Einleitung Fokale Gelenkknorpeldefekte treten in der Deutschen Bevölkerung mit einer geschätzten Inzidenz von über 300 000 jährlichen Fällen auf. In der US-amerikanischen Bevölkerung wird jährlich von über 600 000 Fällen ausgegangen. Aufgrund der Insuffizienz körpereigener Heilungskapazitäten und verfügbarer Therapieverfahren, schreitet die Erkrankung regelhaft zur post-traumatischen Arthrose fort. Neben der individuellen Lebensqualitätseinschränkung besteht eine sozioökonomische Bedeutung mit geschätzten Krankheitskosten von jährlich über 10 Milliarden US Dollar in den Vereinigten Staaten. Das Versagen zellbasierter Therapieverfahren beruht unter anderem auf einer Insuffizienz der chondrogenen Differenzierung, sowie der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten mit nachfolgender Osteogenese analog den Vorgängen in der Wachstumsfuge. Für die Induktion der chondrogenen Differenzierung stehen insbesondere Mitglieder der TGF-β Superfamilie, wie BMP-2, zur Verfügung. Diese sind jedoch ebenso durch eine Induktion der hypertrophen Differenzierung gekennzeichnet. Zur Induktion der Chondrogenese unter Umgehung der TGF-β-Signalwege wurde IHH in-vitro als vielversprechend beschrieben. Bislang besteht jedoch kein Nachweis der in-vivo Effektivität von IHH zur Knorpelreparation. Die Schaffung eines Wachstumsfaktor-Milieus in der Gelenkknorpelläsion in-vivo stellt ebenso eine Herausforderung dar. Diesbezüglich wurde ein vereinfachtes Verfahren zum lokalisierten in-vivo Gentransfer mittels adenoviraler Vektoren und autologen Knochenmarkskoagulaten anhand von Markergenen beschrieben. Die Effektivität jenes Verfahrens zur in-vivo Knorpelreparation wurde noch nicht gezeigt. Zweck dieses kontrollierten in-vivo Experimentes ist es, mittels des oben genannten Gentransferverfahrens die Wirksamkeit von BMP-2 und IHH zur Reparation von osteochondralen Defekten in New Zealand White Rabbits nachzuweisen. Die zentrale Hypothese lautete, dass BMP2 beziehungsweise IHH Gentransfer in einer höheren langzeit-histologischen Qualität des Reparationsgewebes resultiert. Explorativ sollten dabei Unterschiede in den einzelnen Dimensionen der Gewebequalität anhand des ICRS-II Histology Scoring Systems, sowie der Grad der Typ I (als Faserknorpelmarker), Typ II (als Marker hyalinen Gelenkknorpels) und Typ X Kollagen Deposition (als Marker hypertropher Chondrozyten) beschrieben werden. Material und Methoden Als Tiermodel wurden bilaterale 3,2 mm durchmessende osteochondrale Bohrlochdefekte in der Trochlea von New Zealand White Rabbits verwendet (n=10 unabhängige Tiere, 20 Gelenke). Die Defekte wurden mit autologen Knochenmarkkoageln gefüllt, die nach vorheriger Beckenkammaspiration gewonnen wurden. In den experimentellen Gruppen wurden die Knochenmarkkoagel beladen mit jeweils 1 x 1011 infektiösen Partikeln adenoviraler Vektoren, die cDNA codierend für BMP2 (n=3 Tiere, entsprechend 6 Gelenken) oder IHH (n=4; 8) enthielten. In der Kontrollgruppe wurde das nicht-chondrogene Markergen GFP (n=3; 6) transferiert. Beide Gelenke eines Tieres wurden der gleichen Gruppe zugeordnet. Die histologische Gewebequalität wurde nach 13 Wochen anhand des ICRS-II Scoringsystems durch 3 unabhängige, verblindete Untersucher bewertet. Als primäre Outcomes wurden der ICRS-II Parameter „Generelles Assessment“, sowie die Typ II Kollagen positive Fläche designiert. Als explorative Outcomes wurden die verbleibenden ICRS-II Parameter, sowie die Typ I und Typ X Kollagen Deposition bewertet. Die Korrelation zwischen den Untersuchern wurde nach Pearson ermittelt. Zum Test auf Signifikanz der Gruppenunterschiede wurde ein lineares gemischtes Modell verwendet, welches einer mögliche Abhängigkeit beider Gelenke eines Tieres Rechnung trägt. Ergebnisse Qualitative Bewertung des Reparationsknorpels. Dreizehn Wochen nach der Intervention zeigten die meisten der BMP-2 behandelten Gelenke (4 von 6) und alle der IHH behandelten Gelenke (8 von 8) hyalin-artigen