel pour le traitement du diabète de type 2 et de l'obésité.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / L'insuline est une hormone sécrétée par les cellules ? du pancréas qui maintient l'homéostasie glucidique en stimulant, notamment, l'entrée du glucose dans le muscle squelettique et le tissu adipeux en situation postprandiale. Elle exerce ces effets en enclanchant une cascade de signaux intracellulaires médiés via son interaction avec le récepteur de l'insuline et culminant vers la translocation des transporteurs de glucose GLUT4 à la surface cellulaire. La régulation de l'action de l'insuline sur le transport du glucose peut être affectée de façon importante par les nutriments, tels que les glucides, lipides et protéines. Les diverses études présentées dans cette thèse montreront le rôle important des facteurs nutritionnels dans la modulation de la signalisation insulinique et de la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique de rats, ainsi que dans des cellules musculaires et adipeuses in vitro. La première étude fut réalisée chez des rats nourris avec une diète riche en lipides où nous avons montré, chez ces derniers, des défauts d'activation de la phophatidylinositol (PI) 3- kinase ainsi que de ses effecteurs proximaux, l'Akt et les protéines kinases C atypiques, par l'insuline. / Cette défectuosité de la signalisation insulinique s'accompagnait d'une diminution de la translocation de GLUT4 autant à la membrane plasmique qu'aux tubules transversaux (T) comparativement à celle observée chez des animaux nourris avec une diète de type chow. Lors de notre deuxième étude, nous nous sommes intéressés à élucider les mécanismes cellulaires par lesquels les protéines issues de la morue prévenaient le développement de la résistance à l'insuline chez des rats rendus obèses suite à l'ingestion d'une diète hyperlipidique. Nous avons en effet observé que ces protéines, comparativement à la caséine et à la protéine de soya, normalisaient l'action de l'insuline sur l'activation de la voie PI 3-kinase/Akt et rétablissaient presqu'entièrement la translocation de GLUT4 au niveau des tubules T. / Dans notre troisième étude, nous nous sommes intéressés au rôle des acides aminés sur l'action de l'insuline dans les cellules musculaires L6 en culture. Nous avons montré que l'ajout d'acides aminés au milieu d'incubation réduisait la stimulation du transport du glucose par l'insuline, un phénomène complètement bloqué par la rapamycine, un inhibiteur hautement spécifique de la mammalian target of rapamycin (mTOR). En effet, nous avons observé que les acides aminés potentialisaient l'activation de la voie mTOR, telle que mesurée par la phosphorylation de la p70 S6 kinase, par l'insuline. Finalement, le rôle de la voie mTOR fut étudié dans les adipocytes 3T3-L1 en culture lors de notre quatrième étude. Nous avons observé que l'activation de cette voie par l'insuline seule ou par les acides aminés en conjonction avec l'insuline menait à une diminution très rapide de l'action de l'insuline sur le transport du glucose en découplant l'activation de la PI 3-kinase à celle de l'Akt. L'ensemble de ces études montre le rôle important que jouent les nutriments, plus particulièrement les protéines et les acides aminés, sur l'action de l'insuline dans les cellules musculaires et adipeuses.

La dystrophie myotonique est une maladie génétique multisystémique touchant entre autre les muscles. Elle est causée par la présence d'un triplet CTG répété en 3'UTR du gène de la DMPK. Cette mutation cause notamment la rétention de l'ARNm mutant dans le noyau des myoblastes, ce qui conduit à la formation de foci contenant des agglomérats d'ARN et de protéines. Notre équipe a développé plusieurs thérapies visant à détruire l'ARNm muté : deux ARN interférents, un ribozyme et un ARN antisens. Ces thérapies fonctionnent en cultures cellulaires mais leur effet n'avait pas été testé in vivo. Mon projet consistait donc en la transplantation de myoblastes "corrigés" dans des muscles de souris afin d'observer l'effet des thérapies in vivo. Des vecteurs lentiviraux contenant chacun une thérapie ont été générés, puis les lentivirus correspondants ont été produits. Les myoblastes ont été infectés, sélectionnés, puis greffés dans les tibialis antérieurs de souris SCID (immunodéficientes) préalablement irradiés. Un mois après la greffe, les souris ont été sacrifiées et leurs tibialis ont été analysés. Une immunohistochimie a été réalisée sur ces coupes avec l'anticorps antidystrophine humaine, afin de différencier les fibres musculaires d'origine humaine des fibres murines. La taille des fibres corrigées a été comparée à la taille des fibres témoins. Les transplantations effectuées n'ont malheureusement pas fonctionné sans doute à cause d'une mauvaise injection des myoblastes.

