L'estudi està centrat en la caracterització farmacològica d'un nou fàrmac per la incontinència urinària per hiperactivitat de la bufeta, anomenada Overactive Bladder (OAB). És un problema clínic molt comú, que s'origina quan existeix una disfunció de les vies de senyalització del sistema nerviós central o perifèric, de l´uroteli, del múscle llis o altres components del teixit. Quan el control conscient del reflex parasimpàtic de la micció es alterat, apareixen els símptomes de la OAB, creant un seriós problema de salut, amb gran impacte social i psicològic. Existeixen 7 fàrmacs disponibles, antagonistes muscarínics no selectius o lleugerament selectius vers el receptor M3: oxibutinina (OXY), tolterodina (TOL), propiverina, fesoterodina, trospium, darifenacina (DAR) i solifenacina (SOL). Tots ells han demostrat eficàcia per tractar els símptomes de la OAB, però la seva farmacocinètica i perfil d'efectes secundaris fa encara necessari disposar de fàrmacs més segurs al mercat. L'objectiu d'aquest treball ha estat caracteritzar la farmacologia del SVT-40776, com un fàrmac potencialment més segur pel tractament de la OAB. Postulàvem que un antagonista muscarinic sense afinitat per el receptor M2 seria predictiu d'un perfil cardiovascular més segur. A més, volíem demostrar que un antagonisme sobre M2 no es requereix per aconseguir efectivitat dels antagonistes no selectius inhibint les contraccions colinèrgiques observades en els malalts de OAB. La afinitat i selectivitat del SVT-40776 pel receptor humà M3 va ser determinat per estudis de fixació amb [3H]NMS en membranes de cèl.lules CHO que expresaven els receptors clonats humans. SVT-40776 va mostrar tenir l'afinitat (Ki= 0.19 nM) i selectivitat superior (203-fold vs. M2) pel receptor humà M3, en comparació amb els altres antimuscarincs testats (OXY, TOL, DAR, SOL). SVT-40776 va mostrar-se com un antagonista reversible. En els estudis funcionals in vitro en teixit aïllat (detrusor de bufeta de ratolí), SVT-40776 va inhibir les contraccions induïdes per un agonista colinèrgic (carbacol, CCh), produint un desplaçament de les corbes acumulatives dosi-resposta d'aquest agonista (pA2 = 9.5). L'activitat antagonista per TOL, SOL i DAR va ser de 8.4, 8.6 i 8.7, respectivament. En preparacions d'atria (efecte mediat per M2), les corbes de CCh van ser antagonitzades per tots els compostos. El rang de potència dels antagonistes (pA2) va ser TOL (8.5), SOL (7.8), DAR (7.3) i SVT-40776 (7.3). SVT-40776 va mostrar el marge més gran de selectivitat bufeta vs. atria (x199), predient un millor perfil cardiovascular de seguretat comparat amb els altres antagonistes. En els estudis funcionals de teixit aïllat ex vivo en ratolí (obtenint el teixit 3h post-administració oral) SVT-40776 va inhibir concentració-depenent les contraccions induïdes per CCh. El pA2-ED va ser 0.72 mg/kg en bufeta i 40.3 mg/kg en atria, obtenint un marge cor vs. bufeta de 58. Això compara favorablement amb TOL (0.21), SOL (1.5) i DAR (2.4). El conill porquí va ser l'animal escollit pels estudis in vivo donat que la proporció de receptors M3:M2 (1:3) era similar a la humana (1:3) comparada amb la rata (1:9), així com per la similitud morfològica i funcional a la uretra humana. Com a conclusió general, SVT-40776 va inhibir dosi-resposta les contraccions de micció en els dos models usats, el isovolumètric i el cistomètric, sense afectar a la pressió arterial i/o a la freqüència cardíaca. Així, l'ordre de mes a menys potencia segons els resultats de fixació al receptor humà va ser SVT-40776>DAR >TOL>SOL. Pels estudis funcionals va ser SVT-40776>DAR > SOL> TOL.Així, aquest estudi mostra que SVT-40776 és l'antagonista muscarinic més potent i selectiu M3 vs. M2 descrit fins ara pel tractament de la OAB. El perfil confirma que M2 no és necessari per aconseguir modulació de la bufeta. El compost està actualment en Fase Clínica II. / The study is focused on the pharmacological characterization of a new drug forthe treatment of urgency urinary incontinence, a pathology considered to be due to a hyperactivity of the bladder and known as Overactive Bladder (OAB). This is a common clinical problem which may originate from dysfunction of the peripheral or central nervous pathways, the urotehlium, the smooth muscle and other tissue components. When conscious control of the parasympathetic micturition reflex is altered, symptoms of OAB arise, creating a serious health problem commonly giving rise to severe psychological and social problems. Worldwide, there are only seven clinically available drugs, all non-selective or poorly selective antimuscarinics, for the treatment of OAB: oxybutynin (OXY), tolterodine (TOL), propiverine, fesoterodine, trospium, darifenacin (DAR) and solifenacin (SOL). All have demonstrated efficacy for the treatment of OAB symptoms but their pharmacokinetic and adverse event profiles differ and provide the need for new, safer treatments. The main objective of this investigation was to characterize the pharmacology of SVT-40776, a novel substituted quinuclidine derivative, as a potential new drug aimed at treating OAB. We postulated that a M2 sparing muscarinic antagonist would be predictive of a safe cardiovascular profile. In addition, we wished to prove that M2 antagonism is not a requirement to achieve the effectiveness of the classical non-selective muscarinic antagonists. The affinity and selectivity of SVT-40776 for the human M3 mACh receptor subtype was determined by [3H]NMS receptor binding competition in CHO cell membranes expressing human muscarinic