Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-02T13:00:39Z No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-02T20:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / O Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram positiva pertencente ao grupo Bacillus cereus, mas se distingue de outras espécies deste grupo por produzir, durante a esporulação, inclusões cristalinas contendo predominantemente uma ou mais proteínas de ação inseticida (toxinas Cry e Cyt), também chamadas de δ-endotoxinas. Por definição, toxinas Cry exibem toxicidade experimentalmente verificável a um organismo alvo, ou possuem similaridade significativa de sequencia à uma toxina Cry já descrita. A toxicidade de Cry1Ab é amplamente relatada para larvas da mariposa Manduca sexta e estudos indicam que o domínio II é responsável pelo reconhecimento específico dessa toxina ao receptor no intestino do inseto. Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac possuem 82 a 90% de identidade de resíduos de aminoácidos e a interação dessas proteínas com receptores primários do tipo caderina é descrita como um importante passo para a correta remoção da α-hélice 1 no domínio I e subsequente desencadeamento de eventos que levam à morte do inseto. Usando-se de modelagem por homologia e docking molecular, foram selecionados dois modelos descrevendo as interações entre o receptor de M. sexta, BT-R1, e a toxina Cry1Ab. Estes modelos foram submetidos à simulações por dinâmica molecular clássica e avaliados quanto a diversos aspectos de sua estrutura. Um total de 12 blocos de interação foram identificados para cada proteína e estudados quanto às suas propriedade biofísicas, cada qual constituído por uma região da sequência de aminoácidos de suas respectivas proteínas. As medidas de RMSD ao fim da dinâmica mostraram que os sítios de ligação ao receptor apresentam deformações menores que próprio receptor, indicando que a ligação à Cry1Ab estabiliza estas regiões. Mais que isso, os termos intermoleculares de energia de curta distância mostraram um declínio contínuo e uma tendência de atração entre as duas proteínas. Todas as ligações de hidrogênio e pontes salinas foram mapeadas e caracterizadas de acordo com sua persistência e distância média durante a dinâmica. Por último, foi avaliado o potencial eletrostático de cada bloco de interação, o que permitiu inferir as regiões que direcionam a ligação específica da toxina ao receptor. Para validar os modelos, foram sintetizados peptídeos correspondendo a cada bloco de interação para uma análise qualitativa utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Resultados preliminares de um dos modelos mostram que o loop 3, notório por sua função no reconhecimento ao receptor, é capaz de ligar-se a uma região nunca antes relatada dos receptores tipo caderina. Essa nova região possui um perfil de hidropaticidade similar ao do epitopo de um anticorpo específico ao loop 3 e, quando comparamos medidas entre pH 7,4 e pH 9,0 em experimentos de SPR, é possível observar uma ligação de mesma intensidade entre essas duas regiões usando-se 266 vezes menos concentração de analito em pH básico. O pH fisiológico do intestino de M. sexta é aproximadamente 9,0, o que indica que um dos modelos é capaz de reproduzir aspectos da interação in vivo. O prosseguimento deste trabalho, através de técnicas in silico e experimentos in vitro, deve indicar se ambos modelos são plausíveis de ocorrer, ou se um dos modelos é preterido. No geral, esses modelos permitiram observar o comportamento da toxina enquanto ligada ao receptor e contribuem para o entendimento de muitos dos experimentos in vitro realizados envolvendo as toxinas da família Cry1A e os receptores tipo caderina. / Cry1Ab is widely described as toxic to Manduca sexta larvae and extensive substitution of loop residues in domain II suggests that this region is responsible for specific binding to receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac share 82 to 90% amino acid residue identity to one another and their interaction with cadherin-like receptors has been described as an important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I and subsequent events leading to the insect's death. After homology modeling and a selective protein docking, two models describing the interactions of Cry1Ab to the M. sexta cadherin-like receptor, BT-R1, were assessed using molecular dynamics simulations. A total of 12 binding regions were identified for each protein and their biophysical properties were further evaluated. Binding sites in the receptor were shown to have lower RMSD measures than the entire receptor, indicating that the binding of Cry1Ab stabilizes these regions. Also, Van der Waals and Coulomb short-range energy terms were measured for the receptor-toxin complex and showed an attraction tendency, with decreasing energy throughout the entire simulation. All intermolecular hydrogen bonds and salt bridges were identified and characterized according to persistence of existence and mean distances, respectively, as well as their participating residues. Lastly, electrostatic potential for each binding site was assessed, permitting to infer regions that guide specific binding of toxin to receptor. To further investigate the importance of each binding region and validate our model, we synthesized peptides corresponding to each of these regions. Result for one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. This new toxin binding region shows the same hydropathicity profile of an antibody epitope previously described to bind specifically to loop 3. Most interestingly, binding occurs with over 266-fold less peptide concentration in pH 9.0 than in pH 7.4. The physiological pH in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that at least one of the models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Overall, these models allowed the observation of the toxin's behavior when binding to BT-R1 and have helped explain many in vitro experiments concerning Cry1A and cadherin-like receptors.