Le spermatozoïde doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, nommée capacitation, lui permettant ainsi d'acquérir son pouvoir fécondant. La phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques, observée durant la capacitation, fait partie des modifications que doit subir le spermatozoïde pour être en mesure de féconder l'ovule. Au cours des dernières années, plusieurs tyrosine kinases, les enzymes responsables de cette phosphorylation, ont été identifiées dans les spermatozoïdes de différents mammifères. Des études réalisées par l'utilisation d'inhibiteurs de ces enzymes ont démontré que les membres de la famille des src pouvaient être, en partie, responsables de l'élévation du contenu en phosphotyrosine lors de la capacitation. Il a donc été entrepris de détecter la présence des différents membres de cette famille dans les spermatozoïdes. Au cours de l'étude pour l'identification des tyrosine kinases de la famille des src dans le spermatozoïde, des isofolmes codant pour yes, lyn, lck et hck ont été identifiés. De plus, un isofonne tronqué de hck, nomlné hck-tr, a été identifié dans les cellules germinales haploïdes de taureau. Le but de ce projet de doctorat était donc de déterminer si la protéine hck et/ou son isoforme tronqué étaient impliqués dans la capacitation, réaction de l'acrosome et l'hyperactivité; processus menant à la fécondation. La première partie du projet avait pour objectif de confirmer la présence des ARNm encodant les isoformes de hck dans les cellules germinales et déterminer si la protéine correspondante était exprimée au niveau des spermatozoïdes matures. Les résultats obtenus ont permis de confirmer la présence des messagers identifiés et de montrer la présence, par l'utilisation d'anticorps spécifiques, des deux protéines dans les différentes cellules spermatogéniques. La caractérisation de ces isoformes a par la suite été entreprise permettant ainsi la localisation de hck -tr dans le testicule et le spermatozoïde bovin. La présence d'une forme active de la kinase pleine longueur a, quant à elle, été démontrée dans le testicule ainsi que dans les spermatozoïdes épididymaires et éjaculés. La dernière partie du projet consistait en la détermination des rôles potentiels que pouvaient avoir les isoformes de hck dans les événements menant à la fécondation. Hck-tr pourrait ainsi agir comme un inhibiteur puisque sa présence a provoqué une importante diminution de l'activité enzymatique de hck. Les résultats obtenus ont aussi permis d'identifier plusieurs protéines qui interagissaient spécifiquement avec hck, hck-tr ou les deux isoformes. Bien que certaines de ces protéines soient associées à des structures présentes dans la tête du spermatozoïde, la majorité des candidats identifiés sont retrouvés au niveau du flagelle. Cette étude permettra de mieux comprendre les implications de cette tyrosine kinase dans la phosphorylation en tyrosine observée durant la capacitation, la réaction de l'acrosome et l'hyperactivation du spermatozoïde

Le système olfactif conserve une remarquable capacité à renouveler certaines de ses populations cellulaires tout au long de la vie animale. Les progeniteurs des neurones sensoriels de l'épithélium olfactif sont produits localement, tandis que les précurseurs neuronaux qui donnent naissance aux intemeurones du bulbe olfactif (BO) sont générés dans la zone sous-ventriculaire et doivent migrer une longue distance avant d'atteindre le BO. Dans le BO adulte, ces précurseurs neuronaux se différencient en types neuronaux distincts, incluant les cellules GABAergiques situées dans la couche granulaire et divers groupes de neurones dans la couche glomérulaire, incluant des intemeurones GABAergiques et dopaminergiques, en plus d'autres sous types neuronaux exprimant la calrétinine et la calbindine. Bien que le rôle de l'activité sensorielle dans l'intégration et/ou la survie des cellules nouvellement générées dans le système olfactif soit bien établi, très peu est connu à propos de comment l'activité induite par des odeurs affecte la spécification du phénotype des cellules nouvellement générées, ou le maintient de celui-ci dans les populations neuronales générées chez l'adulte déjà existantes. Pour investiguer la possibilité que l'activité sensorielle puisse jouer un rôle dans ces processus, nous avons effectué une occlusion nasale unilatérale sur des souris adultes avant et après l'intégration