receptors. SVT-40776 showed the highest affinity (Ki= 0.19 nM) and selectivity (203-fold vs. M2) for the human M3 receptor subtype, in comparison with other muscarinic antagonists. SVT-40776 was a reversible antagonist. In functional studies using isolated mice bladder SVT-40776 showed the ability to induce a rightward parallel shift in the cumulative agonist concentration-response curves, obtaining a pA2 of 9.5. Antagonist activities of TOL, SOL and DAR were 8.4, 8.6 and 8.7, respectively. In isolated mice atria preparations (M2 mediated effect), CCh curves were surmountably antagonized by all the compounds. The rank order of antagonist activities (pA2) was TOL (8.5), SOL (7.8), DAR (7.3) and SVT-40776 (7.3). SVT-40776 exhibited the highest bladder vs. atria selectivity (199-fold), therefore predicting a safer cardiovascular profile than the other antagonists tested. In the ex vivo isolated tissue functional studies (obtaining the sample 3h post-oral dosing), SVT-40776 inhibited CCh-induced bladder contractions in a concentration-dependent manner after oral administration in mice. The pA2-ED was 0.72mg/kg in bladder and 40.3mg/kg in atria, giving a 58-fold ratio between muscarinic cardiac effects vs. bladder effects, which compared favorably with TOL (0.21-fold), SOL (1.5-fold) and DAR (2.4-fold). Guinea pig was used for in vivo studies, as M3:M2 receptor population proportion (1:3) was more similar to human (1:3) compared to rat (1:9) (Fetscher et al., 2002) and also due to the similarity of its urethra morphology and functionality to human urethra (Walters et al., 2006). As a general conclusion, SVT-40776 did inhibit micturition contractions in the two models used, the isovolumetric and the cystometric, without affecting arterial pressure (MAP) and/or heart rate (HR). Thus, for binding affinities the order (greater to lesser affinity) is SVT-40776>DAR>TOL>SOL, whereas for functional in vivo potency the order is SVT-40776>DAR > SOL> TOL.Therefore, the present study has shown that SVT-40776, is the most potent and selective M3 vs. M2 muscarinic receptor antagonist described so far for the treatment of overactive bladder. Its activity profile confirms the hypothesis that M2 receptor is not necessary for achieve effective bladder modulation. The compound has successfully completed Phase I clinical trials and is currently undergoing Phase II clinical trials for the treatment of overactive bladder.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença neuromuscular fatal, a mais comum das distrofias musculares, causada pela ausência da proteína distrofina, componente importante do complexo glicoproteínadistrofina, que envolve as células musculares lisas, cardíacas e esqueléticas, estabilizando a membrana dessas células durante contrações e relaxamentos. Por ser uma doença genética ligada ao cromossomo X, acomete indivíduos do sexo masculino, sendo que casos raros de meninas afetadas também são relatados. Indivíduos afetados pela DMD apresentam alterações significantes na composição corpórea, comparados com a população normal. Cães da raça golden retriever que possuem distrofia muscular (GRMD) representam o melhor modelo animal para ensaios terapêuticos na busca do tratamento da DMD, sendo esses animais fundamentais para o estudo do desenvolvimento dessa anomalia, devido ao fato de apresentarem genes e sintomas clínicos homólogos aos dos pacientes humanos. A similaridade entre as duas doenças é surpreendente, ambas são caracterizadas por precoce miopatia degenerativa, com progressiva necrose, fagocitose, deposição de cálcio e fibrose endomisial e perimisial. O foco principal deste trabalho foi esclarecer dúvidas quanto ao comportamento da musculatura lisa dos animais distróficos e portadores da GRMD, para se conhecer os efeitos da doença nesse tipo de tecido. Para avaliação da musculatura lisa uterina foram utilizados quatro úteros de cadelas golden retriever saudáveis, cinco úteros de portadoras do gene e quatro úteros de animais afetados pela GRMD. Analisando as fotomicrografias uterinas dos grupos, podemos notar que não há diferenças morfológicas através dos estudos histológicos convencionais. Porém, quando analisamos as fotomicrografias polarizadas , nota-se nas cadelas saudáveis exclusivamente colágeno do tipo III, de coloração esverdeada. Quanto às portadoras do gene da GRMD, observa-se colágeno predominantemente vermelho, do tipo I, e pouco em verde, tipo III. Fotomicrografias das fêmeas afetadas pela GRMD encontraram colágeno tipo III na parte interna do endométrio, miométrio e perimétrio, e colágeno tipo I em epitélio vascular, porém ambos em menor quantidade. É possível visualizar colágeno entre as fibras musculares através da luz polarizada. Para a avaliação da digestibilidade dos nutrientes em cães GRMD e sua capacidade absortiva, foram utilizados nove cães GRMD, sete fêmeas portadoras e dez animais saudáveis; todos receberam a mesma dieta adicionada de oxido crômico. O período experimental constou de um intervalo de 10 dias, sendo os cinco primeiros dias de adaptação e os cinco restantes de coleta de amostras. Os coeficientes de digestibilidade aparente (CDAs) obtidos pelos grupos estudados foram comparados e analisados: os resultados indicaram que os cães com GRMD avaliados não apresentaram redução do aproveitamento nutricional. Novas pesquisas que avaliem o gasto energético e composição corpórea destes animais são necessárias para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no emagrecimento e perda de peso que apresentam. Para a avaliação do tempo de