Reparationsknorpel, während alle GFP behandelten Kontrollgelenke (6 von 6) faserknorpel-artiges Reparationsgewebe zeigten. Zwei BMP-2 behandelten Gelenke zeigten eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation. Primäre Outcomes - ICRS-II „Generelles Assessment“ und Typ II Kollagen positive Fläche. IHH und BMP-2 behandelte Gelenke zeigten im Vergleich zu GFP höhere Punktzahlen in dem ICRS-II „Generelles Assessment“ Parameter: +33.0 (95% Konfidenzintervall: -0.4, +66.4) Punkte für IHH und +8.5 (-26.6, +43.7) Punkte für BMP-2. Beide Effekte erreichten nicht das Level statistischer Signifikanz (p=0.052 und 0.537). IHH erhöhte die Typ II Kollagen Deposition in der Defektregion, während BMP-2 Gelenke keinen Unterschied zu GFP Kontrollen zeigten: +18.7 (-4.5, +42.0) Punkte für IHH und +0.0 (-29.7, +29.8) Punkte für BMP-2. Die erhöhte Typ II Kollagendeposition erreichte nicht das konventionelle Level statistischer Signifikanz (p=0.093). Sekundäre Outcomes - ICRS-II Parameter. In dem Vergleich von BMP-2 mit GFP Kontrollen wurde in keinem der 12 untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied festgestellt. IHH Gentransfer resultierte hingegen in höheren Punktzahlen in allen untersuchten Parametern, wobei der Unterschied in 5 der 12 Parameter das Niveau statistischer Signifikanz erreichte. Ein um 21.5 Punkte (+3.6, +39.4) erhöhter Score wurde für den Parameter „Gewebemorphologie“ beobachtet, sowie +21.0 (+6.4, +35.7) für „Chondrozytäres Clustering“, +31.2 (+0.8, +61.5) für „Formation der Tidemark“, +17.3 (+0.2, +34.5) für „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und +35.0 (+4.6, +65.2) für das „Assessment der mittleren und tiefen Zone“. Sekundäre Outcomes - Marker chondrozytärer Hypertrophie. Eine perizelluläre Deposition von Typ X Kollagen wurde in allen Gruppen beobachtet. Eine deutlich gesteigerte Deposition wurde nur in den Gelenken beobachtet, die nach BMP2 Gentransfer eine ausgeprägte intraläsionale Knochenformation zeigten. Diskussion Das hier beschriebene Experiment stellt die erste Veröffentlichung der Wirksamkeit von IHH zur Verbesserung der histologischen Knorpelqualität von in-vivo therapierten Gelenkknorpeldefekten dar [175]. Die Hypothese, dass IHH zu einer verbesserten histologischen Knorpelqualität führt wurde bestätigt, während die Hypothese zu den positiven Effekten von BMP-2 wiederlegt wurde. IHH führte zu besseren Ergebnissen in allen Untersuchten Parametern, das Niveau statistischer Signifikanz wurde dabei in den Parametern „Gewebemorphologie“, „Chondrozytäres Clustering“, „Formation der Tidemark“, „Abnorme Kalzifikation/Ossifikation“ und „Assessment der mittleren und tiefen Zone“ erreicht. Das primäre Ziel dieses Experimentes war es, den „Proof of concept“ zu liefern, dass IHH auch in-vivo ein attraktiver Faktor für die Induktion der Chondrogenese darstellt. Das langfristige Ziel ist die Induktion der Chondrogenese unter Umgehung des TGF-β Signalweges zu erzielen, um eine folgende hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und die folgende Ossifikation des reparierten Defektes zu verhindern. Die Limitationen der Studie umfassen die ausschließlich histologische und immunhistochemische durchgeführte Bewertung der Knorpelqualität und eine eingeschränkte statistische Power. Ob IHH es vermag die hypertrophe Differenzierung zu umgehen und somit eine langfristige hyaline Knorpelreparation zu ermöglichen, ist in weiteren präklinischen Studien mit biochemischer und molekulargenetischer Analyse der Hypertrophie-Marker zu untersuchen. In Bezug auf den klinischen Einsatz zur Knorpelreparation erscheint der Einsatz der Wachstumsfaktoren als Protein auf funktionalisierten Matrices vielversprechend. BMP-2 wird aufgrund der hier beobachteten intraläsionalen Knochenformation nach BMP2 Gentransfer als nicht geeignet zur Unterstützung der Knorpelreparation in-vivo bewertet. / Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2, encoded by BMP2) and Indian hedgehog