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-21T11:13:33Z No. of bitstreams: 1 arturduquerossi.pdf: 11420528 bytes, checksum: 07d7635a64ff2d13fe27216b526f4f72 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arturduquerossi.pdf: 11420528 bytes, checksum: 07d7635a64ff2d13fe27216b526f4f72 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arturduquerossi.pdf: 11420528 bytes, checksum: 07d7635a64ff2d13fe27216b526f4f72 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / O MHOLline é um workflow científico voltado para a modelagem e análise de proteínas, atendendo a pesquisadores de diversas áreas, como Bioinformática, Biofísica, Químicos Computacionais e Biólogos Computacionais. Este projeto, iniciado em 2004 como um software de uso local, tornou-se um serviço web em 2010, através da parceria da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) com o Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), o qual pode ser acessado pelo endereço web http : //www.mholline . lncc . br. Em 2013, uma parceria com a Universidade Federal de Juiz de Fora deu início ao projeto do MHOLline 2.0, disponível no endereço web http : //www.mholline2 . lncc .br, que conta com adições de softwares, uma interface completamente nova e uma área de refinamento de resultados para usuários logados. A área do refinamento de resultados oferece a possibilidade aos usuários de adicionar ou trocar o molde da proteína modelada, criar restrições de estrutura secundária no Modeller, clivar regiões de peptídeo sinal e otimizar loops no Modeller, tudo de forma automática, dispensando a necessidade do usuário gerar qualquer script manualmente. Caso o usuário deseje é possível refinar a proteína automaticamente, através do uso de ferramentas de inteligência artificial para classificar os resultados gerados com as opções de restrição modeladas, em grupos, visando reduzir o trabalho de analisar os resultados finais do refinamento. Neste trabalho, apresentamos também uma nova proposta para agrupamento de modelos de proteínas baseado em um conjunto de atributos relacionados com a sua qualidade (e.g. energia e estrutural). Ao usuário, além dos grupos de estruturas com qualidades similares, também é retornada a estrutura representativa de cada grupo, com o objetivo de auxiliar na tomada de decisão de qual ou quais modelos seguirão para os próximos estudos. / MHOLline is a scientific workflow designed to model and analyze proteins, reaching researchers in domains of Bioinformatics, Biophysics, Computational Chemists and Computational Biologists. This project started in 2004 as a local software and became a web service in 2010 (available at http : //www .mholline . lncc . br), through the partnership between the Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) and Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC). In 2013, a new partnership with Universidade Federal de Juiz de Fora started the development of MHOLline 2.0, now available at http : //www .mholline2 . lncc . br. This version presents a new interface and a refinement ama to logged users, offering the possibility to add or modify the template of the protein, remove signal peptides and restrict secondary structures and optimize protein loops on Modeller. All can be done in an automatic way, dispensing the user to manually generate any script. The user can also refine the protein automatically trough the use of artificial intelligence tools classifying the generated results with a set of restrictions in groups, aiming to reduce the effort to analyze the final refinement results. In this work, we also present a new proposal for clustering protein models based on a set of attributes related to their quality (i.e., energy and structural quality). To the user, in addition to the groups of structures with similar qualities, is also returned the representative structure of each group, in order to assist in the decision making of which model or models will follow for the future studies.

Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: A suinocultura vem alcançando grande desenvolvimento de técnicas eficientes associadas ao melhoramento genético, nutrição, manejo e sanidade. Entretanto, devido aos métodos intensivos de criação, os suínos se tornaram mais susceptíveis a um grande número de doenças infecciosas. Entre os mais importantes patógenos que afetam a indústria suinícola mundial está o circovírus suíno 2 (PCV2), um pequeno vírus icosaédrico, não-envelopado, de DNA circular, de fita simples (ssDNA), ambisenso, composta por 1767-1768 nucleotídeos. Este vírus é altamente resistente a variações ambientais e agentes desinfetantes, é endêmico no mundo todo e está associado a várias manifestações clínicas distintas, que acarretam importantes perdas econômicas aos produtores. Um dos fatores possivelmente implicados na patogenicidade do PCV2 é a proteína Cap, a unidade fundamental constituinte do capsídeo deste vírus. Estudos realizados pela equipe do Prof. Dr. João Pessoa Araújo Jr., do Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, comprovaram que vírus com mutações em suas proteínas Cap isolados a partir de cultivo celular aumentavam a morte celular em culturas celulares infectadas. Estes resultados evidenciaram a importância do capsídeo nos mecanismos de infecção e patogenicidade do PCV2, tornando interessante a realização de estudos estruturais com as proteínas Cap mutantes. A execução de estudos estruturais in silico mostrou a baixa frequência das mutações identificadas na proteína Cap dos vírus pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Swine breeding has achieved a high development based on genetic improvement, nutrition, management and sanity. However, due to the intensive breeding methods, swine have become more susceptible to a higher number of infectious diseases. Among the most important pathogens that affect the swine world industry is the porcine circovirus 2 (PCV2), a small, icosahedral, non-enveloped virus, ambisense single-stranded circular DNA, composed by 1,767-1,768 nucleotides. This virus is highly resistant to environmental variations and disinfecting agents, endemic worldwide and has been associated to several distinct clinical manifestations that entail