de cellules nouvellement générées dans le réseau fonctionnel. Nous démontrons que la privation sensorielle diminue non seulement le nombre de cellules nouvellement générées dans le BO, mais réduit aussi la densité des cellules granulaires et périglomérulaires générées avant l'occlusion nasale. Nous montrons aussi que l'activité sensorielle joue un rôle important dans l' acquisition et le maintient du phénotype dopaminergique, mais pas pour les phénotypes GABAergique, calrétinine+ ou calbindine+. Nos données révèlent que l'activité induite par les odeurs est importante pour la survie des intemeurones bulbaires nouveau-nés ou déjà existants générés à l'âge adulte et suggèrent que ces populations chémospécifiques sont différemment affectées par la privation sensorielle.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste, hautement résistant à une multitude d’antibiotiques qui infecte principalement les patients immunosupprimés. Il représente la cause principale de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (mucoviscidose). Le but principal de ce projet consistait à identifier et à caractériser des gènes essentiels à l’infection et au maintien de P. aeruginosa dans un modèle animal d’infection pulmonaire chronique. À partir d’une banque de mutants transpositionnels, nous avons identifié 148 mutants de P. aeruginosa déficients à causer l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Suite à des analyses bioinformatiques, le mutant inactivant le gène PA5437 a été sélectionné. L’opéron adjacent code pour les sous unités du pyruvate carboxylase (pycA et pycB) et est régulé par le gène PA5437, d’où l’appellation pycR pour pyruvate carboxylase regulator. Le pycR a été identifié comme étant un régulateur transcriptionnel de type LysR ayant une région typique de liaison à l’ADN. Le codon d’initiation de la transcription des gènes pycR et pycA a été identifié par élongation d’amorce. La capacité de liaison de la protéine PycR à l’ADN a été confirmée à l’aide du gel à retardement. L’implication de PycR dans la virulence bactérienne in vivo a été confirmée par indice de compétition et après 7 jours d’infection le mutant déficient ΔpycR est complètement éliminé du poumon du rat. L’importance de PycR a aussi été confirmée in vitro à l’aide des tests phénotypiques et enzymatiques démontrant la déficience dans la production de la lipase, de l’estérase et du biofilm. Finalement, l’analyse des résultats métaboliques et transcriptomiques a confirmé l’importance de PycR dans la régulation du métabolisme de lipides, de l’activité lipolytique, de la respiration anaérobique, de la formation du biofilm et des gènes régulés par le quorum sensing. Dans un second volet, une étude comparative entre souches prototypes (PAO1 et PA14) de P. aeruginosa et un isolat clinique (LESB58) de la fibrose kystique a été réalisée dans un modèle de l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Cette étude a permis d’identifier des différences significatives au niveau de la localisation bactérienne dans les tissus pulmonaires de l’isolat clinique LESB58. D’importantes différences ont également été notées au niveau des facteurs de virulence comme la mobilité et la formation du biofilm. À long terme, les nouvelles connaissances acquises en génomique fonctionnelle devraient permettre d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de combattre et mieux comprendre les infections causées par cette bactérie. / The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is highly resistant to most classes of antibiotics and causes a wide variety of infections in compromised hosts. In addition, it represents the major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. The principal goal of the present research project was to identify and to characterise P. aeruginosa genes essential for causing a chronic lung infection. Using a PCR-based signature-tagged mutagenesis, we identified a P. aeruginosa STM5437 mutant having an insertion into the PA5437 gene; its inactivation causes attenuation of virulence in vivo. The PA5437 gene, now called pycR, regulates the adjacent operon encoding the pyruvate carboxylase subunits (pyruvate carboxylase regulator). PycR has the signature of a putative transcriptional regulator with a predicted helix-turn-helix motif binding to a typical LysR DNA-binding motif identified in the PA5436 (pycA)-PA5437 (pycA) intercistronic region. Transcriptional