Submitted by Jaqueline Duarte (1157279@mackenzie.br) on 2018-09-21T23:21:36Z No. of bitstreams: 2 Fernanda Teixeira Ribeiro.pdf: 553125 bytes, checksum: 72d8392b5a2dde2d66da9028ebe4e3bd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Paola Damato (repositorio@mackenzie.br) on 2018-10-17T18:12:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Fernanda Teixeira Ribeiro.pdf: 553125 bytes, checksum: 72d8392b5a2dde2d66da9028ebe4e3bd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-17T18:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Fernanda Teixeira Ribeiro.pdf: 553125 bytes, checksum: 72d8392b5a2dde2d66da9028ebe4e3bd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rats exposed to neonatal seizures are a model for study brain circuits that underlies social impairment symptoms of Autism Spectrum Disorder (ASD). Animals submitted to status epilepticus neonatal (SE) - a single long-term seizure induced by pharmacological agent - show a lack of interest for social novelty and social discrimination deficit. We used this animal model for ASD to investigate a possible role of endocannabinoid system in ASD etiology, beased on evidences that comprove the role of endocannabinoids in multiple processes, as epileptic seizures supression and emotion regulation. Male Wistar rats were submitted to SE in ninenth day of life (P9) by pilocarpine injection (380 mg/kg, i.p.) - control animals received saline 0,9% (0,1 mL/ 10g). In P60 both groups were injected with JZL195 (0,01 mg/kg, i.p.) - inhibidor of FAAH and MAGL, enzimes that catalise endogenous cannabinoids agonists. After two hours, animals were submitted to behavioral tests that evaluated social memory, interest for social novelty and short-term memory (objects recognition test). Neurobiological correlation for the behavioral results was investigated by genic expression analysis of CNR1 gene (RT-PCR) and quantification of CB1 receptor (ELISA). Results of social memory test show a deficit of social investigation in control rats treated with JZL (F(1,18)=5,481; p=0,03), without affect social discrimination (F(1,18)=9,807; p=0,0058); there was no effect of JZL in experimental group (F(1,17)=2,509; n.s.). In social novelty test, JZL affected the investigation time in control group (F(1,19)=4,863; p=0,04) and the preference for investigating social novelty (t(20)=3,356; p<0,01); JZL had no effect on experimental group (F(1,19)=0,001; n.s.). In the test of objects recognition, JZL caused object discrimination deficit in control group (F(1,13)=4,955; p=0,04) and affected time investigation in experimental group (F(1,11)=5,999; p=0,03), without affect in discrimination (F(1,11)=0,860; n.s.). The analysis of total locomotion in open field showed that JZL caused hyperlocomotion specifically in control animals (F(1,24)=4,837; p=0,03); analysis of central locomotion showed that JZL affected both groups, reducing time spent in central area (F(1,24)=4,547; p=0,04). Genic expression analysis of CNR1 gene did not present any difference in mRNA expression in hippocampus, pre-frontal cortex, striatum and amygdala. CB1 quantification presented a difference in hippocampus of experimental animals (U=2000; p=0,03). Our results reinforce the idea that the animal model of rats exposed to neonatal SE is valid and relevant to the study of social motivation, compromised in ASD. Pharmacological interventions targeting CB1 receptors are a way to explore this circuitry, given the results of our behavioral tests (with specific impairment of controls on social memory and sociability tests) and the molecular differences identified in the hippocampus of experimental group. Our results suggest that the endocannabinoid system participates in the modulation of social behavior and that there is a neurobiological alteration of this circuit in ASD. / Animais expostos a status epilepticus (SE) neonatal são um modelo promissor para o estudo de sistemas cerebrais específicos envolvidos no prejuízo do comportamento social que caracteriza o transtorno do espectro autista (TEA). Animais submetidos a SE neonatal mostram, na vida adulta, comportamentos característicos do TEA, como redução do interesse por interação com novidade social, apesar de manterem funções cognitivas preservadas. Este trabalho utiliza o modelo animal submetido a SE neonatal para investigar a participação do sistema endocanabinoide na neurobiologia do TEA, considerando as evidências sobre o envolvimento desse sistema na modulação da sociabilidade. Ratos Wistar machos foram submetidos ao SE no nono dia de vida (P9) por administração intraperitoneal de pilocarpina (380 mg/kg, i.p.) - enquanto controles receberam salina 0,9% (0,1 ml/ 10g). Em P60 os animais adultos de ambos os