protein (IHH, encoded by IHH) are well known regulators of chondrogenesis and chondrogenic hypertrophy. Despite being a potent chondrogenic factor BMP-2 was observed to induce chondrocyte hypertrophy in osteoarthritis (OA), growth plate cartilage and adult mesenchymal stem cells (MSCs). IHH might induce chondrogenic differentiation through different intracellular signalling pathways without inducing subsequent chondrocyte hypertrophy. The primary objective of this study is to test the efficacy of direct BMP2 and IHH gene delivery via bone marrow coagulates to influence histological repair cartilage quality in vivo. Vector-laden autologous bone marrow coagulates with 10^11 adenoviral vector particles encoding BMP2, IHH or the Green fluorescent protein (GFP) were delivered to 3.2 mm osteochondral defects in the trochlea of rabbit knees. After 13 weeks the histological repair cartilage quality was assessed using the International Cartilage Repair Society (ICRS) II scoring system and the type II collagen positive area. IHH treatment resulted in superior histological repair cartilage quality than GFP controls in all of the assessed parameters (with P < 0.05 in five of 14 assessed parameters). Results of BMP2 treatment varied substantially, including severe intralesional bone formation in two of six joints after 13 weeks. In conclusion, IHH gene transfer is effective to improve repair cartilage quality in vivo, whereas BMP2 treatment, carried the risk intralesional bone formation. Therefore IHH protein can be considered as an attractive alternative candidate growth factor for further preclinical research and development towards improved treatments for articular cartilage defects.

The transforming growth factor (TGF)-β superfamily mediates a wide range of differentiation and developmental processes across many genera. GDF9 and BMP15 are expressed exclusively in the mammalian ovary and are the only TGF-β ligands that lack the conserved cysteine residue used for dimerisation. As a platform for studying the interactions between GDF9 and BMP15 and their receptors, BMPRII and BMPRIb, a variety of strategies were attempted to produce soluble and active proteins from recombinant systems. Both ligands and receptors showed a tendency to form insoluble aggregates when expressed in prokaryotic systems; however after extensive screening, quantities of biologically active GDF9 were produced using in vitro refolding. When expressed alone, either containing a histidine tag or as an untagged protein, the BMPRII ectodomain was deposited as insoluble inclusion bodies. This protein, subjected to in vitro refolding procedures, exhibited multiple species following anion exchange chromatography and size exclusion chromatography, as visualised on native PAGE. Separation of these species could be achieved using a MonoP matrix. One of these separated fractions, representing about 5% of the starting material, was amenable to crystallisation, and furthermore exhibited activity in a rat granulosa cell thymidine incorporation assay. Two different crystals forms of the extracellular domain of BMPRII were grown from the same protein batch under similar crystallisation conditions. Notably, the tetragonal form that grew more slowly possessed several disordered finger regions, while electron density for the entire molecule was clear in the orthorhombic form. The hydrophobic core of the ligand binding surface of BMPRII , as seen in both structures, resembles that of ActRII bound to BMP2. The A-loop of BMPRII, which is involved in ligand binding, lies in two different conformations in the two structures of BMPRII, mediated by a rearrangement in disulfide Cys94-Cys117. It is proposed here that the tetragonal form represents the ligand-bound receptor structure. Although the majority of the hydrophobic binding surface is shared with ActRII(b), it is likely that His87 and Tyr40 are unique residues that confer specificity in BMPRII ligand binding.