start sites of pycA and pycR were identified by primer extension and the DNA binding capacity of PycR was confirmed by a DNA mobility gel shift assay. Genome-wide transcriptional profiling indicated that the genes whose control were differentially expressed by PycR implicated genes responsible for lipid metabolism, lipolytic activity, anaerobic respiration, biofilm formation and a number of quorum sensing regulated genes. This study defines PycR as a major regulator in virulence and where mutations in pycR have pleiotropic effects on the expression of multiple virulence factors such as lipase, esterase and biofilm formation. The expressions of several of these genes are associated with chronic lung persistence. In the second part of the study, P. aeruginosa prototype strains PAO1 and PA14 were compared with the CF isolate LESB58 in the rat model of chronic lung infection. This comparative study identified major differences for LESB58; in vivo in bacterial localisation in the rat lung and in vitro for motility and biofilm production. Functional genomics of P. aeruginosa will provide new insights for the development of novel therapeutic targets. Genomic biodiversity may explain the variation in severity of the P. aeruginosa infections in CF disease.

Le déclin développemental de la sensibilité musculaire à 1'insuline est associé à une réduction de l'anabolisme protéique durant la période néonatale. Certaines études montrent que la sensibilité musculaire à l'insuline du métabolisme du glucose est améliorée par l'incorporation d'acides gras n-3 à longue chaîne (20 carbones et plus) dans les membranes musculaires. Le présent mémoire montre qu'un enrichissement des phospholipides membranaires des muscles de 31 % à 186 % en acides gras n-3 à longue chaîne chez les bouvillons en croissance améliore la sensibilité musculaire à l'insuline du métabolisme des acides aminés (+108 %) et du glucose (+37 %). Ceci est accompagné par une activation de la voie de signalisation insulinique initiant la synthèse protéique musculaire concomitante à une réduction des voies oxydatives corporelles (-82 %).

La résistance à l’insuline joue un rôle dans le développement de l’obésité, du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires. Cette étude avait pour but de caractériser les dérèglements vasculaires et métaboliques chez le rat insulino-résistant nourri avec un régime HFHS (high fat high sucrose). La sensibilité à l’insuline, la fonction endothéliale et l’expression de la protéine eNOS (endothelial nitric oxide synthase) ont été étudiées. Les résultats démontrent que le régime HFHS entraînerait une altération de la vasodilatation associée à une réduction de l’expression de eNOS dans les muscles squelettiques et l’aorte thoracique. De plus, une diminution de la biodisponibilité du NO (monoxyde d’azote) a été observée chez les rats HFHS lié à une augmentation des nitrotyrosines et de l’endothéline. Cette étude démontre que la protéine eNOS est importante dans le développement des maladies vasculaires et métaboliques et qu’il existe une interaction gène-environnement dans la régulation du NO. / Insulin resistance (IR) plays a role in the development of obesity, type 2 diabetes and cardiovascular diseases. This study was initiated to characterize vascular and metabolic dysregulations in a rat model with IR fed a high fat high sucrose diet (HFHS). Insulin sensitivity, endothelial function and eNOS (endothelial nitric oxide synthase) gene expression were studied. The results indiquate that the HFHS diet induce an alteration of the vasodilation associated with a reduction of eNOS protein expression in skeletal muscles and thoracic aorta. Also, a reduction of NO (nitric oxide) bioavailability was observed, linked with an augmentation of nitrotyrosine and endothelin. This study show that eNOS is crucial in the development of metabolic and vascular diseases and that there is a geneenvironnement interaction in NO regulation.