grupos foram subdivididos em: administrados com salina 0,9% ou com o fármaco JZL195 (0,01 mg/kg, i.p.), inibidor de enzimas catalisadoras da hidrólise de endocanabinoides, agonistas endógenos dos receptores canabinoides (CB1). Após 2 horas, os animais foram avaliados em testes comportamentais de memória social, sociabilidade e memória de curto prazo. Ao fim dos testes, foram extraídos tecidos de estruturas da via mesocorticolímbica: hipocampo, córtex pré-frontal, estriado e amígdala. O material extraído foi utilizado para análise da expressão gênica do gene CNR1 (por RT-PCR) e quantificação de receptores CB1 (por ELISA). No teste de memória social, animais controle tratados com JZL, quando apresentados à novidade social, mostraram menos interesse em investigar a novidade social (F(1,18)=5,481; p=0,03), sem prejuízo da capacidade de discriminação (F(1,18)=9,807; p=0,0058); animais experimentais tratados com JZL não apresentaram diferença significativa no tempo de investigação da novidade social (F(1,17)=2,509; n.s.). O tratamento com JZL interferiu especificamente no tempo de investigação do grupo controle em todas as sessões (F(1,175)=0,6686; p<0,0001). No teste de sociabilidade, o tratamento com JZL reduziu o tempo de investigação dos animais controle (F (1,19)=4,863; p=0,04) e afetou a preferência por novidade social (t(20)=3,356; p<0,01); o JZL não afetou o tempo de investigação dos animais experimentais (F (1,19)=0,001; n.s.). No teste de reconhecimento de objetos, o tratamento com JZL afetou a memória de curto prazo de animais controle (F(1,13)=4,955; p=0,04), que não discriminaram o objeto, e reduziu o tempo de investigação nos animais experimentais (F(1,11)=5,999; p=0,03), sem afetar a discriminação (F(1,11)=0,860; n.s.). No teste de locomoção, o tratamento com JZL aumentou especificamente a locomoção total de animais controles (F(1,24)=4,837; p=0,03), não afetando de forma significativa os animais experimentais (F(1,24)=0,341; n.s.). Quanto à locomoção na zona central, o fármaco interferiu em ambos os grupos, reduzindo a permanência nas áreas centrais (F(1,24)=4,547; p=0,04). A PCR-RT não indicou diferença na expressão do RNAm do receptor CB1 nas estruturas analisadas. A quantificação por Elisa apontou menor concentração de CB1 no hipocampo de experimentais (U=2000; p=0,03). Nossos resultados reforçam a ideia de que o modelo animal de ratos expostos a SE neonatal é válido e relevante para estudo da motivação social, comprometida no TEA. Intervenções farmacológicas tendo como alvo os receptores CB1 podem ser um caminho para explorar essa circuitaria, tendo em vista os resultados de nossos testes comportamentais (com prejuízo específico dos controles nos testes de memória social e sociabilidade) e as alterações moleculares identificadas no hipocampo de experimentais. Nossos resultados sugerem que o sistema endocanabinoide participa da modulação de comportamento social e que existe alteração neurobiológica dessa circuitaria no TEA.

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Male Wistar rats were submitted to SE in ninenth day of life (P9) by pilocarpine injection (380 mg/kg, i.p.) - control animals received saline 0,9% (0,1 mL/ 10g). In P60 both groups were injected with JZL195 (0,01 mg/kg, i.p.) - inhibidor of FAAH and MAGL, enzimes that catalise endogenous cannabinoids agonists. After two hours, animals were submitted to behavioral tests that evaluated social memory, interest for social novelty and short-term memory (objects recognition test). Neurobiological correlation for the behavioral results was investigated by genic expression analysis of CNR1 gene (RT-PCR) and quantification of CB1 receptor (ELISA). Results of social memory test show a deficit of social investigation in control rats treated with JZL (F(1,18)=5,481; p=0,03), without affect social discrimination (F(1,18)=9,807; p=0,0058); there was no effect of JZL in experimental group (F(1,17)=2,509; n.s.). In social novelty test, JZL affected the investigation time in control group (F(1,19)=4,863; p=0,04) and the preference for investigating social novelty (t(20)=3,356; p<0,01); JZL had no effect on experimental group (F(1,19)=0,001; n.s.). In the test of objects recognition, JZL caused object discrimination deficit in control group (F(1,13)=4,955; p=0,04) and affected time investigation in experimental group (F(1,11)=5,999; p=0,03), without affect in discrimination (F(1,11)=0,860; n.s.). The analysis of total locomotion in open field showed that JZL caused hyperlocomotion specifically in control animals (F(1,24)=4,837; p=0,03); analysis of central locomotion showed that JZL affected both groups, reducing time spent in central area (F(1,24)=4,547; p=0,04). Genic expression analysis