trânsito gastrintestinal (TTGI) em cães golden retriever saudáveis, portadores e afetados pela distrofia muscular, foram utilizados 18 cães divididos em três grupos animais saudáveis, portadores e afetados pela GRMD, com seis cães cada. Os animais foram acondicionados em canis individuais e receberam a mesma dieta; esferas de polietileno (BIPS) impregnadas com bário foram fornecidas durante a alimentação. Cada animal recebeu 10 marcadores de tamanho grande (5 mm de diâmetro) e 30 marcadores de tamanho pequeno (1.5mm de diâmetro). Os animais foram radiografados nos momentos antes (basal) da 1ª refeição, para confirmação da ausência de conteúdo alimentar e fecal no trato gastrintestinal, e após a alimentação, em intervalos de duas horas, até que os marcadores atingissem o cólon. Resultados apontaram que os cães GRMD avaliados apresentam TTGI mais rápido quando comparados aos demais grupos. Este trabalho comprovou que a mm. lisa de cães distróficos é, de diversas maneiras, afetada pela doença, apresentando tanto alterações morfológicas como morfofuncionais. Muitos estudos nessa área são necessários para melhor compreensão dos mecanismos da enfermidade, bem como maneiras de intervenção para melhoria da qualidade de vida dos indivíduos afetados. Cães GRMD(s) são o melhor modelo animal para estudos pré-clínicos da DMD, assim esses resultados são muito relevantes para aprimoramento e melhora de manejo em biotérios que abrigam esses animais e para extrapolação de dados na própria medicina / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal neuromuscular disease, it is the most common muscular dystrophy caused by absence of dystrophin protein, an important component of the dystrophin-glycoprotein complex, involving cell membranes of smooth, cardiac and skeletal cells, stabilizing these cells during contractions and relaxations. Because it is a genetic disorder linked to the X chromosome, it affects males, with rare cases of girls affected also reported. Individuals affected by DMD show significant changes in body composition, compared with the normal population. Golden retriever dogs who have muscular dystrophy (GRMD) represent the best animal model for therapeutic trials in the treatment of DMD,; these animals are fundamental to the study of the development of this anomaly, due to the fact that they show clinical symptoms and genes homologous to the human patients. The similarity between the two diseases is staggering; both are characterized by early degenerative myopathy with progressive necrosis, phagocytosis, calcium deposition and endomysial and perimysial fibrosis. The main focus of this thesis was to answer questions about the behavior of smooth muscles of dystrophic animals and carriers of GRMD, to know the effects of the disease in this tissue type. For evaluation of uterine smooth muscle we utilized four uteri of golden retriever healthy bitches, five uteri of gene carriers and four uteri of animals affected by GRMD. Analyzing the uterine photomicrographs of the groups we note that there are no morphological differences in conventional histological studies. However, when we analyze the polarized photomicrographs, we note that in healthy bitches we can see only collagen type III of greenish color. As regards the carriers of the GRMD gene, there is predominantly red collagen , type I, and very little green, type III. Photomicrographs of females affected by GRMD found type III collagen inside the endometrium, myometrium and perimetrium and collagen type I in vascular epithelium, but both in a very little quantity. It is possible to visualize collagen between muscle fibers by polarized light. For the assessment of nutrient digestibility in dogs GRMD and its absorptive capacity, we used nine GRMD, seven carriers females and ten healthy animals and all of them received the same diet with added chromic oxide. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last ones to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in energy utilization. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last of them to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in nutritional absorption. New research to assess energy expenditure and body composition in these animals are needed to a better understanding of the mechanisms involving reduction and weight loss they present. For the assessment of gastrointestinal transit time (TTGI) in golden retriever dogs healthy carriers and affected by GRMD 18 dogs divided into three groups were used - healthy animals, carriers and affected by GRMD, with six dogs each. The animals were placed in individual cages and were fed the same diet; polyethylene spheres (BIPS) impregnated with barium were supplied during feeding. Each animal received 10 markers large size (5mm diameter) and 30 markers small size (1.5mm diameter). Radiographs were taken in the moments before (baseline) the 1 st meal, to confirm the absence of food and fecal content in the gastrointestinal tract and after feeding at two-hour intervals until markers reach the colon. Results indicated that GRMD dogs evaluated showed TTGI faster when compared to the other groups. This thesis has shown that the smooth muscles of dystrophic dogs are, in many ways, affected by the disease, with both morphological and morphofunctional alterations; many studies in this area are needed so we can better understand the mechanisms of disease, as well as ways of intervention to improve the quality of life of affected individuals. GRMD dogs are the best animal model for preclinical studies of DMD, so these results are very relevant to enhancement and improvement of management in bioteries these animals have