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / Les réponses cellulaires et moléculaires qui sont mises en place après une lésion de la moelle épinière et des nerfs périphériques diffèrent. Les processus de réparation qui veillent à rétablir l’intégrité tissulaire favorisent la régénération axonale seulement dans le système nerveux périphérique (SNP) lésé. Des inhibiteurs associés aux débris de myéline exerceraient un blocage de la repousse axonale dans le système nerveux central (SNC) lésé. L’objectif de cette étude visait, dans un premier temps, à répertorier et à mesurer l’expression génique des récepteurs connus de ces inhibiteurs dans toutes les régions encéphaliques de la souris avant et à la suite d’une contusion de la moelle épinère. Les résultats démontrent que les expressions des récepteurs NGR1, NGR2 et LINGO-1 sont les plus importantes et disséminées dans tout le cerveau. L’expression du co-récepteur p75NTR est plus restreinte, mais détectable dans certaines voies surpra-spinales, tandis que l’expression de TROY est presque inexistante. L’expression de ces récepteurs ne varie pas suivant un traumatisme de la moelle épinière au niveau thoracique. À l’opposé, les débris de myéline sont rapidement neutralisés par les cellules immunitaires dans le SNP lésé, ouvrant la voie à la régénération axonale. Pour évaluer la corrélation possible entre la régénération axonale et le recrutement des cellules immunitaires, nous avons étudié la repousse des axones du nerf sciatique chez la souris transgénique CD11b-TKmt-30 dans laquelle des traitements au ganciclovir entraînent la mort des cellules myéloïdes, normalement recrutées au site de lésion et dans le segment nerveux distal. Les résultats indiquent qu’en diminuant l’apport en cellules immunitaires myéloïdes (CD11b+), le rétablissement des fonctions sensori-motrices est compromis et associé à une absence de régénération axonale, une accumulation des débris de myéline, une déprivation en neurotrophines et à une déstablilisation de la vasculature et/ou une inhibition de l’angiogénèse. Ainsi, les cellules immunitaires (CD11b+) sont requises pour supporter la régénération axonale par de multiples mécanismes. En contrepartie, les cellules immunitaires ont un accès restreint au SNC ce qui abrogerait la régénération des voies supra-spinales lésées par l’action des inhibiteurs associés à la myéline reconnaissant leur récepteur à la surface des cônes de à croisssance. / The cellular and molecular responses that are activated after spinal cord and peripheral nerve injuries are quite distinct. These processes help restore tissue integrity and facilitate axonal regeneration in the injured peripheral nervous system (PNS). In the injured central nervous system (CNS), axonal regrowth is believed to be prevented by several myelin-associated inhibitors. The goal of this study is to examine and measure mRNA expression for the most studied myelin-associated inhibitors in the brain before and after a spinal cord contusion. Results show that NGR1, NGR2 and LINGO-1 are widely expressed throughout the mouse brain. In contrast, the co-receptor p75NTR is more specifically expressed in neuronal descending pathways from the brainstem, whereas TROY mRNA expression is absent. Notably, expression for these receptors was not modulated after trauma. Because myelin debris are efficiently cleared by immune cells after PNS lesion, axonal regeneration can proceed. To prove the link between axonal regeneration and the recruitment of immune cells, we have studied sciatic nerve regeneration in the CD11b-TKmt-30 transgenic mouse model in which the recruitment of myeloid cells is severely impeded by ganciclovir treatments. Results demonstrate that depletion of myeloid CD11b+ cells leads to severe deficits in recovery of sensory-motor functions that are associated with axonal regeneration failure, myelin debris accumulation, decrease of neurotrophin expression, and vascular destabilization and/or angiogenesis inhibition. Thus, CD11b+ myeloid cells are required to stimulate axonal regeneration via multiple mechanims. These results also suggest that the limited access of immune cells in the injured CNS could be, at least partly, responsible for the lack of regeneration of central axons.

L'objectif du présent projet était d'optimiser le modèle de peau reconstruite par génie tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu'il stimule le processus de régénération nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la racine dorsale de f?tus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été détectée à l'intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le modèle, migration qui a été suivie d'une association étroite des axones et des follicules pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d'étudier les effets de l'épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.