important economic losses to the producers. One of the factors possibly implicated on the PCV2 pathogenicity is the Cap protein, the fundamental unity that constitutes this virus capsid. Studies performed by the group of Dr. João Pessoa Araújo Jr. rom the Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, confirmed that viruses with mutated Cap proteins from cell culture increased cell death in infected cultures. Such results highlight the importance of capsid in the infection mechanisms and pathogenicity of PCV2 and the importance of structural and comparative studies with Cap protein structures. In silico structural studies showed the low frequency of the mutations identified in the mutant Cap proteins and also indicated a clear difference between the physico-chemical properties of the new amino acid residues in comparison to those found ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Pâmela Merlo Marson (pam.marson@aluno.ibb.unesp.br) on 2018-06-05T17:11:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado_Pamela-Merlo-Marson_2018_vf.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-06-07T14:10:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marson_pm_me_bot.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T14:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marson_pm_me_bot.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A suinocultura vem alcançando grande desenvolvimento de técnicas eficientes associadas ao melhoramento genético, nutrição, manejo e sanidade. Entretanto, devido aos métodos intensivos de criação, os suínos se tornaram mais susceptíveis a um grande número de doenças infecciosas. Entre os mais importantes patógenos que afetam a indústria suinícola mundial está o circovírus suíno 2 (PCV2), um pequeno vírus icosaédrico, não-envelopado, de DNA circular, de fita simples (ssDNA), ambisenso, composta por 1767-1768 nucleotídeos. Este vírus é altamente resistente a variações ambientais e agentes desinfetantes, é endêmico no mundo todo e está associado a várias manifestações clínicas distintas, que acarretam importantes perdas econômicas aos produtores. Um dos fatores possivelmente implicados na patogenicidade do PCV2 é a proteína Cap, a unidade fundamental constituinte do capsídeo deste vírus. Estudos realizados pela equipe do Prof. Dr. João Pessoa Araújo Jr., do Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, comprovaram que vírus com mutações em suas proteínas Cap isolados a partir de cultivo celular aumentavam a morte celular em culturas celulares infectadas. Estes resultados evidenciaram a importância do capsídeo nos mecanismos de infecção e patogenicidade do PCV2, tornando interessante a realização de estudos estruturais com as proteínas Cap mutantes. A execução de estudos estruturais in silico mostrou a baixa frequência das mutações identificadas na proteína Cap dos vírus provenientes do cultivo in vitro e também indicou uma clara diferença entre as propriedades físico-químicas dos novos resíduos de aminoácidos em relação àqueles substituídos. Estas alterações, associadas à localização dos resíduos na superfície viral e a menor flexibilidade das proteínas Cap dos vírus mutantes, indicaram a possibilidade de alterações estruturais/funcionais relevantes, incluindo a alteração da afinidade por receptores celulares e diminuição da efetividade de anticorpos produzidos contra vírus vacinais. Foram também realizados trabalhos experimentais para a produção heteróloga da proteína Cap de um vírus selvagem, os quais envolveram ensaios de subclonagem da sequência de interesse em um vetor de expressão, testes de transcrição e experimentos de expressão protéica. Os resultados destes procedimentos foram compatíveis com a produção da proteína Cap, porém novos estudos são necessários para confirmar a produção da molécula alvo e melhorar o rendimento dos ensaios de expressão. / Swine breeding has achieved a high development based on genetic improvement, nutrition, management and sanity. However, due to the intensive breeding methods, swine have become more susceptible to a higher number of infectious diseases. Among the most important pathogens that affect the swine world industry is the porcine circovirus 2 (PCV2), a small, icosahedral, non-enveloped virus, ambisense single-stranded circular DNA, composed by 1,767-1,768 nucleotides. This virus is highly resistant to environmental variations and disinfecting agents, endemic worldwide and has been associated to several distinct clinical manifestations that entail important economic losses to the producers. One of the factors possibly implicated on the PCV2 pathogenicity is the Cap protein, the fundamental unity that constitutes this virus capsid. Studies performed by the group of Dr. João Pessoa Araújo Jr. rom the Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, confirmed that viruses with mutated Cap proteins from cell culture increased cell death in infected cultures. Such results highlight the importance of capsid in the infection mechanisms and pathogenicity of PCV2 and the importance of structural and comparative studies with Cap protein structures. In silico structural studies showed the low frequency of the mutations identified in the mutant Cap proteins and also indicated a clear difference between the physico-chemical properties of the new amino acid residues in comparison to those found in the wild-type virus. These mutations, associated with the location of the mutated residues on the viral surface and the lower mutated Cap protein flexibility, could lead to relevant structural/functional changes, including alteration of affinity for cellular receptors and decreased effectiveness of antibodies produced against vaccine viruses. Experimental works aiming the heterologous production of a wild-type Cap protein were also carried out, which involved expression vector subcloning, transcription tests and protein expression experiments. The results of these procedures were compatible with the production of the Cap protein, but further studies are needed to confirm the production of the target molecule and improve the yield of the expression assays.