A crotamina, um peptídeo catiônico que possui 42 aminoácidos e 4,88 kDa, é proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus. Ela apresenta características que permitem sua forte interação com alvos moleculares e membranas biológicas e assim foi o primeiro peptídeo de veneno a ser classificado como um CPP (cell penetrating peptide), justificando seus importantes efeitos biológicos e suas diversas atividades farmacológicas. A crotamina é descrita por sua atividade miotóxica, tendo como efeito a paralisia e espasmos das patas traseiras de ratos e camundongos. Esse fenômeno é descrito por ações em canais de Na+ e/ou K+ e consequente aumento do influxo intracelular dos níveis do íon Ca2+. Estudos a descrevem como um agente despolarizante utilizando a musculatura esquelética como modelo experimental. Outra atividade descrita da crotamina é um aumento na liberação basal de acetilcolina (ACh) e dopamina no sistema nervoso central de ratos. Até o momento, pouco ou nenhum estudo foi realizado em musculatura lisa. A junção neuromuscular autônoma difere em vários aspectos importantes da já conhecida junção neuromuscular esquelética. O ducto deferente de rato (DDR), um órgão par e tubular pertencente à genitália acessória masculina, foi utilizado como modelo experimental por ser um dos órgãos periféricos mais densamente inervados pelo sistema nervoso autônomo simpático. Esse fato, o torna uma importante ferramenta para estudos que envolvam a neurotransmissão e a ação de drogas adrenérgicas. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da crotamina na contração da musculatura lisa. A crotamina foi isolada a partir do veneno de C. d. terrificus por cromatografia de exclusão molecular seguida de troca iônica. Os estudos em modelos animais foram realizados utilizando o DD (porção prostática) de ratos Wistar com 5 meses de idade entre 350 g (protocolo CEUA 1261/14). O estudo de neurotransmissão foi feito em sistema de órgão isolado (n=6) por estimulação elétrica transmural com tensão de 70V, 3ms de duração em frequências de 0,05 (30 min) e 1; 5 10 e 20Hz (30 seg). A contração isométrica foi registrada em gramas de tensão. Em todos os experimentos a crotamina (0,1;0,5 e 1g/ml) incubada 30 min antes da estimulação. O efeito máximo de contração (Emax) do componente fásico e tônico foi usado como medida. O componente pós-sináptico foi avaliado por meio de curvas dose-resposta de noradrenalina e dose única de ATP (10-3M) na presença ou ausência da crotamina. A diferença estatística foi avaliada pelo teste-t de student (P0,05). Os ensaios de estimulação elétrica de baixa frequência (0,05Hz) revelaram que a crotamina (0,1 e 0,5g/ml) promoveu uma diminuição da contração do DDR (95,7±4,6% e 85,4±5,9%, respectivamente) enquanto que na dose de 1 g/mL de crotamina este efeito não foi significativo. Na curva de freqüência observamos também com as mesmas concentrações de crotamina uma tendência à diminuição da contração fásica e tônica enquanto que a dose de 1 g/mL promoveu um aumento na contração fásica na freqüência de 20,0Hz ((3,2±0,3) em relação ao controle (2,2±0,2). O componente pós-sináptico não foi alterado pela crotamina conforme evidenciado pela curva concentração-resposta de noradrenalina e concentração única de ATP. Com base nos resultados obtidos, concluímos que a crotamina atua apenas no componente pré-sináptico da contração do DDR, provavelmente interferindo na neuroliberação de ATP e noradrenalina. Ela apresenta um efeito bifásico, dependendo da dose utilizada, inibindo ou potencializando a resposta, efeito semelhante ao da -defensinas, uma proteína cuja estrutura se assemelha bastante com a da crotamina. / Crotamin, a 4.88 kDa polypeptide composed of 42 amino acids, is derived from the venom of Crotalus durissus terrificus. It presents features that allow its strong interaction with molecular targets and biological membranes and was the first venom peptide to be classified as a CPP (cell penetrating peptide), justifying the important biological effects and different pharmacological activities of crotamine. It is described by its myotoxic activity, having the effect of paralysis and spasms of the hind legs of mice and rats. This phenomenon is described by actions on Na+ channels and / or K+ and the resulting increase in intracellular influx of Ca2+ ion levels. Studies describe crotamine as a depolarizing agent and neurotransmitter release inductor using the skeletal muscle as an experimental model. Another activity of crotamine described is an increase in the basal release of acetylcholine (ACh) and dopamine in the central nervous system of rats. To date, few or no study has been performed in smooth muscle. The autonomous neuromuscular junction differs in several important aspects of already known skeletal neuromuscular junction. The vas deferens, a pair and tubular organ belonging to the male accessory genitalia, was used as experimental model because it is one of the most densely peripheral organs innervated by the sympathetic nervous system. This fact makes it an important tool for studies involving the neurotransmission and the action of adrenergic drugs. A better understanding of crotamine mechanism of action is fundamental to the development of a pharmacological agent or a possible drug. In this context, we aim to investigate the crotamine behaviour in the contraction of the smooth muscle vas deferens through neurogenic stimulation and exogenous drugs.