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名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(課程) 学位授与年月日:平成6年3月25日 服部宇氏の博士論文として提出された

Thesis (M. Med. Sc.)--University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 71-84).

During development of the nervous system, signals from specialized organizing centers generate distinct cell types. The signaling molecule, Sonic Hedgehog (SHH) is expressed by the floor plate (FP) and is sufficient to specify the ventral midbrain pattern. In the spinal cord, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) expressed in the roof plate (RP) specify dorsal cell-fates. The attenuation of BMP signaling is required for SHHmediated patterning of the ventral hindbrain and spinal cord, while BMP signaling is required in conjunction with SHH for ventral forebrain patterning. This thesis will focus on the function of SHH and BMPs in the midbrain by examining the molecules ability to pattern and regulate development. Midbrains of Shh[superscript -/-] mice were examined. Some ventral cell fates are specified in the Shh[superscript -/-] mouse in a Ptc1 and Gli1 independent manner. Ventral midbrain induction was observed to be Hh-independent by the existence of a Pax7-negative ventral midbrain territory before embryonic day 9. Interestingly, dorsal markers are not uniformly altered and increased cell death was seen in Shh[superscript -/-] dorsal midbrains. These results suggest specific regulation of dorsal patterning by Shh, rather than a simple deregulation. Several BMPs and their antagonists are expressed in a spatial and temporal manner in the midbrain. Expression of BMPs is seen in the RP, and rostral FP (rFP), which also expresses SHH. BMP signaling was manipulated using in vivo electroporation. NOGGIN misexpression resulted in a loss of RP and a reduction of dorsal cell-fates that was preceded by cell-shape changes, delamination of cells into the lumen and their elimination. This was accompanied by a reduction and alteration of midbrain size and shape. BMP blockade changed N-Cadherin distribution and perturbed pseudostratified morphology of the neurepithelium. Ventrally, BMP blockade resulted in a decrease of proliferation, while increasing differentiation, Notch signaling molecules at the rFP and medial FP markers. However ventral midbrain cell-fates were correctly specified. Notch-Delta signaling was examined in the Mib[superscript -/-] mouse. Different regulation of cell-fates was observed in the midbrain and spinal cord. Mib[superscript -/-] midbrains lacked a mature lateral FP, however ventral cell-fates are specified. Mib[superscript -/-] spinal cords lose Shh expression and several ventral cell-fates. / text

Adipositas gehört zu den häufigsten Stoffwechselkrankheiten. Zur Basistherapie der Adipositas gehören eine gesunde Ernährungsweise und die Erhöhung der körperlichen Aktivität mit dem Ziel der Gewichtsreduktion. Körperliches Training führt neben der Verbesserung der Leistungsfähigkeit zu einer Reihe metabolischer Veränderungen, wie zur Reduktion der Fettmasse, zu Verbesserungen von chronischer Hyperglykämie, des Lipidstoffwechsels und des atherogenen, pro-inflammatorischen Adipokin-Serumprofils. Bone morphogenetic proteins (BMPs) werden auch im Fettgewebe produziert und spielen eine wichtige Rolle in der Adipogenese und Transdifferenzierung von Adipozyten. Vor kurzem wurde ein Zusammenhang zwischen der BMP-7 Serumkonzentration und Adipositas postuliert. Allerdings ist bisher nicht bekannt, ob eine Gewichtsreduktion mit Veränderungen der BMP-7 Serumkonzentration assoziiert ist. Ziel dieser Arbeit war es deshalb zu untersuchen, ob die Serumkonzentration von BMP-7 im Zusammenhang mit Körpergewicht, Fettverteilungsmuster, Parametern