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Le maintien de la connectivité à travers les paysages urbains, par nature très fragmentés, est un enjeu majeur de conservation de la biodiversité urbaine. On observe une prise en compte croissante de la connectivité dans les politiques d’aménagement du territoire, notamment avec l’établissement de la trame verte et bleue. De multiples outils cartographiques permettent de mettre en évidence les continuités écologiques (zones de forte connectivité), mais leur validation fonctionnelle fait souvent défaut. L’objectif de cette thèse est de valider les prédictions d’un modèle de chemin de moindre coût, sur plusieurs villes et avec différents modèles biologiques. Les espèces étudiées présentent différents modes et capacités de dispersion (vol, marche, reptation) et des exigences écologiques spécifiques (préférences pour les milieux herbacés ou boisés). Des protocoles de validation basés sur l’écologie du mouvement et la génétique du paysage sont appliqués, dans un souci de réplication (au sein de plusieurs villes) et de contrôle de la variabilité inter-individuelle. Nos résultats montrent des mouvements accrus au sein des continuités écologiques comparés à ceux observés en contextes paysagers prédits comme non connectés : les hérissons transloqués s’y déplacent sur des distances plus longues, plusieurs passereaux répondent à la repasse de chant sur de plus longues distances et les papillons de nuit montrent des taux de recapture beaucoup plus élevés. Par ailleurs, les analyses indirectes réalisées sur l’escargot petit-gris montrent une relation assez faible entre la différenciation génétique des populations et les modèles de connectivité. Ce travail fournit des arguments scientifiques pour soutenir la mise en place de continuités écologiques en milieu urbain. / Maintaining connectivity across urban landscape, intrinsically fragmented, is a major issue of urban biodiversity conservation. Connectivity is increasingly taken into account by policy and stakeholders, especially through the establishment of the blue-green infrastructure. Multiple mapping tools allow to detect ecological networks (highly connected areas), however their functionnal validation is often lacking. The objective of this study is to validate least cost path analysis predictions in several cities with different biological models. Studied species vary in terms of dispersal means and capacities (flight, walk, crawling) and habitat requirement (e.g. herbaceous or forested habitats). Several protocols based on movement ecology and landscape genetic are applied, focusing on replication (within and among cities) and control of inter-individual variability. Our results indicate that movement is increased in predicted ecological networks when compared with areas predicted as poorly connected: the translocated hedgehogs travelled longer distances, several passerine responded to song playback over longer distances, and moths showed increased recapture rates. Indirect analysis on the garden snail showed a weak relation between population genetic differentiation and connectivity models. This work provides scientific support for the establishment of ecological networks in urban landscapes.