Orientador: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: As células endoteliais (ECs) e células musculares lisas (AoSMCs) são os principais componentes celulares do endotélio. As interações entre estes tipos celulares desempenham funções na homeostase e na estrutura vascular. Como uma interface entre o sangue e a parede do vaso, as ECs ocupam um local único diretamente exposto ao shear stress (SS), a força mecânica de atrito lateral produzido pelo fluxo de sangue na membrana apical da célula endotelial, que pode influenciar o comportamento de ambas ECs e AoSMCs. Geralmente, AoSMCs não sofrem diretamente às forcas de cisalhamento, no entanto, estas são diretamente expostas ao fluxo sanguíneo quando ocorre alguma injúria vascular, como por exemplo em algumas lesões ateroscleróticas ou por técnicas invasivas, como a angioplastia. As forças hemodinâmicas influenciam as propriedades funcionais do endotélio, porém estas não são profundamente compreendidas quanto aos mecanismos bioquímicos de respostas de células endoteliais e de musculatura lisa. Assim, a proposta desta dissertação foi estabelecer um modelo de cultivo in vitro que mimetize as forças tensionais de cisalhamento (shear stress), buscando compreender mecanismos celulares, bioquímicos e epigenéticos. Cultura de células primárias endoteliais e de musculatura lisa humanas foram obtidas da empresa LONZA e mantidas conforme recomendações do fabricante. Estas células foram mantidas rotineiramente em condições convencionais em incubadora de CO2. Para mimetizar o fluxo sanguíneo, esta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A crotamina, um peptídeo catiônico que possui 42 aminoácidos e 4,88 kDa, é proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus. Ela apresenta características que permitem sua forte interação com alvos moleculares e membranas biológicas e assim foi o primeiro peptídeo de veneno a ser classificado como um CPP (cell penetrating peptide), justificando seus importantes efeitos biológicos e suas diversas atividades farmacológicas. A crotamina é descrita por sua atividade miotóxica, tendo como efeito a paralisia e espasmos das patas traseiras de ratos e camundongos. Esse fenômeno é descrito por ações em canais de Na+ e/ou K+ e consequente aumento do influxo intracelular dos níveis do íon Ca2+. Estudos a descrevem como um agente despolarizante utilizando a musculatura esquelética como modelo experimental. Outra atividade descrita da crotamina é um aumento na liberação basal de acetilcolina (ACh) e dopamina no sistema nervoso central de ratos. Até o momento, pouco ou nenhum estudo foi realizado em musculatura lisa. A junção neuromuscular autônoma difere em vários aspectos importantes da já conhecida junção neuromuscular esquelética. O ducto deferente de rato (DDR), um órgão par e tubular pertencente à genitália acessória masculina, foi utilizado como modelo experimental por ser um dos órgãos periféricos mais densamente inervados pelo sistema nervoso autônomo simpático. Esse fato, o torna uma importante ferramenta para estudos que envolvam a neurotransmissão e a ação de drogas adrenérgicas. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da crotamina na contração da musculatura lisa. A crotamina foi isolada a partir do veneno de C. d. terrificus por cromatografia de exclusão molecular seguida de troca iônica. Os estudos em modelos animais foram realizados utilizando o DD (porção prostática) de ratos Wistar com 5 meses de idade entre 350 g (protocolo CEUA 1261/14). O estudo de neurotransmissão foi feito em sistema de órgão isolado (n=6) por estimulação elétrica transmural com tensão de 70V, 3ms de duração em frequências de 0,05 (30 min) e 1; 5 10 e 20Hz (30 seg). A contração isométrica foi registrada em gramas de tensão. Em todos os experimentos a crotamina (0,1;0,5 e 1g/ml) incubada 30 min antes da estimulação. O efeito máximo de contração (Emax) do componente fásico e tônico foi usado como medida. O componente pós-sináptico foi avaliado por meio de curvas dose-resposta de noradrenalina e dose única de ATP (10-3M) na presença ou ausência da crotamina. A diferença estatística foi avaliada pelo teste-t de student (P0,05). Os ensaios de estimulação elétrica de baixa frequência (0,05Hz) revelaram que a crotamina (0,1 e 0,5g/ml) promoveu uma diminuição da contração do DDR (95,7±4,6% e 85,4±5,9%, respectivamente) enquanto que na dose de 1 g/mL de crotamina este efeito não foi significativo. Na curva de freqüência observamos também com as mesmas concentrações de crotamina uma tendência à diminuição da contração fásica e tônica enquanto que a dose de 1 g/mL promoveu um aumento na contração fásica na freqüência de 20,0Hz ((3,2±0,3) em relação ao controle (2,2±0,2). O componente pós-sináptico não foi alterado pela crotamina conforme evidenciado pela curva concentração-resposta de noradrenalina e concentração única de ATP. Com base nos resultados obtidos, concluímos que a crotamina atua apenas no componente pré-sináptico da contração do DDR, provavelmente interferindo na neuroliberação de ATP e noradrenalina. Ela apresenta um efeito bifásico, dependendo da dose utilizada, inibindo ou potencializando a resposta, efeito semelhante ao da -defensinas, uma proteína cuja estrutura se assemelha bastante com a da crotamina. / Crotamin, a 4.88 kDa polypeptide composed of 42 amino acids, is derived from the venom of Crotalus durissus terrificus. It presents features that allow its strong interaction with molecular targets and biological membranes and was the first venom peptide to be classified as a CPP (cell penetrating peptide), justifying the important biological effects and different pharmacological activities of crotamine. It is described by its myotoxic activity, having the effect of paralysis and spasms of the hind legs of mice and rats. This phenomenon is described by actions on Na+ channels and / or K+ and the resulting increase in intracellular influx of Ca2+ ion levels. Studies describe crotamine as a depolarizing agent and neurotransmitter release inductor using the skeletal muscle as an experimental model. Another activity of crotamine described is an increase in the basal release of acetylcholine (ACh) and dopamine in the central nervous system of rats. To date, few or no study has been performed in smooth muscle. The autonomous neuromuscular junction differs in several important aspects of already known skeletal neuromuscular junction. The vas deferens, a pair and tubular organ belonging to the male accessory genitalia, was used as experimental model because it is one of the most densely peripheral organs innervated by the sympathetic nervous system. This fact makes it an important tool for studies involving the neurotransmission and the action of adrenergic drugs. A better understanding of crotamine mechanism of action is fundamental to the development of a pharmacological agent or a possible drug. In this context, we aim to investigate the crotamine behaviour in the contraction of the smooth muscle vas deferens through neurogenic stimulation and exogenous drugs.

