Dans cette étude, nous avons isolé et évalué le potentiel probiotique et l’effet barrière de nouvelles souches de bactéries lactiques contre l’entérite nécrotique du poulet de chair; une infection qui cause des lésions intestinales, mais aussi qui diminue le poids des oiseaux et entrainant dans certains cas leur mort. Le recours aux antibiotiques pour prévenir cette infection, mais d’une comme facteurs de croissance est prohibé depuis 2006 en Europe, par le règlement 1831/2003/CE. Ainsi, le développement de stratégies alternatives aux antibiotiques reste un objectif louable sur les plans scientifique, industriel et sociétal. Ainsi, nous avons procédé à l’isolement et évaluation de nouvelles souches de bactéries lactiques, plus particulièrement de lactobacilles, comme flores probiotiques et potentiellement protectrices contre l’entérite nécrotique. Les bactéries lactiques sont capables de produire plusieurs molécules antagonistes comme l’acide lactique, ou encore les acides gras et phénylactique, le peroxyde d’hydrogène, le diacétyle et les bactériocines. Outre cet arsenal, les bactéries lactiques bénéficient du double statut GRAS/QPS (innocuité et sécurité des souches), et sont pour autant utilisables dans divers secteurs de la biotechnologie et de l’agroalimentaire. Les bactéries lactiques sont capables de former des biofilms et d’exercer de nombreuses fonctions biologiques de grande importante, les rendant ainsi comme microorganismes de choix pour des applications probiotiques. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets barrière et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques appartenant au genre Lactobacillus, et plus particulièrement aux espèces Lactobacillus reuteri et Lb. salivarius. Ces souches ont été isolées de caeca de poulets sains élevés dans la région des Hauts-de-France. Les résultats que nous avons obtenus ont permis de mettre en évidence les activités antagonistes de ces nouvelles souches, notamment contre Clostridium perfringens; la bactérie qui est responsable de l’entérite nécrotique. Cet antagonisme est d’abord mis en évidence in vitro sur un milieu gélosé. Il est attribué à la production d’acide lactique, comme principale molécule antagoniste. Les propriétés d’agrégation, d’adhésion et de formation de biofilms de ces nouvelles souches et leur résistance aux conditions gastro-intestinales de poulets reconstituées ont également été étudiées et établies dans le cadre de cette thèse. Les souches que nous avons nouvellement isolées et sélectionnées se sont avérées être non-hémolytiques. Par ailleurs, les propriétés de résistance au procédé de lyophilisation, à la conservation ainsi que la viabilité aux conditions d’administration aux animaux ont été également élucidées. Ces critères technologiques nous ont permis d’établir la faisabilité de les produire à l’échelle avant une possible commercialisation. Les génomes des souches ayant donné des activités les plus intéressantes sur le plan de l’antagonisme et qualification probiotique ont été séquencés. Il faut noter que la validation de ces activités et plus particulièrement de l’effet anti-C. perfringens a été réalisée avec succès in vivo sur des modèles de poulets. / Here, we propose the use as probiotic novel lactic acid bacteria (LAB), mainly lactobacilli for their anti-Clostridium perfringens properties. This Gram-positive, spore-forming and harmful bacterium is responsible for necrotic enteritis in broilers. This infection is characterized by severe intestinal lesions, bird weight loss and ultimately bird death. The use of antibiotics to prevent necrotic enteritis or just as growth promotors has been banned in Europe since 2006 based on the EU regulation 1831/2003/CE. Antibiotics replacement in the animal production is expected to drive fruitful and intensive projects. In this frame, we have successfully isolated novel lactobacilli strains endowed with anti-C. perfringens activity and additional probiotic features. LAB are recognized as GRAS/QPS organisms and can offer advantages for industrial applications. In this study, LAB strains were isolated from healthy chicken caeca. These LABs, mainly those belonging to Lactobacillus reuteri and Lb. salivarius species have revealed highly capabilities to inhibit in vitro C. perfringens through lactic acid production. Besides lactic acid production, these novel strains were able to form biofilms and display high aggregation and adhesion scores. These non-hemolytic strains were also studied for their resistance to simulated gastro-intestinal conditions. Technological properties as resistance to freeze-drying process, conservation and viability were determined and allowed to shape and predict scale production of these novel LAB strains. Genomes of Lactobacilli with relevant fulfilling antagonistic activities and probiotic grade were sequenced and analyzed. To conclude this study, in vivo assays were successfully tested in challenged birds. Interestingly and remarkably, these strains allowed birds to gain weight and avoid lesions caused ascribed to C. perfringens.