des Glukosestoffwechsels und der Insulinsensitivität bei Patienten mit Adipositas und Typ 2 Diabetes (n=213) stehen. Im Rahmen von zwei Interventionsstudien mit dem Ziel der Gewichtsreduktion wurde der Einfluss einer hypokalorischen Ernährungsweise mit zusätzlichem körperlichen Training über 6 Monate (n=19) sowie 6 Monaten nach einer bariatrischen Operation (n=14) auf die BMP-7 Serumkonzentration untersucht. Zusätzlich wurde die BMP-7-mRNA Expression im humanen omentalen und subkutanen Fettgewebe von 233 Patienten im Rahmen einer unabhängigen Querschnittstudie charakterisiert. Die BMP-7 Serumkonzentration ist unabhängig von Alter und Geschlecht, korreliert signifikant mit den nüchtern Insulin, C-Peptid und Glukose Serumkonzentrationen, mit der SFRP5-Konzentration bei Probanden ohne Typ2 Diabetes mellitus, signifikant negativ mit den Serumkonzentrationen von Gesamteiweiß, Chemerin, freien Fettsäuren (bei Männern), und DLK-1 (bei Frauen). Bei Patienten mit Typ 2 Diabetes zeigte sich eine negative Korrelation zwischen der BMP-7-Serumkonzentration und ALAT. Die BMP-7 mRNA Expression ist im viszeralen Fettgewebe signifikant höher als im subkutanen Fettgewebe. Sowohl eine moderate Gewichtsreduktion von 8,8±6,5kg [2,0-26,6kg] durch kalorienreduzierte Ernährung als auch ein Gewichtsverlust von 45,3±7,4kg 6 Monate nach bariatrischer Chirurgie führten nicht zu einer signifikanten Veränderung der zirkulierenden BMP-7 Spiegel. Zusammengefasst zeigten die Querschnitts- und Interventionsstudien, dass erhöhte BMP-7- Serumkonzentrationen mit Hyperinsulinämie assoziiert sind, aber durch Gewichtsreduktion und Erhöhung der körperlichen Aktivität nicht signifikant beeinflusst werden können. Die erhöhte BMP-7-Expression im viszeralen Fettgewebe könnte eine intrinsische Besonderheit dieses Fettdepots sein und zur viszeralen Fehlverteilung des Fettgewebes bei Adipositas beitragen.

M. Tech. Pharmaceutical Sciences. / Xenogeneic collagen has previously been reported to be a poor delivery system for bone morphogenetic proteins, because of its immunogenic effects in the host. In the laboratory the researcher uses, the problems associated with the xenogeneic bone matrix has been overcome by chemical swelling employing acetic acid followed by pepsin digestion to reduce telopeptides. This has improved host biocompatibility. The central focus of the current study was to improve the performance of the previously developed delivery system by employing a combination of BMP-2 and TGF-ß1 in a rat heterotopic assay.

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Recombinant human bone morphogenetic proteins (rhBMPs) are increasingly used for reconstructing bony defects, fracture non-unions, and augmenting existing bone volumes. For the numerous patients taking bisphosphonates, the impact of prior bisphosphonate treatment on rhBMP bone induction is not well understood. Objective: to evaluate the effect of the prior treatment with zoledronate on rhBMP induced bone formation in mice. Methods: 42 mice were pre-treated with 0, 2, and 20 µg of zoledronate/mouse. The osteoinductive activity of a bioimplant, containing rhBMP-2, was assessed using the mouse muscle pouch assay, and analyzed with micro CT and histology. Results: micro CT demonstrated that BMP bioimplants placed in mice pretreated with 20 µg of zoledronate, formed bony ossicles of greater volume but reduced bone density compared to controls. Histologically, the heterotopic ossicles from the 20 µg group consisted of more immature bone than those from the other groups. Conclusion: bone induced by rhBMP-2 in mice pre-treated with a high concentration of zoledronate was immature as evidenced by radiographic and histologic appearance.