A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença neuromuscular fatal, a mais comum das distrofias musculares, causada pela ausência da proteína distrofina, componente importante do complexo glicoproteínadistrofina, que envolve as células musculares lisas, cardíacas e esqueléticas, estabilizando a membrana dessas células durante contrações e relaxamentos. Por ser uma doença genética ligada ao cromossomo X, acomete indivíduos do sexo masculino, sendo que casos raros de meninas afetadas também são relatados. Indivíduos afetados pela DMD apresentam alterações significantes na composição corpórea, comparados com a população normal. Cães da raça golden retriever que possuem distrofia muscular (GRMD) representam o melhor modelo animal para ensaios terapêuticos na busca do tratamento da DMD, sendo esses animais fundamentais para o estudo do desenvolvimento dessa anomalia, devido ao fato de apresentarem genes e sintomas clínicos homólogos aos dos pacientes humanos. A similaridade entre as duas doenças é surpreendente, ambas são caracterizadas por precoce miopatia degenerativa, com progressiva necrose, fagocitose, deposição de cálcio e fibrose endomisial e perimisial. O foco principal deste trabalho foi esclarecer dúvidas quanto ao comportamento da musculatura lisa dos animais distróficos e portadores da GRMD, para se conhecer os efeitos da doença nesse tipo de tecido. Para avaliação da musculatura lisa uterina foram utilizados quatro úteros de cadelas golden retriever saudáveis, cinco úteros de portadoras do gene e quatro úteros de animais afetados pela GRMD. Analisando as fotomicrografias uterinas dos grupos, podemos notar que não há diferenças morfológicas através dos estudos histológicos convencionais. Porém, quando analisamos as fotomicrografias polarizadas , nota-se nas cadelas saudáveis exclusivamente colágeno do tipo III, de coloração esverdeada. Quanto às portadoras do gene da GRMD, observa-se colágeno predominantemente vermelho, do tipo I, e pouco em verde, tipo III. Fotomicrografias das fêmeas afetadas pela GRMD encontraram colágeno tipo III na parte interna do endométrio, miométrio e perimétrio, e colágeno tipo I em epitélio vascular, porém ambos em menor quantidade. É possível visualizar colágeno entre as fibras musculares através da luz polarizada. Para a avaliação da digestibilidade dos nutrientes em cães GRMD e sua capacidade absortiva, foram utilizados nove cães GRMD, sete fêmeas portadoras e dez animais saudáveis; todos receberam a mesma dieta adicionada de oxido crômico. O período experimental constou de um intervalo de 10 dias, sendo os cinco primeiros dias de adaptação e os cinco restantes de coleta de amostras. Os coeficientes de digestibilidade aparente (CDAs) obtidos pelos grupos estudados foram comparados e analisados: os resultados indicaram que os cães com GRMD avaliados não apresentaram redução do aproveitamento nutricional. Novas pesquisas que avaliem o gasto energético e composição corpórea destes animais são necessárias para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no emagrecimento e perda de peso que apresentam. Para a avaliação do tempo de trânsito gastrintestinal (TTGI) em cães golden retriever saudáveis, portadores e afetados pela distrofia muscular, foram utilizados 18 cães divididos em três grupos animais saudáveis, portadores e afetados pela GRMD, com seis cães cada. Os animais foram acondicionados em canis individuais e receberam a mesma dieta; esferas de polietileno (BIPS) impregnadas com bário foram fornecidas durante a alimentação. Cada animal recebeu 10 marcadores de tamanho grande (5 mm de diâmetro) e 30 marcadores de tamanho pequeno (1.5mm de diâmetro). Os animais foram radiografados nos momentos antes (basal) da 1ª refeição, para confirmação da ausência de conteúdo alimentar e fecal no trato gastrintestinal, e após a alimentação, em intervalos de duas horas, até que os marcadores atingissem o cólon. Resultados apontaram que os cães GRMD avaliados apresentam TTGI mais rápido quando comparados aos demais grupos. Este trabalho comprovou que a mm. lisa de cães distróficos é, de diversas maneiras, afetada pela doença, apresentando tanto alterações morfológicas como morfofuncionais. Muitos estudos nessa área são necessários para melhor compreensão dos mecanismos da enfermidade, bem como maneiras de intervenção para melhoria da qualidade de vida dos indivíduos afetados. Cães GRMD(s) são o melhor modelo animal para estudos pré-clínicos da DMD, assim esses resultados são muito relevantes para aprimoramento e melhora de manejo em biotérios que abrigam esses animais e para extrapolação de dados na própria medicina / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal neuromuscular disease, it is the most common muscular dystrophy caused by absence of dystrophin protein, an important component of the dystrophin-glycoprotein complex, involving cell membranes of smooth, cardiac and skeletal cells, stabilizing these cells during contractions and relaxations. Because it is a genetic disorder linked to the X chromosome, it affects males, with rare cases of girls affected also reported. Individuals affected by DMD show significant changes in body composition, compared with the normal population. Golden retriever dogs who have muscular dystrophy (GRMD) represent the best animal model for therapeutic trials in the treatment of DMD,; these animals are fundamental to the study of the development of this anomaly, due to the fact that they show