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Travail en codirection avec M. Frédéric Raymond / Avec la présente augmentation de la résistance aux antibiotiques et l’inquiétude des consommateurs, de nouvelles alternatives sont nécessaires afin de contrôler l’entérite nécrotique (EN), une maladie causant des millions de dollars en pertes économiques pour l’industrie de la volaille mondialement. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par une bactérie pour tuer ou inhiber la croissance d’autres compétiteurs bactériens. La perfrine est la seule bactériocine reportée associée aux souches pathogènes de Clostridium perfringens, l’agent causal de l’EN. Les objectifs de cette étude étaient de détecter les souches commensales de Clostridium perfringens possédant une activité antimicrobienne contre des souches pathogènes de C. perfringens et d’identifier et caractériser les bactériocines produites. Les souches commensales de C. perfringens ont été sélectionnées à partir de notre banque de souches. L’activité antimicrobienne de ces souches a été testée contre des souches pathogènes de C. perfringens en utilisant la méthode d’inhibition sur gélose. Une souche commensale active démontrant une activité antimicrobienne a été cultivée et ses bactériocines ont été partiellement purifiées grâce à la précipitation au sulfate d’ammonium et par chromatographie (HPLC). À la suite de chaque chromatographie, l’activité antimicrobienne des fractions a été vérifiée en utilisant la méthode décrite précédemment afin de choisir les fractions contenant les bactériocines. La susceptibilité enzymatique, la stabilité à la chaleur et au pH et le poids moléculaire estimé des bactériocines ont été caractérisés. Les bactériocines étudiées étaient sensibles à la protéinase K, thermolabiles, stables à pH entre 4 et 8 et leur poids moléculaire étaient supérieur à 30 kDa. Le génome de la souche CP1676 a été séquencé et des analyses bio-informatiques ont été réalisées. Nous avons trouvé 28 séquences de bactériocines potentielles, mais seulement 4 d’entre elles semblaient être prometteuses. Dans cette étude, des souches commensales de C. perfringens produisant des bactériocines actives contre des souches pathogènes ont été identifiées. Ces bactériocines pourraient devenir une alternative intéressante aux antibiotiques afin de contrôler l’entérite nécrotique, mais davantage d’information est nécessaire. / With the current increase in antimicrobial resistance and consumers’ concern, new alternatives are needed to control necrotic enteritis (NE), a disease that causes billions of dollars in economic losses to the poultry industry worldwide. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by bacteria to kill or inhibit the growth of other bacterial competitors. Perfrin is the only reported bacteriocin associated with pathogenic strains of Clostridium perfringens, the causal agent of NE. The aims of this study were to screen for commensal Clostridium perfringens strains with an antimicrobial activity against C. perfringens pathogenic strains and to identify and characterize the produced bacteriocins. Commensal C. perfringens strains were selected from our bacterial collection. Antimicrobial activity of those selected strains was tested against C. perfringens pathogenic strains using the agar spot test method. An active commensal strain showing antimicrobial activity was cultured and its bacteriocins were partially purified using the ammonium sulfate precipitation method and HPLC. After each chromatography, antimicrobial activity of fractions was tested using the method described above to choose fractions containing bacteriocins. Enzyme susceptibility, heat and pH stability and the estimated molecular weight of the bacteriocins were characterized. The studied bacteriocins were sensitive to proteinase K, thermolabile, stable at pH between 4 and 8 and their molecular weight higher than 30 kDa. CP1676 strain genome was sequenced and bioinformatics were performed. We found 28 potential bacteriocin sequences, but 4 of them seemed to be promising. In this study, commensal C. perfringens strains producing bacteriocins active against pathogenic strains have been identified. These bacteriocins could be an interesting alternative to antibiotics for the control of necrotic enteritis but further data is still needed.