of CNR1 gene did not present any difference in mRNA expression in hippocampus, pre-frontal cortex, striatum and amygdala. CB1 quantification presented a difference in hippocampus of experimental animals (U=2000; p=0,03). Our results reinforce the idea that the animal model of rats exposed to neonatal SE is valid and relevant to the study of social motivation, compromised in ASD. Pharmacological interventions targeting CB1 receptors are a way to explore this circuitry, given the results of our behavioral tests (with specific impairment of controls on social memory and sociability tests) and the molecular differences identified in the hippocampus of experimental group. Our results suggest that the endocannabinoid system participates in the modulation of social behavior and that there is a neurobiological alteration of this circuit in ASD. / Animais expostos a status epilepticus (SE) neonatal são um modelo promissor para o estudo de sistemas cerebrais específicos envolvidos no prejuízo do comportamento social que caracteriza o transtorno do espectro autista (TEA). Animais submetidos a SE neonatal mostram, na vida adulta, comportamentos característicos do TEA, como redução do interesse por interação com novidade social, apesar de manterem funções cognitivas preservadas. Este trabalho utiliza o modelo animal submetido a SE neonatal para investigar a participação do sistema endocanabinoide na neurobiologia do TEA, considerando as evidências sobre o envolvimento desse sistema na modulação da sociabilidade. Ratos Wistar machos foram submetidos ao SE no nono dia de vida (P9) por administração intraperitoneal de pilocarpina (380 mg/kg, i.p.) - enquanto controles receberam salina 0,9% (0,1 ml/ 10g). Em P60 os animais adultos de ambos os grupos foram subdivididos em: administrados com salina 0,9% ou com o fármaco JZL195 (0,01 mg/kg, i.p.), inibidor de enzimas catalisadoras da hidrólise de endocanabinoides, agonistas endógenos dos receptores canabinoides (CB1). Após 2 horas, os animais foram avaliados em testes comportamentais de memória social, sociabilidade e memória de curto prazo. Ao fim dos testes, foram extraídos tecidos de estruturas da via mesocorticolímbica: hipocampo, córtex pré-frontal, estriado e amígdala. O material extraído foi utilizado para análise da expressão gênica do gene CNR1 (por RT-PCR) e quantificação de receptores CB1 (por ELISA). No teste de memória social, animais controle tratados com JZL, quando apresentados à novidade social, mostraram menos interesse em investigar a novidade social (F(1,18)=5,481; p=0,03), sem prejuízo da capacidade de discriminação (F(1,18)=9,807; p=0,0058); animais experimentais tratados com JZL não apresentaram diferença significativa no tempo de investigação da novidade social (F(1,17)=2,509; n.s.). O tratamento com JZL interferiu especificamente no tempo de investigação do grupo controle em todas as sessões (F(1,175)=0,6686; p<0,0001). No teste de sociabilidade, o tratamento com JZL reduziu o tempo de investigação dos animais controle (F (1,19)=4,863; p=0,04) e afetou a preferência por novidade social (t(20)=3,356; p<0,01); o JZL não afetou o tempo de investigação dos animais experimentais (F (1,19)=0,001; n.s.). No teste de reconhecimento de objetos, o tratamento com JZL afetou a memória de curto prazo de animais controle (F(1,13)=4,955; p=0,04), que não discriminaram o objeto, e reduziu o tempo de investigação nos animais experimentais (F(1,11)=5,999; p=0,03), sem afetar a discriminação (F(1,11)=0,860; n.s.). No teste de locomoção, o tratamento com JZL aumentou especificamente a locomoção total de animais controles (F(1,24)=4,837; p=0,03), não afetando de forma significativa os animais experimentais (F(1,24)=0,341; n.s.). Quanto à locomoção na zona central, o fármaco interferiu em ambos os grupos, reduzindo a permanência nas áreas centrais (F(1,24)=4,547; p=0,04). A PCR-RT não indicou diferença na expressão do RNAm do receptor CB1 nas estruturas analisadas. A quantificação por Elisa apontou menor concentração de CB1 no hipocampo de experimentais (U=2000; p=0,03). Nossos resultados reforçam a ideia de que o modelo animal de ratos expostos a SE neonatal é válido e relevante para estudo da motivação social, comprometida no TEA. Intervenções farmacológicas tendo como alvo os receptores CB1 podem ser um caminho para explorar essa circuitaria, tendo em vista os resultados de nossos testes comportamentais (com prejuízo específico dos controles nos testes de memória social e sociabilidade) e as alterações moleculares identificadas no hipocampo de experimentais. Nossos resultados sugerem que o sistema endocanabinoide participa da modulação de comportamento social e que existe alteração neurobiológica dessa circuitaria no TEA.