clinical symptoms and genes homologous to the human patients. The similarity between the two diseases is staggering; both are characterized by early degenerative myopathy with progressive necrosis, phagocytosis, calcium deposition and endomysial and perimysial fibrosis. The main focus of this thesis was to answer questions about the behavior of smooth muscles of dystrophic animals and carriers of GRMD, to know the effects of the disease in this tissue type. For evaluation of uterine smooth muscle we utilized four uteri of golden retriever healthy bitches, five uteri of gene carriers and four uteri of animals affected by GRMD. Analyzing the uterine photomicrographs of the groups we note that there are no morphological differences in conventional histological studies. However, when we analyze the polarized photomicrographs, we note that in healthy bitches we can see only collagen type III of greenish color. As regards the carriers of the GRMD gene, there is predominantly red collagen , type I, and very little green, type III. Photomicrographs of females affected by GRMD found type III collagen inside the endometrium, myometrium and perimetrium and collagen type I in vascular epithelium, but both in a very little quantity. It is possible to visualize collagen between muscle fibers by polarized light. For the assessment of nutrient digestibility in dogs GRMD and its absorptive capacity, we used nine GRMD, seven carriers females and ten healthy animals and all of them received the same diet with added chromic oxide. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last ones to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in energy utilization. The experimental period consisted of an interval of 10 days, with the first five days to adaptation and the last of them to sample collection. The apparent digestibility coefficients obtained by the groups were compared and analyzed; the results showed that dogs with GRMD evaluated showed no reduction in nutritional absorption. New research to assess energy expenditure and body composition in these animals are needed to a better understanding of the mechanisms involving reduction and weight loss they present. For the assessment of gastrointestinal transit time (TTGI) in golden retriever dogs healthy carriers and affected by GRMD 18 dogs divided into three groups were used - healthy animals, carriers and affected by GRMD, with six dogs each. The animals were placed in individual cages and were fed the same diet; polyethylene spheres (BIPS) impregnated with barium were supplied during feeding. Each animal received 10 markers large size (5mm diameter) and 30 markers small size (1.5mm diameter). Radiographs were taken in the moments before (baseline) the 1 st meal, to confirm the absence of food and fecal content in the gastrointestinal tract and after feeding at two-hour intervals until markers reach the colon. Results indicated that GRMD dogs evaluated showed TTGI faster when compared to the other groups. This thesis has shown that the smooth muscles of dystrophic dogs are, in many ways, affected by the disease, with both morphological and morphofunctional alterations; many studies in this area are needed so we can better understand the mechanisms of disease, as well as ways of intervention to improve the quality of life of affected individuals. GRMD dogs are the best animal model for preclinical studies of DMD, so these results are very relevant to enhancement and improvement of management in bioteries these animals have

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No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marnyce Lima Peres.pdf: 1565408 bytes, checksum: 32423dbf13c9685f4b72d43d9d90b030 (MD5) Previous issue date: 2012-06-29 / Não Informada / Piper aduncum (Piperaceae), native in the Amazonian Region, is known as pimenta-de-macaco and aperta ruão. It is popularly used to treat hemorrhage, hemorrhoids, diarrhea, tooth pain and inflammation. Phytochemical studies relate the isolation and identification of more than 47 compounds from P. aduncum; dilapiol (phenylpropanoid) is the main compound. However, pharmacological studies with standardized extracts and isolated compounds are scarce and there are no scientific paper showing a quantitative chemical standardization of Piper aduncum extracts. Considering these information, the goal of this project was to investigate the pharmacodynamics and the cardiovascular effects of P. aduncum standardized extracts in rodents. Plant leaves were collected at Federal University of Amazonas – UFAM. The infusion of the dried powdered leaves originated the aqueous extract (AE), which after partition in butanol yielded the butanolic fraction (BuF). AE and BuF standardized in HPLC-UV 260 nm showed 9 major peaks with characteristic retention times and peak amplitudes. BuF was purified in preparative HPLC, yielding 6 fractions (F1 to F6). Pharmacological studies showed that mice orally treated with AE (1 g/kg) did not show any different effect comparatively to the control water treated animals; BuF intraperitoneally injected (0.2 and 0.5 g/kg) caused slight sedation and quietness in the first 2 h after treatment. In anesthetized rats, i.v. injection of AE (1, 3 and 10 mg/mL) produced dose related hypertension. Previous treatment with prazosin (1 mg/kg, i.v.) inverted the AE effect to hypotension, which was blocked and reverted again to hypertension after injection of propranolol. In control