L'angiodermite nécrotique ou "Hypertensive Leg Ulcer" (HLU) est un ulcère de jambe inflammatoire de traitement difficile, associé à une hypertension artérielle chronique. La douleur est très importante et nécessite l'utilisation de la morphine pour soulager les patients. Notre objectif était d'analyser les caractéristiques de l'inflammation et d'étudier son implication dans la physiopathologie de la nécrose cutanée. La peau inflammatoire est le siège d'un infiltrat composé de macrophages et de lymphocytes. L'épiderme et les cellules vasculaires lisses des microvaisseaux présentent des troubles de la différenciation et une importante prolifération. Nous observé une forte augmentation des transcrits de l'interleukine 1β (IL-1β), de l'IL-6 et de l'Oncostatin M (OSM), qui sont exprimées par les macrophages.Les kératinocytes humains in vitro et in vivo chez la souris montrent un phénotype semblable lorsqu'ils sont exposés à ces cytokines.Comparée à la peau inflammatoire et à la peau saine, la peau en périphérie de l'inflammation est douloureuse et présente des altérations histologiques intermédiaires. On observe une légère augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM. D'autre part, la consommation de morphine est associée au niveau d'expression de l'OSM et l'inflammation systémique reflète la douleur ressentie par le patient. Ces éléments sont en faveur d'une implication des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM dans la physiopathologie de la douleur et de la nécrose dans l'HLU. Le cercle vicieux pourrait être bloqué par l'utilisation des biothérapies anticytokines, ce qui met en avant de nouvelles cibles thérapeutiques. / Hypertensive Leg Ulcer (HLU) is an inflammatory skin lesion associated to chronic high blood pressure. The ulcer is painful requiring morphine to relieve patients. Our objective was to analyze the characteristics of the inflammation and to study it’s implication in pathogenesis of skin necrosis. Inflammatory skin is infiltrated by macrophages and lymphocytes. Keratinocytes and vascular smooth muscle cells of microvessels display an alteration of differentiation and an important proliferation. We studied the expression of cytokines associated to skin inflammation and we observed a strong augmentation of the transcripts for the interleukin 1β (IL-1β), the IL-6 and the Oncostatin M (OSM); which are expressed by the macrophages. The reconstructed human epidermis in vitro exposed to these cytokines showed a similar phenotype of the histological studies in human. At least, injection of these cytokines to the mouse produces an inflammation and an alteration of the epidermis comparable to HLU.Compared to the inflammatory skin and to the healthy skin, the skin in periphery of the inflammation is painful and presents intermediate histological alterations. We observed a slight augmentation of the inflammatory cytokines IL-1β and OSM. On the other hand, the consumption of morphine is associated with the level of expression of the OSM and systemic inflammation reflects the pain felt by the patient.The present evidence indicates an involvement of inflammatory cytokines IL-1β and OSM in the pathogenesis of pain and skin necrosis in the HLU. The vicious circle may be blocked by the use of biotherapies against inflammatory cytokines, which highlights new therapeutic targets.

L’entérite nécrotique aviaire causée par Clostridium perfringens est une maladie économiquement dévastatrice et celle-ci est en émergence dans les troupeaux de poulets de chair éliminant l’usage des antibiotiques. À ce jour, aucune alternative en élevage ne permet de prévenir efficacement la maladie et un contrôle par une stratégie vaccinale serait des plus prisé. Une approche par génomique comparative jumelée à la vaccinologie réverse soustractive et comparative identifiant des protéines bactériennes de surface immunogènes figure parmi les approches méthodologiques des plus prometteuses pour le développement rapide d’un vaccin efficace. Une étude génomique comparative réalisée sur 48 souches de C. perfringens provenant de poulets de chair en santé ou affectés par l’entérite nécrotique a permis d’établir que les génomes analysés étaient composés de 155 700 protéines distinctes, où 13% étaient extracellulaires, 65% cytoplasmiques et 22% membranaires. L’évaluation du pouvoir immunogène de ces protéines à l’aide de l’outil de prédiction VaxiJen v.2.0 a permis d’identifier 4 catégories de scores pour les protéines identifiées, allant de 0,5 (seuil minimal recommandé) à 1,5. Les protéines présentant les scores les plus élevés ont été majoritairement associées à des localisations extracellulaires. La combinaison du score d’immunogénicité et de la localisation cellulaire des protéines analysées a mené à la sélection de 12 protéines candidates vaccinales, la plupart d’entre elles étant de fonction hypothétique. Une description plus approfondie de ces protéines permettra de mieux définir leur fonction, d’évaluer leur potentiel antigénique réel en caractérisant leur interaction avec le système immunitaire de la volaille et ultimement, d’évaluer leur rôle probable dans la pathogénie de l’entérite nécrotique. / Avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens is a disease with a major economical impact, generating losses up to 6 billion dollars for the poultry industry worldwide. This disease appears in broiler chicken flocks that no longer employ the use of antibiotics. To date, no alternative method allows for the efficient prevention of necrotic enteritis (NE) and a control by a vaccinal strategy would be mostly prized. A comparative genomics approach as well as comparative and subtractive reverse vaccinology identifying immunogenic bacterial surface proteins is one of the most promising methodologies for the rapid development of an efficient vaccine. A comparative genomic study was performed on 48 C. perfringens strains isolated from healthy broiler chickens and from broilers affected by necrotic enteritis. From this study, it was established that the genomes analyzed were composed of 155 700 distinct proteins where 13% were predicted to have an extracellular expression, 65% at the cytoplasma level and 22% within the plasma membrane. The evaluation of the immunogenic potential of these proteins was established with the prediction software VaxiJen v2.0 for which a 0.5 threshold score allowed for the identification of four score categories among the identified proteins, from 0.5 to 1.5. For the most part, proteins with the highest scores were associated with an extracellular localisation. The combination of the immunogenicity score and localisation of the analysed proteins led to the selection of 12 vaccinal candidate proteins that were mostly identified as hypothetical. A more in-depth description of these proteins would allow the assessment of their function, the evaluation of their true immunogenic potential by characterizing their interaction with the avian immune system and ultimately, evaluate their probable role in the pathogenesis of necrotic enteritis.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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