conditions, adrenaline injection (ADR 0.1, 0.3 and 1.0 μg/mL) produced a biphasic effect (hypertension and hypotension), dependent on the injected dose and AE (1, 3 and 10 mg/mL) produced hypertension. After prazosin treatment, ADR and AE both produced hypotension which was reverted to hypertension after propranolol treatment. In isolated rat left atria, incubation of either AE or BuF increased the contraction force; the effect was blocked by propranolol (10-6 M), indicating a positive inotropic effect mediated by β1-adrenergic receptors. In rat isolated right atrium, AE and BuF increased the heart rate, but the Ca2+-ATPase enzyme activity in vitro was not inhibited by BuF. In rat vas deferens, BuF inhibited noradrenaline maximal contraction by 35%; EC50 was not changed, showing a non-competitive antagonistic interaction and excluding a α-adrenergic blockade by the plant extracts. Similarly, in the rat vas deferens pre-contracted with ATP, incubation of BuF inhibited the effect of ATP on purinergic P1 receptors. In electrically stimulated vas deferens, BuF inhibited the contraction amplitude by 60%, suggesting either a L-type calcium channel blockade or a local anesthetic effect on the sympathetic nerve terminals. On rat uterus cell cultures and cardiomyocytes cells, however, the calcium influx was not changed by BuF incubation. The results show that the AE of P. aduncum may produce hypertension by α1-adrenergic receptor activation, may produce hypotension by β2-adrenoceptor activation and tachycardia plus positive inotropic effect by β1-receptor activation. The data indicate that the AE may contain adrenaline, or a compound with the same pharmacological activity, which might produce vasoconstriction to interrupt bleeding, as mentioned in folk use. / Piper aduncum (Piperaceae), nativa da região Amazônica, é conhecida como pimenta-de-macaco e aperta-ruão. É utilizada popularmente no tratamento de hemorragias, hemorroidas, diarreia, dor de dente e inflamação. Estudos fitoquímicos relatam o isolamento e identificação de mais de 47 compostos de P. aduncum, sendo o dilapiol (fenilpropanoide) o principal componente. No entanto, estudos farmacológicos com extratos padronizados ou substâncias isoladas são escassos e não há relatos na literatura científica da padronização química quantitativa dos extratos de Piper aduncum estudados. Considerando essas informações, este estudo propõe a investigação científica de extratos padronizados de P. aduncum avaliando a farmacodinâmica e os efeitos desses extratos no sistema cardiovascular e na musculatura lisa. Folhas de P. aduncum foram coletadas no minicampus da Universidade Federal do Amazonas (UFAM). A infusão do pó das folhas secas em água destilada originou o extrato aquoso (EA), que após partição em n-butanol originou a fração butanólica (FBut). EA e FBut foram padronizados em CLAE – UV 260 nm obtendo-se 9 picos principais com TR e amplitudes características no espectro de referência. A FBut foi purificada em CLAE preparativa, resultando 6 frações (F1 a F6). Nos testes biológicos, camundongos tratados com o EA (1 g/kg) por via oral não apresentaram efeitos que os diferenciassem dos animais controle tratados com água. Com a injeção intraperitoneal da FBut (0,2 e 0,5 g/kg), os animais apresentaram leve diminuição da deambulação e sedação nas primeiras 2 h após a injeção da FBut. Em ratos anestesiados, a injeção endovenosa do EA (1, 3 e 10 mg/mL) produziu hipertensão proporcional às doses; este efeito não foi observado com a injeção da FBut. A administração prévia do prazosin (1 mg/kg, e.v) inverteu o efeito do EA para hipotensão, sendo novamente revertido para hipertensão na presença do propranolol. A injeção endovenosa de adrenalina (ADR 0,1; 0,3 e 1,0 μg/mL) produziu efeito bifásico (hipertensão e hipotensão) na dependência da dose. Com a injeção prévia do prazosin, a ADR e o EA produziram hipotensão, que foi revertida para hipertensão após administração de propranolol. Em átrio direito isolado de rato, EA e FBut aumentaram a frequência de batimentos. Em átrio esquerdo isolado de rato, EA e FBut aumentaram a amplitude de contração; este efeito foi bloqueado pelo propranolol (10-6 M), indicando ação inotrópica positiva mediada por receptores β1 adrenérgicos. A atividade da Ca2+-ATPase extraída de músculo esquelético de coelho não foi inibida pela FBut. Em ducto deferente de rato (DDR), a FBut inibiu a contração máxima da noradrenalina de 35% sem alterar a CE50, indicando antagonismo do tipo não-competitivo e excluindo uma ação bloqueadora α-adrenérgica. Em DDR pré-contraído com ATP, a FBut inibiu o efeito do ATP nos receptores purinérgicos P1. Em DDR estimulado eletricamente, a FBut diminuiu a amplitude das contrações de 60%, sugerindo um bloqueio de canais de cálcio do tipo L da musculatura lisa, ou uma atividade anestésica local nas terminações nervosas simpáticas. Entretanto, o influxo de cálcio através de canais tipo L em culturas de células uterinas e de cardiomiócitos de ratos não foi alterado na presença da FBut. Os resultados mostraram que o EA produz hipertensão por ativação de receptores α1-adrenérgicos, hipotensão por ativação de β2-adrenoceptores, inotropismo positivo e taquicardia por estimulação de receptores β1-adrenérgicos. Esses resultados indicam que o extrato de P. aduncum contém adrenalina, ou composto com atividade idêntica, com atividade vasoconstritora capaz de interromper um sangramento, como mencionado no uso popular.